全 文 ：黄槿内生真菌的次级代谢产物
及其生物活性研究△
①
李丹，朱天骄，顾谦群，李德海＊
（教育部海洋药物重点实验室，中国海洋大学医药学院，山东 青岛，２６６００３）
摘　要：目的 对１株分离自广西红树林植物黄槿（Ｈｉｂｉｓｃｕｓ　ｔｉｌｉａｃｅｕｓ）的内生真菌Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍｓｐ．ＬＤ－６８的抗
肿瘤活性成分进行研究。方法 采用溶剂萃取、柱色谱层析及制备 ＨＰＬＣ等方法对菌株发酵产物进行活性追
踪分离，通过理化性质及波谱学手段进行化学结构鉴定，以ＳＲＢ和 ＭＴＴ法评价化合物的抗肿瘤活性。结果
从中分离得到５个弯孢霉菌素类化合物，其结构分别鉴定为ｃｕｒｖｕｌａｒｉｎ（１）、ｄｅｈｙｄｒｏｃｕｒｖｕｌａｒｉｎ（２）、１１－β－Ｈｙ－
ｄｒｏｘｙ－１２－Ｏｘｏｃｕｒｖｕｌａｒｉｎ（３）、１１－β－Ｈｙｄｒｏｘｙｃｕｒｖｕｌａｒｉｎ（４）、１１－α－Ｈｙｄｒｏｘｙｃｕｒｖｕｌａｒｉｎ（５）。化合物１～５对 Ａ５４９、
ｈｅｌａ、ＢＥＬ－７４０２、Ｋ５６２　４种人肿瘤细胞株具有不同程度的抑制作用，其中化合物２、３、４、５对ｈｅｌａ细胞具有较
好的抗肿瘤细胞活性，ＩＣ５０分别为３．９９、７．７５、１０．００、５．１０μｍｏｌ·Ｌ
－１。结论 首次测定了化合物３～５对
Ａ５４９、ｈｅｌａ、ＢＥＬ－７４０２、Ｋ５６２　４种肿瘤细胞系的细胞毒活性，其中对ｈｅｌａ细胞显示出较高的抑制率。
关键词：红树林内生真菌；Ｈｉｂｉｓｃｕｓ　ｔｉｌｉａｃｅｕｓ；Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍｓｐ．；弯孢霉菌素；抗肿瘤
中图分类号：Ｒ９３１　　　文献标识码：Ａ　　　文章编号：１００２－３４６１（２０１２）０６－００１７－０６
Ｓｅｃｏｎｄａｒｙ　ｍｅｔａｂｏｌｉｔｅｓ　ａｎｄ　ｔｈｅｉｒ　ｂｉｏａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ　ｏｆ　Ｈｉｂｉｓｃｕｓ　ｔｉｌｉａｃｅｕｓ　Ｌ．
ｅｎｄｏｐｈｙｔｉｃ　ｆｕｎｇｉ
ＬＩ　Ｄａｎ，ＺＨＵ　Ｔｉａｎ－ｊｉａｏ，ＧＵ　Ｑｉａｎ－ｑｕｎ，ＬＩ　Ｄｅ－ｈａｉ＊
（Ｋｅｙ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　ｏｆ　Ｍａｒｉｎｅ　Ｄｒｕｇｓ，Ｃｈｉｎｅｓｅ　Ｍｉｎｉｓｔｒｙ　ｏｆ　Ｅｄｕｃａｔｉｏｎ，Ｓｃｈｏｏｌ　ｏｆ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ　ａｎｄ　Ｐｈａｒｍａｃｙ，
Ｏｃｅａｎ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｏｆ　Ｃｈｉｎａ，Ｑｉｎｇｄａｏ　２６６００３，Ｐ．Ｒ．Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ　Ｔｏ　ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅ　ｔｈｅ　ａｎｔｉｔｕｍｏｒ　ｂｉｏａｃｔｉｖｅ　ｉｎｇｒｅｄｉｅｎｔ　ｏｆ　ａ　ｅｎｄｏｐｈｙｔｉｃ　ｆｕｎｇｕｓ　Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ
ｓｐ．ＬＤ－６８ｉｓｏｌａｔｅｄ　ｆｒｏｍ　Ｇｕａｎｇ　Ｘｉ　ｍａｎｇｒｏｖｅ　ｐｌａｎｔ　Ｈｉｂｉｓｃｕｓ　ｔｉｌｉａｃｅｕｓ　Ｌ．．Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｔｈｅ　ｅｘｔｒａｃｔ　ｏｆ　ｔｈｅ
