全 文 ：第 36卷第 3期
2007年 3月
应　用　化　工
Applied Chem ica l Industry
Vo.l 36 No. 3
M ar. 2007
收稿日期:2006-11-16
基金项目:肇庆市科技局资助项目(203E501)
作者简介:段志芳(1973 -), 女 ,河南安阳人 , 肇庆学院生物系讲师 , 博士 , 师从中山大学古练权教授 , 主要从事天然产物
化学研究与开发工作。电话:0758 - 2716164, E -m a il:w dzh ifang@ yahoo. com. cn
溪黄草黄酮的超声波法提取与活性研究
段志芳 ,梁盛年 ,谭细雪
(肇庆学院 生物系 ,广东肇庆　526061)
摘　要:采用超声波法提取溪黄草中的总黄酮 , 用正交法确定了最佳提取工艺 , 并与常规回流提取法作了比较研
究。超声波法的最佳提取条件为:使用 60%乙醇作溶剂 , 在温度 60 ℃, 料液比为 1 ∶40条件下超声波辅助提取
20 m in, 连续提取 2次 ,黄酮的总提取率可达 99. 81%。 研究了黄酮提取物对羟自由基的抑制作用及体外抑菌作
用 , 结果表明 ,溪黄草黄酮提取物对羟自由基有抑制作用 ,对金黄色葡萄球菌和枯草杆菌有一定的抑菌效果。
关键词:溪黄草总黄酮;超声波提取;羟自由基;抑菌作用
中图分类号:R 284 　　　文献标识码:A　　　文章编号:1671 -3206(2007)03 - 0232 -04
Research on ultrasonic wave extraction and activity
of flavone from Rabdosia Serra (Maxmi . )Hara
DUAN Zh i-fang , LIANG Sheng-nian, TAN X i-xue
(Depar tm en t o f B iology, Zhaoqing University, Zhaoq ing 526061, China)
Abstract:The u ltrason icw ave ex traction technology of flavone compounds in Rabdosia Se rra (Max im. )
Hara w as studied in this paper, the best extrac tion condition w as obtained by orthogonal design, mean-
while, compared w ith reflux ing ex traction technology. Itw as found that 60% e thano lw as as so lvent, the ra-
tio of solid to liqu id w as 1∶40, ex tract fo r 20m in a t 60℃ for tw ice. The ave rage ex traction rate may up
to 99. 81%. The inh ib ito ry effects o f the extrac t on hydroxy l free radical and bacteriaw ere measured. The
resu lts show ed tha t the ex tract had inh ib ito ry effect on hydroxy l free radica.l It a lso had bacteriostatic
effects on S taphylococcus aureus and Bacillus sub tilis.
Key words:Rabdosia serra (Maxim. )Hara flavone compounds;ultrasonic ex traction;hydroxy l free rad-
ica l;bac teriostatic effects
　　溪黄草属于唇形科香茶属植物 ,是一种多年生
小草本 ,含萜类 、黄酮类 、酚类 、氨基酸等多种化学成
分 ,具有清热祛湿 、凉血散瘀 、抗肿瘤 、抗菌 、消炎及
对肝脏的保护作用[ 1] ,临床用于治疗乙型肝炎 、急
