全 文 ：医药病理击选馨肇少
响应面法优化线叶龙胆中龙胆苦昔提取工艺
罗云演 , , 2
(l
.青海民族大学化学与生命科学学院 青海西宁 81 0 07 ;2 .青藏高原植物资源化学重点实验室 青海西宁 81 0 07 )
摘要 :采用响应面法优化乙 醇热 回流提取线叶龙胆中龙胆苦等的提取工艺 。在单因素试验基础上 ,选择 乙醇浓度 、料液比 、 提取时间为 自变量 ,
以龙胆苦等提取率为响应值 ,进行日ox 一eB h nk en 中心组合实验设计 ,采用响应面法 ( R S M ) 评估其对龙胆苦等提取率的影响 。在乙 醇浓度71 % ,液料比
3 4 : 1
,提取时间 83 m m时 ,提取率达4 . 52 % 。
关键词 :响应面分析法 线叶龙胆 龙胆苦等 提取
中图分类号 :R 2 9 文献标识码 :A 文章编号 : 1 6 7 4 一2 0 6 0 ( 2 0 1 4 ) 0 4 一0 0 8 1 一0 2
藏药线叶龙胆 (G en it 肌 a 角 r re ir) 为龙胆科龙胆属植物 ,藏医作
“ 邦见 ”使用 , 《晶珠本草》记载 :邦见治毒病 ,各种热症 , 喉炎热闭 l[] 。线
叶龙胆中含有龙胆苦昔 、璋牙菜昔等成分 , 以龙胆苦昔成分最高 2[] 。现
代药理研究表明 , 龙胆苦昔具有利胆 、健胃 、 抗肿瘤等作用 3[] 。本文采
用 R S M优化乙醇热回流提取线叶龙胆中龙胆苦昔的提取工艺 。
1 仪器与试药
依利特 P 2 30 高效液相色谱仪 (D A D 2 30 + 二极管阵列检测器 ) ;
H H 一4数显恒温水浴锅(国华电器有限公司 )。
线叶龙胆 , 采自青海省海北门源地区 , 由当地藏医鉴定 ;龙胆苦
昔对照品 :上海哈灵生物科技有限公司 , 批号 : 110 7 70 一 201 01 3 。 甲醇
(色谱纯 ) 、 乙醇(分析纯 ) 、蒸馏水等 。
2 方法
2
.
1 龙胆苦普 H P L C 侧定方法 #[]
色谱柱为依利特 C 18 色谱柱 (2 5 0 x 4 . 6 m m , 5 似 m ) , 流动相为
甲醇一水 (2 5 : 7幻 , 流速 1 . 0耐 / 且1 1 ,检测波长27 0n m , 柱温2 5℃ ,进样
量 15 u l 。
该色谱条件下 ,样品中其他成分不干扰测定 。龙胆苦昔质量浓
度在 0 . 0 1 1 一 0 . 2 2 m g / m l 内 , 线性关系 良好 , 回归方程为
y 一2 68 17 7x + 103 8 . 2 , R Z一 0 . 999 5 ;精密度 R S D为 0 . 72% , 重复性 R S D
表 1 实验设计因素与水平表
为 0 . ” %旧 内精密度 R SD为 0 . 67 % 。
2
.
2 含量侧定
取药材粉末 1 9 , 70 %乙醇 30 m L , 热回流提取90 恤 n , 抽滤 , 提取
3次 ,合并滤液 。精密量取滤液 10 11止 , 浓缩 ,流动相定溶于 10 伽 L容量瓶 , 按粗 . 1 ” 项下色谱条件分析 ,计算 。
2
.
3 单因素实验与提取工艺优化
考察乙醇浓度 、提取时间 、 液料比 、 提取物粒度对提取率的影
响 。在单因素实验结果上 ,选取对提取率影响较大的乙醇浓度(A ) 、
… … 下转第 83 页
表 2 R S M 实验设计及实验结果
实验因素 水平
一 1 } o } 1
乙醇浓度 (A )( 0)/ } 6 0 } 7 0 } 8 0液料比 ()B (-inl / g ) } 2 0 } 3 0 } 4 0
提取时间 ( )C (皿n) 6 0 9 0 120
编号 乙醇浓度% 液料 比 提取时间皿 n 提取率%
l } 1 } 一 1 } o } 4
.