ｆｕｎｇｕｓ　ｗａｓ　ｐｕｒｉｆｉｅｄ　ｂｙ　ｓｏｌｖｅｎｔ　ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ，ｃｏｌｕｍｎ　ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ　ａｎｄ　ｐｒｅｐａｒａｔｉｖｅ　ＨＰＬＣ　ｇｕｉｄｅｄ　ｂｙ　ｔｈｅ
ｂｉｏａｓｓａｙ　ｒｅｓｕｌｔｓ．Ｔｈｅｉｒ　ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ　ｗｅｒｅ　ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ　ｂｙ　ｐｈｙｓｉｃｏｃｈｅｍｉｃａｌ　ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ　ａｎｄ　ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｉｃ　ａ－
ｎａｌｙｓｉｓ．Ｔｈｅ　ａｎｔｉｔｕｍｏｒ　ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ　ｗｅｒｅ　ｅｖａｌｕａｔｅｄ　ｂｙ　ＳＲＢ　ｍｅｔｈｏｄ　ａｎｄ　ＭＴＴ　ｍｅｔｈｏｄ．Ｒｅｓｕｌｔｓ　Ｆｉｖｅ　ｃｏｍ－
ｐｏｕｎｄｓ　ｗｅｒｅ　ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ　ａｓ　ｃｕｒｖｕｌａｒｉｎ（１），ｄｅｈｙｄｒｏｃｕｒｖｕｌａｒｉｎ（２），１１－β－Ｈｙｄｒｏｘｙ－１２－Ｏｘｏｃｕｒｖｕｌａｒｉｎ（３），
１１－β－Ｈｙｄｒｏｘｙｃｕｒｖｕｌａｒｉｎ（４），１１－α－Ｈｙｄｒｏｘｙｃｕｒｖｕｌａｒｉｎ（５）．Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ　１～５　ｓｈｏｗｅｄ　ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ　ａｃｔｉｖｉ－
ｔｉｅｓ　ｔｏ　ｆｏｕｒ　ｋｉｎｄｓ　ｏｆ　ｈｕｍａｎ　ｔｕｍｏｒ　ｃｅｌ　ｌｉｎｅｓ　ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ　Ａ５４９，ｈｅｌａ，ＢＥＬ－７４０２ａｎｄ　Ｋ５６２，ａｎｄ　ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ
２～５　ｈａｖｅ　ｍｏｒｅ　ｐｏｔｅｎｔｉａｌ　ａｎｔｉｔｕｍｏｒ　ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ　ａｇａｉｎｓｔ　ｈｅｌａ　ｃｅｌｓ，ｗｉｔｈ　ＩＣ５０ｖａｌｕｅｓ　ｏｆ　３．９９，７．７５，１０．００
ａｎｄ　５．１０μＭ，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ　Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ　３～５　ａｒｅ　ｒｅｐｏｒｔｅｄ　ｔｈｅｉｒ　ｃｙｔｏｘｉｃ　ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ　ａｇａｉｎｓｔ　ｔｈｅ
ｆｏｕｒ　ｋｉｎｄｓ　ｏｆ　ｈｕｍａｎ　ｔｕｍｏｒ　ｃｅｌ　ｌｉｎｅｓ，Ａ５４９，ｈｅｌａ，ＢＥＬ－７４０２ａｎｄ　Ｋ５６２ｆｏｒ　ｔｈｅ　ｆｉｒｓｔ　ｔｉｍｅ，ａｎｄ　ｅｘｈｉｂｉｔｉｎｇ
７１
中国海洋药物杂志２０１２年１２月第３１卷第６期 Ｃｈｉｎ　Ｊ　Ｍａｒ　Ｄｒｕｇｓ，２０１２Ｄｅｃｅｍｂｅｒ，Ｖｏｌ．３１Ｎｏ．６
①△基金项目：高等学校博士学科点专项科研基金（２０１００１３２１２００２６）；山东省优秀中青年科学家科研奖励基金计划（ＢＳ２０１０ＨＺ０２７）；
中国海洋大学青年英才工程科研支持经费资助
　作者简介：李丹（１９８８－），女，硕士研究生，主要从事海洋微生物活性次级代谢产物研究。