性黄疸型肝炎 、急性胆囊炎以及治疗跌打 、痈肿等
症 [ 2] 。近年来 , 中草药溪黄草在华南各地临床上广
为应用 ,并出现了一些以其为主要原料的保健产品 ,
具有较大的开发应用前景 。
超声波提取法作为一种优良新型的提取技术 ,
广泛应用于中药有效成分的提取 、分离与制备工艺
中 [ 3] 。有关文献报道了用超声波法从银杏叶 、金银
花 、槐花等中提取黄酮类物质[ 4] ,目前尚未见用超
声波法提取溪黄草总黄酮的报道。本文通过正交实
验考察了超声波法从溪黄草中提取黄酮类化合物的
主要影响因素 ,并研究了其抗自由基活性和体外抑
菌作用 。
1　实验部分
1. 1　试剂与仪器
芦丁 ,生化试剂;N aNO 2、A l(NO 3)3 、NaOH、水杨
酸 、过氧化氢 、硫酸亚铁 、浓硫酸 、三氯化铁 、醋酸镁 、
氨水 、盐酸 、锌粉 、无水乙醇 、石油醚 、正丁醇等均为
分析纯。
溪黄草全草购于肇庆市中药材市场 ,肇庆学院
生物系陈雄伟副教授鉴定;大肠杆菌 、枯草芽孢杆
菌 、金黄色葡萄球菌 、黑曲霉 、酵母菌均由肇庆学院
生物学系微生物室提供 ,细菌于牛肉膏蛋白胨培养
基上活化 (37 ℃, 24 h),霉菌于察氏培养基上活化
(28℃, 48 h),酵母菌于无菌水中活化(28℃, 4 h)。
KQ-50E超声波清洗器;UVProbe-2550型紫外
可见光光度计;FA2004N电子分析天平;电热鼓风
恒温干燥箱;HH-4型数显恒温水浴锅;ZKJ-1型循
DOI牶牨牥牣牨牰牭牳牨牤j牣cnki牣issn牨牰牱牨牠牫牪牥牰牣牪牥牥牱牣牥牫牣牥牥牳
第 3期 段志芳等:溪黄草黄酮的超声波法提取与活性研究
环水真空泵;RE-52AA旋转式蒸发器;DJ-10A倾倒
式粉碎机。
1. 2　实验方法
1. 2. 1　索氏提取法提取溪黄草中总黄酮　取溪黄
草粉末 2. 00 g,用 70%乙醇溶液进行索氏提取10 h ,
至无色 ,提取液抽滤定容。
1. 2. 2　超声波法提取溪黄草中总黄酮　准确称取
2. 00 g溪黄草粉末于 100mL于三角烧瓶中 ,按要求
加入一定量的乙醇溶液 ,在一定温度下超声波辅助
提取一定时间 ,趁热抽滤 ,加相应浓度乙醇定容于
100mL容量瓶中 ,作为待测液 。
1. 3　提取液中黄酮的含量测定
1. 3. 1　标准曲线的绘制　称取 120 ℃干燥至恒重
的芦丁 5. 0 mg,用 60%微热乙醇定容至 50 mL,得
浓度为 0. 1 mg /mL的标准液 。准确吸取标准液 0,
1. 0, 2. 0, 3. 0, 4. 0, 5. 0 mL于 6只具塞试管中 ,加
30%乙醇使成 5 mL,加 5%N aNO2溶液 0. 3 mL,摇
匀 ,放置 6m in。加 10%A l(NO 3)3溶液 0. 3 mL,摇
匀 ,放置 6m in。加 1 mo l /L NaOH溶液 4 mL,加水
0. 4mL,摇匀 ,放置 10 ～ 15m in,于 510 nm波长处测
定吸光度 ,绘制标准曲线。依芦丁浓度-吸光度标准
工作曲线 ,得出回归方程 A =9. 312 9C +0. 026 5,
R =0. 999 2。
1. 3. 2　提取液中黄酮的含量测定　按上述 1. 3. 1
节的方法 ,以试剂为空白 ,于 510 nm处测定吸光度
值 A。从工作曲线方程中查出黄酮浓度 ,计算出黄
酮含量 。以此求出索氏提取法中总黄酮的含量为
8. 16%,超声波法各提取液中总黄酮以此作为比较
标准 ,得到相对提取率 。
1. 4　溪黄草中总黄酮的活性测定
1. 4. 1　总黄酮的提取分离　称取溪黄草干粉 30 g,
按 1. 2. 2节所得最佳提取工艺连续提取 2次 ,合并
滤液 ,减压浓缩至一定体积 ,加入石油醚萃取 ,以除
去脂溶性杂质 ,静置分层后 ,乙醇水溶液部分呈棕黄
色 。将此溶液减压蒸馏 ,除去大部分乙醇 ,然后用正
丁醇萃取 3次 ,合并 ,再用水反萃取 3次 ,得正丁醇
部分(淡棕黄色)备用 。
1. 4. 2　黄酮物质对羟自由基的清除作用　采用
Fenton反应体系为产生羟自由基的模型 ,固定反应
时间 ,在 510 nm处测量含被测物反应液的吸光度 ,
并与空白液比较 ,便能测定黄酮物质对羟自由基的
清除作用[ 5] 。