3 6
2 }
一 1 } 1 } o } 4
.
0 2
3 } 1 } 1 } o }
4
.
4。
4 0 l } 一 1 } 4
.
4 3
5 0 0 0 4
.
5 1
6 } o } o } o }
4
.
0 6
7 } 一 1 } o } 一 1 } 4
.
3 1
8 } o }
一 1 } 一 1 } 4
.
3 9
9 } 1 } o }
一 1 } 4
.
4 9
l 0 一 1 } 一 1 } o } 4
.
2。
l l } o } o } o } 4
.
0 3
l 2 } o } o } o }
4
.
0 8
l 3 } 1 } o } 1 }
4
.
2 3
l4 0 0 0 4
.
54
l 5 0 一 1 } 1 } 4
.
14
l 6 一 1 } o } 1 } 4
.
19
l 7 } o } 1 } 1 } 4
.
3 3
表 3 回归方程方差分析表
方差来源 平方和 自由度 均方 F 值 P值 显著性
模型 0 . 3 0 9 } 0 . 0 3 3 } 2 0 . 4 7 }} 0 . 0 00 2 }} , , ,
A 8
.
4 5 0 E一 00 3 } l } 8
.
4 0 0 E一 0 0 3 } 6
·
4 3 } 0
·
0 3 8 9 }
,
B } 0
· 以 4 } l } 0
·以 4 } 3 3
.
13 } 0
·
0 0 0 7 }
, , ,
C 0
.
0 6 7 } l }} 0
.
0 6 7 } 。 0
.
7 1 } 0
.
0 0 02 }}
, , ,
A B 8
.
10 0 E一 00 3 } l } 8
·
10 0 E一 0 0 3 } 6
·
1 7 } 0
· 以 2 0 } ,
A c }
4
.
go o E一 00 3 } l } 4
.
g o o E一 0 0 3 } 3
·
7 3 } 0
·
0 94 7 }
B c } 。
.
62 o E一 00 3 } l }} 。
.
62 o E一 00 3 } 4
.
2 8 } 0
.
0 7 7 3 }}
A
z
} 0
.
0 2 9 } l }} 0
.
0 2 9 } 2 2
.
2 2 } 0
.
0 02 2 }}
, ,
B
z
} 0
·
0 18 } l } 0
·
0 18 } 13
.
86 } 0
·
0 0 74 }
, ,
C
z
0
.
10 1 } 0
·
10 } 7 7
.
76 }
< 0
.
0 00 1 }
, , ,
残差 9 . 19 5 E一 00 3 } 7 }} 1 . 3 14 E一 00 3 } } }}
失拟项 } 6
·
27 5 E一 00 3 } 3 } 2
·
09 2 E一 00 3 } 2
·
8 7 } 0
·
16 7 7 } 不显著净误差 2 . 92 0 E一 00 3 } 4 } 7
·
30 0 E一 0以 } } }
总误差 } 0 . 3 1 } 16 }} } } }}
R
z
} 0
·
9 7以 } R z、 。 一 0
.
9犯 3 } } } }
注 : * * * , P < 0 . 00 1 , 差异极显著 ; * * , P < 0 . 0 1 , 高度显著 ; * , P < 0 . 0 5显著 ; P > 0 . 1 , 不显著 。
作者简介 :罗云演 (l 98 年 1 月 - 一 ) ,女 ,湖北省松滋市刘 家场镇 ,硕士研究生 ,研究方向为藏药质量控制的研究 。
日旧 T任〔 Hw 日日L口 生物技市世界 81
医药病理击选馨肇少
配制丁草胺浓度依次为 10、 刃 、 10 0、 20、3 0、4 0、5 0m g ·L 一上的
基础培养液 , 高压灭菌后 ,将降解菌株L Y C一 1和L Y C一2的混合菌菌
悬液(最佳配比 )以最佳接种量接种到5 0m L丁草胺无机盐基础培养
液中 , 同时测定培养液的初始 O D 6 0 0 n m , 在最佳培养温度下 ,
1劝 r · m i n 一上恒温摇床振荡培养7d 后测定菌株生长量 , 并对培养液中
残留的丁草胺进行提取测定 ,计算降解菌株对丁草胺的降解率 。
2 结果与分析
2
.