＊通讯作者：李德海，男，副教授 Ｔｅｌ：０５３２－８２０３１６１９；ｆａｘ：０５３２－８２０３３０５４；Ｅ－ｍａｉｌ：ｄｅｈａｉｌｉ＠ｏｕｃ．ｅｄｕ．ｃｎ
DOI:10.13400/j.cnki.cjmd.2012.06.004
ｍｏｒｅ　ｓｅｌｅｃｔｉｖｉｔｉｅｓ　ｔｏ　ｈｅｌａ　ｃｅｌ　ｌｉｎｅ．
Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ：ｍａｎｇｒｏｖｅ　ｐｌａｎｔ　ｅｎｄｏｐｈｙｔｉｃ　ｆｕｎｇｉ；Ｈｉｂｉｓｃｕｓ　ｔｉｌｉａｃｅｕｓ；Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍｓｐ．；ｃｕｒｖｕｌａｒｉｎ；ａｎｔｉｔｕ－
ｍｏｒ
　　红树林是生长在热带和亚热带潮间带的海洋
木本植物群落，素有“海上森林”之美称，是世界上
珍稀濒危的植物，具有很高的观赏和科考价值，承
含着丰富而多样的微生物。由于红树林生态环境
有着不同于海洋和陆地的性质，赋予了红树林内
生微生物产生不同于其他生态系统的活性物质的
潜在可能性，其中对于内生真菌的研究尤为引人
注目［１－４］。目前已分离鉴定的红树林真菌超过２８０
种，成为海洋真菌的第二大类群［５］。植物内生真
菌（Ｅｎｄｏｐｈｙｔｉｃ　ｆｕｎｇｉ）一般是指其整个生活史或
生活史的某个阶段生活在健康植物的组织中，形
成不明显病症的一类真菌。一些生长在植物体特
殊环境中的真菌，不但对促进宿主植物的生长发
育、增强抗逆性起到重要作用［６］，而且还能产生与
宿主相同或相似的生物活性物质［７］。近年已从红
树林真菌中发现了具有药用价值的新型化合物如
ａｓｐｅｒｇｉｏｌｉｄｅｓ　Ａ－Ｄ［８－９］、ＣＡ１１８９［１０］、ｐｅｎｉｃｉｎｏｌｉｎｅ［１１］、
ｓｅｃａｌｏｎｉｃ　ａｃｉｄ　Ａ［１２］、ｔａｌａｐｅｒｏｘｉｄｅｓ　Ｂ和ｔａｌａｐｅｒｏｘ－
ｉｄｅｓ　Ｄ［１３］等。
本文对广西红树林内生真菌活性代谢产物的
研究工作中，分离出多种具有抗肿瘤、抗病毒等活
性的新颖结构［１４－１８］。近期，作者针对采集自广西
半红树植物如杨叶肖槿、黄槿、海芒果等１２个样
品中，共分离纯化菌株８６株。其中１株从黄槿
（Ｈｉｂｉｓｃｕｓ　ｔｉｌｉａｃｅｕｓ）中分离到的内生真菌Ｐｅｎｉ－
ｃｉｌｌｉｕｍｓｐ．ＬＤ－６８，其乙酸乙酯提取物对Ｐ３８８细
胞表现出了明显的细胞毒活性。对该菌株的发酵
产物进行活性追踪分离，共得到５个弯孢霉菌素
类化合物，分别为ｃｕｒｖｕｌａｒｉｎ（１）、ｄｅｈｙｄｒｏｃｕｒｖｕｌａ－
ｒｉｎ （２）、１１－β－Ｈｙｄｒｏｘｙｃｕｒｖｕｌａｒｉｎ （３）、１１－α－
Ｈｙｄｒｏｘｙｃｕｒｖｕｌａｒｉｎ （４）、１１－β－Ｈｙｄｒｏｘｙ－１２－Ｏｘ－
ｏｃｕｒｖｕｌａｒｉｎ（５）（见图１）。本文对ＬＤ－６８菌株活性
次级代谢产物的提取分离，结构鉴定和生物活性
工作进行报道。
１　实验部分
１．１　实验仪器和试剂
核磁共振仪（日本Ｊｅｏｌ　ＪＮＭ－ＥＣＰ６００型）；紫
外光谱仪（Ｂｅｃｋｍａｎ　ＤＵＲ６４０型）；质谱仪（Ｍａｒｉ－
ｎｅｒ　ＡＰＩ－ＴＯＦ型）；旋光仪（Ａｔａｇｏ　Ｃｏ．Ｌｔｄ　Ｐｏｌａｘ
–Ｌ型）；制备高效液相色谱采用 Ｗａｔｅｒｓ公司产
品（Ｗａｔｅｒｓ　６００泵，Ｗａｔｅｒｓ　９９６二极管阵列检测
器，Ｍｉｌｅｎｎｉｕｍ３２工作站，Ｃａｐｃｅｌ　Ｐａｋ　Ｃ１８ 柱：
５μｍ，４．６ｍｍ×２５０ｍｍ ）；Ｅｙｅｌａｎ－Ｎ型旋转薄膜
蒸发仪（Ｔｏｋｙｏ　Ｒｉｋａｋｉｋａｉ公司）；摇床ＴＣ－Ｃ－１００Ｒ
（日本高崎科学器械株式会社）；洁净工作台（苏净
集团安泰公司）；Ｓｅｐｈａｄｅｘ　ＬＨ－２０（Ｐｈａｒｍａｃｉａ公
司）；硅胶 Ｈ （青岛海洋化工厂）。胎牛血清（ＦＢｓ）
和ＲＰ－ＭＩ－１６４０细胞培养基分别为 Ｈｙｃｌｏｎｅ公司
和Ｇｉｂｃｏ　ＢＲＬ公司产品；磺酰罗丹明 Ｂ （ＳＲＢ）
（Ｓｉｇｍａ公司）。常规提取分离用甲醇、丙酮、乙酸