1. 4. 3　黄酮物质的体外抑菌作用　采用滤纸片法
研究不同浓度的溪黄草黄酮提取液对金黄色葡萄球
菌 、枯草杆菌 、大肠杆菌 、面包酵母和黑曲霉的抑菌
作用。
2　结果与讨论
2. 1　超声波法提取溪黄草黄酮
在材料粉碎度一定的条件下 ,所用的溶剂以及
溶剂用量 、超声波提取温度及提取时间等因素都对
溪黄草中黄酮提取率有影响 。用水浸提 ,提取物杂
质多 ,后处理较麻烦 。甲醇 、丙醇等作为提取剂 ,虽
然效果不错 ,但两者有毒 。乙醇浸提的选择性好 ,渗
透性强 ,浸出率较高 ,本实验选择乙醇作为提取剂 ,
主要讨论乙醇的浓度 、料液比 、超声波辅助提取时间
和提取温度对黄酮提取率的影响 。
2. 1. 1　单因素实验 　依 1. 2. 2节方法 ,固定其中
3个条件 ,分别测定乙醇浓度 、料液比 、超声波辅助
提取时间 、超声波辅助提取温度各个单因素对黄酮
相对提取率的影响 ,结果见图 1 ～图 4。
图 1　乙醇浓度对提取率的影响
F ig. 1　Effect o f concen tra tion o f e thano l on extraction rate
图 2　料液比对提取率的影响
F ig. 2　E ffect o f rato of so lid to so lu tion on ex traction rate
图 3　超声波辅助提取时间对提取率的影响
F ig. 3　E ffect o f u ltrasonic tim e on ex traction rate
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应用化工 第 36卷
图 4　超声波辅助提取温度对提取率的影响
F ig. 4　E ffec t o f ultrasonic tem pe ra ture on ex trac tion ra te
　　从成本和提取率考虑 ,结合图 1 ～图 4可知 ,乙
醇浓度控制在 40% ～ 60%, 料液比为 (1 ∶20) ～
(1∶40),超声波时间为 10 ～ 30 m in ,提取温度以 40
～ 60 ℃较好。
2. 1. 2　正交实验　为了全面考察这 4个因素的影
响 ,设计了 4因素 3水平 L9(34)进行正交实验 ,结
果与极差分析见表 1。
表 1　L9(34)的正交设计及极差分析结果
Tab le 1　O rthogona l exper im en ta l L9(34) and ana lytical
of polar d ifference
编号
A B C D
乙醇浓度
/% 料液比
超声时间
/m in
超声温度
/℃
总黄酮提取率
/%
1 40 1∶20 10 60 58. 2
2 40 1∶30 20 50 68. 8
3 40 1∶40 30 40 75. 5
4 50 1∶20 20 40 69. 2
5 50 1∶30 30 60 68. 8
6 50 1:40 10 50 73. 5
7 60 1∶20 30 50 66. 8
8 60 1∶30 10 40 64. 3
9 60 1∶40 20 60 88. 1
T1 202. 5 194. 2 196. 0 215. 1
T2 211. 5 201. 9 226. 1 209. 1 T总 =633. 2
T3 219. 2 237. 1 211. 1 209. 0
K 1 67. 5 64. 7 65. 3 71. 7
K 2 70. 5 70. 3 75. 4 69. 7
K 3 73. 1 79. 0 70. 4 69. 7
R 5. 6 14. 3 10. 1 2. 0 最优 A3B 3C 2D 1
　　由表 1可知 ,料液比对溪黄草中黄酮的提取率
影响的差异具有显著性。各因素对黄酮提取效果影
响的主次顺序为:料液比 B >超声波辅助提取时间
C >乙醇浓度 A >超声波辅助提取温度 D 。超声波
法最佳提取条件为 A3B 3C2D1 ,即:用 60%乙醇 ,在温
度 60℃,料液比为 1∶40条件下 ,超声波提取 20m in。
2. 1. 3　浸提次数的确定　按上述 A3B3C2D 1方案进
行超声提取 ,提取结果见表 2。
表 2　浸提次数实验数据