1 两株高效降解细菌混合最佳 比例 的确定
由图 1可知 ,当降解菌株L Y C一 1和 L Y C一 2的菌悬液以3 : 1的比
例混合时 , 降解率最高 , 表明该两株细菌对底物的利用程度有所差
别 ,两株菌共存状态下其生长相互制约 , L Y C 一 1可能对丁草胺的降
解起主导作用 , 但并不是降解占优势的菌株比例越大越好 ,在它们
协同作用下 , 底物利用程度才能最佳 。
2
.
2 单菌株与混合菌株降解率的比较
从图 2可以看出 , 降解菌株L Y C一 1与L Y C一2均可以独立降解丁
草胺 , 但两者的混合后对丁草胺的降解效果优于单菌 。
2
.
3 复配菌剂对不 同底物浓度丁草胺的降解能力
由图 3分析可知 , 复配菌剂对较低浓度的丁草胺有较高的降解
率 。在底物浓度小于 10 0m g / L时 , 混合菌对底物的降解能力非常强 ,
降解率均大于72 % ,并且随着底物浓度的增加降解率随之增大 。当底
物浓度大于 10 m g / L时 , 降解率明显下降 。混合菌在丁草胺浓度小
于 2 0 m g / L时 , 随着底物浓度的增加 , 生长量呈上升趋势 ,当丁草胺
浓度大于 20 m g / L时 , 生长量逐渐下降 ,说明在一定底物浓度范围
内 , 混合菌对一定范围内底物浓度有较强的适应力 , 但在底物浓度
达到一定限度时 , 菌株生长受到明显抑制 。
3 讨论
生物修复是作为一种高效的清除环境中有机污染物的生物处
理技术 ,其目的是加速和强化微生物对有机污染物的降解能力 。
本研究针对两株降解菌单菌和混合菌 (3 : 1 )进行了降解能力比
较 ,结果表明 , 降解菌株 L Y C一 1与L Y C一2两株单菌均可以独立降解
丁草胺 ,但两者的混菌对丁草胺的降解效果优于单菌 。分析原因可
能为 :混合菌含有多种降解酶 , 从而可降解复杂的污染物 , 提高降解
效率 。初步推断降解菌株L Y C一 1与L Y C一 2各自存在着能够降解丁
草胺的酶系 ,两菌混合时极大可能形成了一个酶活性较高的生物降
解体系 。根据微生物协同降解模式是消除难降解有机物的一种行之
有效的方法 ,本研究结果为该理论提供了新的证据 , 但有待做更深
人的研究 。
在生物修复技术的使用过程中 ,将具有特定降解功能的高效降
解菌株加人污染土壤中对污染物进行降解是比较有效的方法 ,将复
配菌剂应用于多变的田间自然环境对丁草胺去除效果如何 ,值得下
一步探讨 。将复配菌剂作为降解菌源应用于丁草胺等酞胺类除草剂
污染土壤的原位生物修具有可行性 。
4 结语
( 1) 降解菌株L Y C一 1和 L Y C一2的菌悬液以3 : 1的比例混合时 , 降
解率最高 ,此比例下的降解率大于两株降解菌单菌的降解率 。
(2) 在接种量为5% , 温度 30 ℃ , p H值 7 . 0条件下 , 丁草胺浓度为
100m g
·
L
一上时 , 混合菌的降解率最大 ,当丁草胺浓度为2 0 m g · L 一上
时 , 混合菌的生长量最大 。
参考文献
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… … 上接第 81 页
液料比( )B 、提取时间( )C ,进行中心组合实验 ,选取水平 ,见表 1 。以龙
胆苦昔提取率为响应值 , 通过 R S M得出最佳提取工艺参数 。
3 结果与分析
3
.