乙酯、石油醚、氯仿等均为工业用化学纯产品，重
蒸后使用，液相色谱甲醇为色谱纯。
１．２　菌株的分离
１．２．１　样品来源
供分离的样品来自广西红树林区域的杨叶肖
槿、黄槿、海芒果等植物的叶、枝干。
１．２．２　培养基配方
ＰＤＡ培养基组成：葡萄糖２０ｇ，琼脂２０ｇ，氯霉
素１ｇ，土豆２００ｇ，陈海水５００ｍＬ，淡水５００ｍＬ，
ｐＨ＝６．０。
沙式培养基：蛋白胨１０ｇ，ＮａＣｌ　５ｇ，葡萄糖
４０ｇ，淡水１０００ｍＬ，ｐＨ＝５．６。
马丁式培养基：葡萄糖１０ｇ，蛋白胨５ｇ，ＫＨ２
ＰＯ４１ｇ，ＭｇＳＯ４·７Ｈ２Ｏ　０．５ｇ，１／３０００的孟加拉
红１００ｍＬ，琼脂１５～２０ｇ，陈海水５００ｍＬ，淡水
５００ｍＬ。
１．２．３　分离方法
无菌状态下取植物样品，用无菌水冲洗２～３
次，７５％酒精冲洗３次，无菌水冲洗２～３次。将
组织切块，置于匀浆器中，捣碎至黏稠状，加入无
菌水搅匀，并吸取一定量至培养基中均匀涂布，
２８℃恒温培养［１９］。待菌丝长出后，挑取尖端菌丝
移至新的培养基上，纯化后保存备用。
１．３　活性初筛及生物活性测试
从固体斜面培养基上取适量接种到内装
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Ｃｈｉｎ　Ｊ　Ｍａｒ　Ｄｒｕｇｓ，２０１２Ｄｅｃｅｍｂｅｒ，Ｖｏｌ．３１Ｎｏ．６ 中国海洋药物杂志２０１２年１２月第３１卷第６期
１０ｍＬ发酵培养基的试管中，在２８℃、２４０ｒ／ｍｉｎ
的条件下于试管摇床中培养９ｄ。在发酵物中加
入乙酸乙酯１０ｍＬ，将菌体超声破碎，静置过夜，
取上清液真空低温浓缩至干。干燥物除盐后称重
加适量甲醇溶解，供测试活性和ＴＬＣ分析。采用
丽丝胺罗丹明Ｂ（ＳＲＢ）法进行生物活性测试［２０］。
１．４　发酵培养及提取
菌株Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍｓｐ．ＬＤ－６８发酵条件为：静
置培养，ＰＤＢ培养基（培养基配方：葡萄糖２０ｇ，氯
霉素１ｇ，土豆２００ｇ，陈海水５００ｍＬ，淡水５００ｍＬ，
ｐＨ＝６．０）。保藏菌株经复苏后，挑取尖端菌丝至
装液量为３００ｍＬ／１０００ｍＬ的ＰＤＡ培养液中，共
培养３０Ｌ，发酵温度２８℃，发酵时间２５ｄ。将菌株
的发酵培养物（３０Ｌ）抽滤，分为发酵液和菌丝体
２个部分。发酵液用乙酸乙酯萃取，菌丝体用
８０％丙酮水溶液超声破碎提取，减压浓缩至不含
丙酮后，用乙酸乙酯萃取。菌丝体与发酵液的乙
酸乙酯萃取液合并，减压浓缩得萃取物１０ｇ。
１．５　化合物分离纯化
将菌株发酵培养物的粗浸膏（１０ｇ）进行减压
硅胶柱层析（１００～２００目），以石油醚－丙酮，氯仿－
甲醇为溶剂进行梯度洗脱，分为３个组分（Ｆｒ．１～
３），组分Ｆｒ．１以二氯甲烷进行重结晶，得到化合
物１（１００ｍｇ）。组分Ｆｒ．２经凝胶柱色谱（Ｓｅｐｈａ－
ｄｅｘ　ＬＨ－２０，甲醇）分离，高效液相色谱分离，得到
化合物２（２０ｍｇ）和化合物３（９ｍｇ）。组分Ｆｒ．３
经凝胶柱色谱 （Ｓｅｐｈａｄｅｘ　ＬＨ－２０，二氯甲烷：
甲醇＝１∶１）、中压色谱、高效液相色谱分离，得到
化合物４（２０ｍｇ）和化合物５（２１ｍｇ）。
２　结果与讨论
２．１　目标菌株确定
ＰＤＡ培养基、沙式培养基、马丁式培养基共分
离得到植物共生真菌８６株，以小鼠白血病细胞株
Ｐ３８８通过ＳＲＢ法初筛，获得活性菌株４８株，其中
ＬＤ－６８发酵产物的乙酸乙酯提取物在１００μｇ·
ｍＬ－１对小鼠白血病Ｐ３８８的抑制率为３８．６２％，
其ＨＰＬＣ指纹图谱显示代谢产物中具有系列相似
紫外吸收（２５８ｎｍ，２９０ｎｍ）化合物。
２．２　化合物结构鉴定
图１　化合物１～５的结构
Ｆｉｇ．１　Ｔｈｅ　ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ　ｏｆ　ｃｏｍｐｏｕｎｄ　１～５
　　化合物１：淡黄色无定形固体，［α］２０Ｄ ＝ －４７．７°
（ｃ＝０．１，ＭｅＯＨ），ＥＳＩ－ＭＳ在ｍ／ｚ２９３．２处给出
分子离子峰［Ｍ＋Ｈ］＋，ｍ／ｚ　３１５．２处给出［Ｍ＋
Ｎａ］＋峰，提示该化合物相对分子质量为２９２，结
合１　Ｈ谱、１３　Ｃ谱和 ＤＥＰＴ谱提示其分子式为Ｃ１６
Ｈ２０Ｏ５。１　Ｈ　ＮＭＲ （６００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ６）给出１２
个氢信号，包括２个活泼氢信号［δ：９．９３（１Ｈ，ｓ，
ＯＨ），９．７５（１Ｈ，ｓ，ＯＨ）］，２个间位芳香氢信号
［δ：６．２７（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝２．２Ｈｚ，Ｈ－６），６．１７（１Ｈ，
ｄ，Ｊ＝２．２Ｈｚ，Ｈ－４）］，１个连氧的次甲基信号［δ：
４．８３（１Ｈ，ｍ，Ｈ－１５）］，１个甲基信号［δ：１．０７
（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．６Ｈｚ，Ｈ－１５ＣＨ３）］，２个亚甲基
信号分别为［δ：３．７０（１Ｈ，ｄ，Ｊ ＝１５．４Ｈｚ），３．
６０（１Ｈ，ｄ，Ｊ ＝ １５．４Ｈｚ），Ｈ－２）］和［δ：２．９８
（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１３．７，８．８Ｈｚ），２．６７（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ
＝１３．２，９．９Ｈｚ），Ｈ－１０）］，在高场区（δ：１．６５～
１．１３）还有其他４个相互耦合的亚甲基片段，提示
分子中存在链状片段结构。１３　Ｃ　ＮＭＲ （１５０ＭＨｚ，
ＤＭＳＯ－ｄ６）和ＤＥＰＴ谱结合可见１６个碳信号，包
括１个酯羰基［δ：１７０．８（Ｃ－１）］，１个酮羰基［δ：
２０６．６（Ｃ－９）］，与氢谱对应的四取代苯环的碳信号
［δ：１３５．８ （Ｃ－３），１１１．５ （Ｃ－４），１５９．７ （Ｃ－５），
１０２．１（Ｃ－６），１５７．９（Ｃ－７），１２０．２（Ｃ－８）］，１个连
氧次甲基［δ：７２．０（Ｃ－１５）］，１个甲基［δ：２０．７（Ｃ－
１５ＣＨ３）］和６个亚甲基［δ：３９．１（Ｃ－２），４３．５（Ｃ－
１０），２３．９（Ｃ－１１），２２．８（Ｃ－１２），２６．８（Ｃ－１３），３２．１
（Ｃ－１４）］。由以上数据与文献［２１，２２］比对，确定
化合物１为（Ｓ）－ｃｕｒｖｕｌａｒｉｎ。
化合物２：淡黄色结晶，ＥＳＩ－ＭＳ在ｍ／ｚ２９１．１
处给出分子离子峰［Ｍ＋Ｈ］＋，ｍ／ｚ　３１３．２处给出
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中国海洋药物杂志２０１２年１２月第３１卷第６期 Ｃｈｉｎ　Ｊ　Ｍａｒ　Ｄｒｕｇｓ，２０１２Ｄｅｃｅｍｂｅｒ，Ｖｏｌ．３１Ｎｏ．６
［Ｍ＋Ｎａ］＋ 峰，提示该化合物相对分子质量为
２９０，结合核磁谱提示其分子式为 Ｃ１６Ｈ１８Ｏ５。１　Ｈ
ＮＭＲ（６００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ６）给出１０个氢信号，包
括２个活泼氢信号［δ：１０．２３（１Ｈ，ｓ，ＯＨ），９．７３
（１Ｈ，ｓ，ＯＨ）］，３个ｓｐ２杂化的次甲基信号［δ：
６．３５（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝６．６，１４．３４Ｈｚ，Ｈ－１０），６．３０
（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１５．３６Ｈｚ，Ｈ－１１），６．２３（２Ｈ，ｓ，Ｈ－
４，６］，１个连氧的次甲基信号［δ：４．７４（１Ｈ，ｍ，
Ｈ－１５）］，１个甲基信号［δ：１．１０（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．０