1 单因素对龙胆苦普提取率的影响
乙醇浓度的影响 :称取药材 1 9 , 过40 目筛 ,在提取时间90 I n且1 ,料
液比 1 : 30条件下 , 乙醇浓度分别为刃% , 60 % , 70 % , 80% , 90 %按粗 . 2 ”
项下方法实验 。当乙醇体积分数为70 %时得率达到最高值 4 . 27 % , 之
后提取率下降 ,故选择乙醇浓度为 70 %左右 。
液料比的影响 :称取药材 19 , 过40 目筛 ,在提取时间90 In且 1 , 乙醇
浓度70%条件下 ,液料比分别为一。 : 一, 20 : 1 , 30 : 1 , 4 0 : 1 , 5 0 : 1按 “ 2 . 2 , ,
项下方法实验 ,当液料比达到30 : 1得率达到最高值4 . 37 % , 随着提取
剂用量增加 , 提取率变化不大 , 故选择液料 比为30 : 1左右 。
提取时间的影响 :称取药材 19 , 过40 目筛 ,在乙醇浓度7嘶 ,料液
比 1 : 30条件下 , 提取时间分别为30 , 60 , 90 , 120 , 1 5 0恤 n按 “ 2 . 2 , ,项下
方法实验 , 90 恤 n 以后提取率有所下降 , 可能随着提取时间的延长 ,
龙胆苦昔有部分降解 , 故选择提取时间为90 恤 n左右 。
提取物粒度的影响 :称取药材 1 9 ,在提取时间90 ~
, 乙醇浓度
70%
,料液比 1 : 30条件下 ,提取物粒度分别为 10 , 20 , 30 , 4 0 , 5 0目 , 按
“
2
.
2
” 项下方法实验 , 于40 目之后提取率有所下降 , 可能是粉末过
细 ,提取时虽能提高溶出效果 , 但吸附作用增加 , 影响提取率 , 故选
择 40 目。
3
.
2 R sM 分析方案与数据分析
利用 D es i g n E邓 er t . v . 8 . 0 . 6软件 ,对龙胆苦昔提取工艺进行
R S M分析 ,具体方案及结果见表2 , 表 3 。
通过拟合得到回归方程 :龙胆苦昔提取率一 4 . 5 4 + 0 . 0 3 3 * A +
0
.
07 4
*
B 一 0 . 0 9 卜 C 一 0 . 0 4 5 * A * B 一 0 . 0 3 5 * A * C + 0 . 0 3 8 * B * C 一
0
.
0 83
*
A Z一0 . 066 * B Z一 0 . 16 * C Z 。表 3中 , 回归模型P值小于 0 . 000 1达
到极显著水平 , 方程相关系数 R Z一 0 . 9 323 ,说明该模型拟合度较好 ,
失拟项P一 0 . 16 7 (P > 0 . 0幻不显著 ,表明本实验所得二次回归方程高
度显著 ,可以用来预测该提取工艺的工艺条件 。
3
.
3 验证实验
据模型优化条件得最佳理论工艺条件为 : 乙醇浓度 71 . 29 % 、 液料
比34 . 4 4 : 1 , 提取时间82 . 36 In 卫1日寸, 龙胆苦昔提取率理论值为4 .刃% 。
实际操作中将最佳工艺条件调整为乙醇浓度7 10/ 、料液比34 : 1、 提取
时间83 恤 n , 龙胆苦昔得率为4 . 犯0(/ n 一 3) 极接近理论值 。
4 结语
用乙醇热回流提取线叶龙胆中龙胆苦昔 ,在单因素试验基础
上 ,采用 R S M 法对该工艺进行优化 ,得出最优工艺条件为乙醇浓度
7 1%
,液料比34 : 1 , 提取时间83 恤 n ,在此条件下 , 龙胆苦昔提取率为
4
.
5 2% (
n 一 3 )
。
参考文献
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