Ｈｚ，Ｈ－１５ＣＨ３）］，２ 个亚甲基信号分别为 ［δ：
（３．４０（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１５．９Ｈｚ）３．３４（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝
１５．９ Ｈｚ）Ｈ－２）］和［δ：（２．２８ （１Ｈ，ｍ）２．１７
（１Ｈ，ｍ）Ｈ－１２）］，在高场区（δ：１．８５～１．３８）还有
其他２个相互耦合的亚甲基片段，将化合物１和２
的氢谱比较，化合物２在高场区（δ：１．８５～１．３８）
处比１少了４个氢，但是低场（δ：６．３５，６．３０）处
出现了２个ｓｐ２杂化的氢，结合ＥＳＩ－ＭＳ数据，提示
化合物１中的亚甲基可能变为双键，改变了周围
氢的化学位移，再与文献［２３－２４］比对，可以确定化
合物２为ｄｅｈｙｄｒｏｃｕｒｖｕｌａｒｉｎ。
化合物３：白色粉末，ＥＳＩ－ＭＳ在ｍ／ｚ３２３．１处
给出分子离子峰［Ｍ＋Ｈ］＋，ｍ／ｚ３４５．１处给出［Ｍ
＋Ｎａ］＋峰，提示该化合物相对分子质量为３２２，
１　Ｈ　ＮＭＲ（６００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）给出１６个氢信号，
包括３个活泼氢信号［δ：８．４９（１Ｈ，ｓ，ＯＨ），
７．７３（１Ｈ，ｓ，ＯＨ），３．８０（１Ｈ，ｓ，１１－ＯＨ）］，２个
芳香氢信号［δ：６．２９（１Ｈ，ｓ，Ｈ－６），６．２２（１Ｈ，
ｓ，Ｈ－４）］，２个连氧的次甲基信号［δ：４．９４（１Ｈ，
ｍ，Ｈ－１５），３．８７（１Ｈ，ｂｒｓ，Ｈ－１１）］，１个甲基信号
［δ：１．１９（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．０６，Ｈ－１５ＣＨ３）］和４个
亚甲基上的８个分别耦合裂分开的氢信号［δ：
３．４９（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１０．４４，Ｈ－２），３．０１（１Ｈ，ｂｒｓ，
Ｈ－２），３．３６ （１Ｈ，ｄ，Ｊ ＝ ４．３８，Ｈ－１０），３．２９
（１Ｈ，ｄ，Ｊ ＝３．８４，Ｈ－１０），２．０３（１Ｈ，ｂｒｓ，Ｈ－
１３），１．７０（１Ｈ，ｂｒｓ，Ｈ－１３），１．６２（１Ｈ，ｂｒｓ，Ｈ－
１４），１．５２（１Ｈ，ｂｒｓ，Ｈ－１４）］，结合弯孢霉菌素类
化合物的结构特点、化合物３的氢谱和ＥＳＩ－ＭＳ数
据，可推测为１１－Ｈｙｄｒｏｘｙ－１２－Ｏｘｏｃｕｒｖｕｌａｒｉｎ，再与
文献［２５］数据比对，确定化合物３为１１－β－Ｈｙ－
ｄｒｏｘｙ－１２－Ｏｘｏｃｕｒｖｕｌａｒｉｎ。
化合物４：黄色油状，ＥＳＩ－ＭＳ在ｍ／ｚ３０９．１处
给出分子离子峰［Ｍ＋Ｈ］＋，ｍ／ｚ３３１．１处给出［Ｍ
＋Ｎａ］＋峰，ｍ／ｚ　３４７．１处给出［Ｍ＋Ｋ］＋峰，提示
该化合物相对分子质量为３０８，结合１　Ｈ 谱和与化
合物１比对，提示其分子式为Ｃ１６Ｈ２０Ｏ６。１　Ｈ　ＮＭＲ
（６００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）给出１１个氢信号，包括１个活
泼氢信号［δ：９．３０（２Ｈ，ｂｒｓ，ＯＨ）］，２个芳香氢
信号［δ：６．３０（１Ｈ，ｓ，Ｈ－６），６．１６（１Ｈ，ｓ，Ｈ－
４）］，２个连氧的次甲基信号［δ：４．８１（１Ｈ，ｍ，Ｈ－
１５），３．９７（１Ｈ，ｂｒｓ，Ｈ－１１）］，１个甲基信号［δ：
１．０５（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．０，Ｈ－１５ＣＨ３）］，２个亚甲基
信号分别为［δ：（４．０２（１Ｈ，ｄ，Ｊ ＝１６．５）３．４８
（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１６．５）Ｈ－２）］和［δ：（３．４２（１Ｈ，ｄ，
Ｊ＝１４．３）２．９２（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝６．６，１４．８８）Ｈ－
１０）］，在高场区（δ：１．５０～１．１７）还有其他３个相
互耦合的亚甲基片段，由以上数据与化合物１的
氢谱比较，不同之处在于化合物４的２，１０位亚甲
基氢化学位移比化合物１普遍偏低场，提示化合
物４中含有吸电子基团，且少了１个耦合的亚甲
基，多了１１位的连氧次甲基信号，结合质谱信息
可以推测１１位连接－ＯＨ，再与文献［２６］数据比对
基本吻合，可基本确定化合物４为１１－β－Ｈｙｄｒｏｘｙ－
ｃｕｒｖｕｌａｒｉｎ。
化合物５：黄色油状，ＥＳＩ－ＭＳ数据与化合物４
一致，结合氢谱比对可知与化合物４为同分异构
体，分子式为 Ｃ１６Ｈ２０Ｏ６，１　Ｈ　ＮＭＲ （６００ ＭＨｚ，
ＤＭＳＯ－ｄ６）给出１２个氢信号，包括２个活泼氢信
号［δ：１０．１２ （１Ｈ，ｓ，ＯＨ），９．９０ （１Ｈ，ｓ，
ＯＨ）］，２个芳香氢信号［δ：６．３１（１Ｈ，ｄ，Ｊ ＝
２．２２，Ｈ－６），６．１８（１Ｈ，ｄ，Ｊ ＝２．２２，Ｈ－４）］，２
个连氧的次甲基信号［δ：４．８７（１Ｈ，ｍ，Ｈ－１５），
４．６３（１Ｈ，ｄ，Ｊ ＝５．４６，Ｈ－１１）］，１个甲基信号
［δ：１．０７（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．６，Ｈ－１５ＣＨ３）］，２个亚
甲基信号分别为［δ：（３．７８（１Ｈ，ｄ，Ｊ ＝１４．３４）
３．５８（１Ｈ，ｄ，Ｊ ＝１５．３６）Ｈ－２）］和［δ：（３．１７
（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝４．４４）２．８８（１Ｈ，ｂｒｓ）Ｈ－１０）］，在
高场区（δ：１．６２～１．２３）还有其他３个相互耦合的
亚甲基片段，由以上数据与化合物４的氢谱比较，
不同之处在于２，１０，１１，１５位的化学位移有差别，
推测化合物５同４相比是１１－ＯＨ的构型不同，结
构为１１－α－Ｈｙｄｒｏｘｙｃｕｒｖｕｌａｒｉｎ，再与文献［２７］比
对，可知１１－β－Ｈｙｄｒｏｘｙｃｕｒｖｕｌａｒｉｎ　Ｈ－１０的２个氢
信号化学位移差值在０．６３～０．７７之间，而１１－α－
Ｈｙｄｒｏｘｙｃｕｒｖｕｌａｒｉｎ差值为０．２２左右，且１５位氢
０２
Ｃｈｉｎ　Ｊ　Ｍａｒ　Ｄｒｕｇｓ，２０１２Ｄｅｃｅｍｂｅｒ，Ｖｏｌ．３１Ｎｏ．６ 中国海洋药物杂志２０１２年１２月第３１卷第６期
的 化 学 位 移 １１－β－Ｈｙｄｒｏｘｙｃｕｒｖｕｌａｒｉｎ 比 １１－α－
Ｈｙｄｒｏｘｙｃｕｒｖｕｌａｒｉｎ偏高场，化合物５的Ｈ－１０的２
个氢信号化学位移差值是０．２９，与文献吻合，在此
可以确定化合物４为１１－β－Ｈｙｄｒｏｘｙｃｕｒｖｕｌａｒｉｎ，化
合物５为１１－α－Ｈｙｄｒｏｘｙｃｕｒｖｕｌａｒｉｎ。
２．３　化合物生物活性测定
选取Ａ５４９、ｈｅｌａ、ＢＥＬ－７４０２、Ｋ５６２　４种肿瘤细
胞系，用 ＭＴＴ法［２８］以阿霉素为阳性药对化合物１
～５做活性测试，结果如表１所示，表明５个化合
物对ＢＥＬ－７４０２细胞都没有抑制活性，化合物１的
抑制率普遍较低，化合物２～５对 Ａ５４９和 Ｋ５６２
细胞具有中等抑制活性，而对ｈｅｌａ细胞的抑制率
普遍较高，表明化合物具有显著的细胞选择性。
于是选取ｈｅｌａ细胞用ＳＲＢ法测定出化合物２～５
对ｈｅｌａ细胞的ＩＣ５０值分别为３．９９、７．７５、１０．００和
５．１０μｍｏｌ／Ｌ，提示Ｃ－１０与Ｃ－１１位双键和Ｃ－１１位
羟基的存在是活性所必需，而Ｃ－１１位羟基的构型
不同能引起约１倍的强度变化，详细的构效关系
还需要进一步验证和研究。
表１　化合物１～５对４种肿瘤细胞系的细胞活性ａ
Ｔａｂｌｅ　１　Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｉｅｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ　１～５　ａｇａｉｎｓｔ　ａ　ｐａｎｅｌ　ｏｆ　ｆｏｕｒ　ｔｕｍｏｒ　ｃｅｌ　ｌｉｎｅｓａ ／％
抑制率
Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ　ｒａｔｅ
Ａ５４９ ｈｅｌａ　 ＢＥＬ－７４０２ Ｋ５６２
阿霉素
ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ
８５．７３　 ５１．０６　 ６６．０３　 ８５．９３
１　 １３．２９　 ３０．１２　 ７．３０　 １．３５
２　 ６６．６１　 ７４．３３　 １８．５９　 ５３．２０
３　 ３７．５１　 ７８．８６　 １１．９８　 ４５．４１
４　 ３５．４６　 ５４．４２　 ６．２１　 ３６．９５
５　 ６５．６５　 ７７．２６　 １５．４２　 ５１．４５
　　ａ测试结果为抑制率（％），阿霉素浓度为１μｍｏｌ／Ｌ；化合物１～５浓度为１０μｍｏｌ／Ｌ。表中：Ａ５４９＝人肺癌上皮细胞系；ｈｅｌａ＝人子宫颈
癌细胞系；ＢＥＬ－７４０２＝人肝癌细胞系；Ｋ５６２＝人慢性髓性白血病细胞系。
２．４　结语
本研究采用活性追踪的方法从１株来自广西
红树林的内生真菌ＬＤ－６８的发酵产物中分离鉴定
了５个弯孢霉菌素类化合物，研究表明，化合物２
比其他同系物具有更强的药理活性。据文献报道，
弯孢霉菌素类化合物对一系列肿瘤细胞具有细胞
毒活性，其中化合物１活性较低，２活性最高，对
ＮＣＩ－Ｈ４６０、ＭＣＦ－７、ＳＦ－２６８、ＭＩＡ　Ｐａ　Ｃａ－２、Ｈｅｌａ和
Ａ５４９等多种人肿瘤细胞系具有较高的细胞毒活
性［２３，２９－３０］，化合物３未见有活性报道，化合物４和５
对ＮＣＩ－Ｈ４６０、ＭＣＦ－７、ＳＦ－２６８等肿瘤细胞具有中
等活性［２３，２９］，并且对人肿瘤细胞的ＩＣ５０值是正常原
纤维细胞的３～５倍，显示出对肿瘤细胞和正常细
胞的选择毒性［２９］。本研究首次测定了化合物３～５
对Ａ５４９、ｈｅｌａ、ＢＥＬ－７４０２、Ｋ５６２共４种肿瘤细胞系
的细胞毒活性，结果表明，化合物２～５对ｈｅｌａ细
胞显示较高的抑制率。
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ｖｅｒｓｅ　ｐａｎｅｌ　ｏｆ　ｈｕｍａｎ　ｔｕｍｏｒ　ｃｅｌ　ｌｉｎｅｓ［Ｊ］．Ｊ．Ｎａｔ．Ｃａｎｃｅｒ
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ｉｃ　ａｎｄ　ｏｔｈｅｒ　ｍｅｔａｂｏｌｉｔｅｓ　ｏｆ　Ａｓｐｅｒｇｉｌｕｓ　ｉｎｈａｂｉｔｉｎｇ　ｔｈｅ　ｒｈｉｚｏ－
ｓｐｈｅｒｅ　ｏｆ　Ｓｏｎｏｒａｎ　ｄｅｓｅｒｔ　ｐｌａｎｔｓ［Ｊ］．Ｊ．Ｎａｔ．Ｐｒｏｄ．，２００４，
６７（１２）：１９８５．
［３０］　Ｘｉｅ　Ｌ　Ｗ，Ｏｕｙａｎｇ　Ｙ　Ｃ，Ｚｏｕ　Ｋ，ｅｔ　ａｌ．Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｄｉｆｆｅｒ－
ｅｎｃｅ　ｉｎ　ａｎｔｉ－Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ａｕｒｅｕｓ　ｂｉｏａｃｔｉｖｉｔｙ　ｏｆ　ｃｕｒｖｕｌａｒｉｎ
ｄｅｒｉｖａｔｅｓ　ｆｒｏｍ　ｆｕｎｇｕｓ　Ｅｕｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍｓｐ．［Ｊ］．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏ－
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２２
Ｃｈｉｎ　Ｊ　Ｍａｒ　Ｄｒｕｇｓ，２０１２Ｄｅｃｅｍｂｅｒ，Ｖｏｌ．３１Ｎｏ．６ 中国海洋药物杂志２０１２年１２月第３１卷第６期