Tab le 2　Experim ental da ta of extrac tion tim es
提取次数 总黄酮含量 /% 相对提取率 /% 累计提取率 /%
1 7. 19 88. 10 88. 10
2 0. 95 11. 71 99. 81
3 0. 02 0. 24 100. 05
　　由表 2可知 ,超声波法提取次数越多 ,黄酮累计提
取率就越高 ,但提高幅度显著降低 ,第 3次黄酮累计提
取率较低 ,只有 0. 24%,所以只需提取 2次 ,即可将
99. 81%的黄酮类化合物从溪黄草中提取出来。
2. 1. 4　超声波法与常规回流法的比较　取 2. 00 g
样品 ,超声法按上述 A3B 3C2D 1方案进行提取 ,连续
提取 2次 ,每次 20 m in。常规回流法用 60%乙醇 ,
在料液比为 1∶40条件下热回流分别提取 4 h和
6 h,各连续提取 2次 ,其黄酮提取率结果见表 3。
表 3　超声波法与常规热回流法的比较
Tab le 3　Compar ison of u ltrason ic and general
ref luxing extraction m ethod
提取条件
超声波法提取时间
1次 2次
20m in 20m in
常规热回流法提取时间
1次 2次 1次 2次
4 h 4 h 6 h 6 h
总黄酮含量 /% 7. 19 0. 95 6. 54 0. 35 7. 08 0. 41
相对提取率 /% 88. 10 11. 71 80. 15 4. 29 86. 76 5. 02
累计提取率 /% 88. 10 99. 81 80. 15 84. 44 86. 76 91. 78
　　表 3结果表明 ,超声法提取 2次 ,提取率可达
99. 81%,而回流法最高提取率仅达 92%,且常规热
回流法提取的时间为超声处理时间的 12 ～ 18倍。
从节约和资源综合利用的角度来看 ,超声波法优于
热回流法 。
2. 2　溪黄草黄酮的活性研究
2. 2. 1　提取液的显色反应　用 2. 1. 2节 A3B3C 2D 1
方案进行提取 ,经石油醚脱脂 ,正丁醇萃取后 ,分别
测定溪黄草萃取液与浓硫酸 、氢氧化钠 、三氯化铁 、
醋酸镁 、氨水和盐酸-锌粉的作用 ,结果见表 4。
　　表 4的结果表明 ,提取液为黄酮类物质 。
表 4　提取液的显色结果
Tab le 4　C olour result of ex trac ts
显色试剂 显色结果
浓硫酸 黄橙色
氢氧化钠 黄色
三氯化铁 深绿色
醋酸镁 黄色
氨水 黄绿色
盐酸-锌粉 红色
2. 2. 2　黄酮提取物对羟自由基的清除作用　将
1. 4. 1节所得黄酮溶液进行含量测定 ,适当稀释后研
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第 3期 段志芳等:溪黄草黄酮的超声波法提取与活性研究
究不同浓度的黄酮溶液对羟自由基的清除作用 。结
果表明 ,溪黄草中的黄酮类物质对羟自由基有清除
作用 ,且与其浓度成正相关性 ,结果见图 5。
图 5　黄酮提取物对羟自由基的清除作用
F ig. 5　Effects of the flavones on removal of hydroxy l free radical
　　由于本文所采用的自由基模型体系所产生的自
由基浓度远大于体内该自由基的浓度 ,可见溪黄草
黄酮提取物是良好的自由基清除剂。
2. 2. 3　总黄酮物质的抑菌作用　表 5为不同浓度
的溪黄草黄酮提取液对金黄色葡萄球菌 、枯草杆菌 、
大肠杆菌 、面包酵母和黑曲霉的抑菌作用 。
表 5　溪黄草黄酮提取液的抑菌效果
Tab le 5　Bacter iostat ic e ffects of flavones from Rabdosia
　　　　　　 serra(Max im. )Hara　　　　　　(mm)
黄酮浓度
/%
供试菌种
金黄色葡萄球菌 枯草杆菌 大肠杆菌 面包酵母 黑曲霉
4 4. 7 4. 5 - 4. 3 1. 5
2 1. 4 3. 1 - - 1. 3
1 - - - - -
0. 5 - - - - -
　　注:牛肉膏蛋白胨培养基 pH为 7. 0;麦氏琼脂培养基 、察氏培
　　　 养基 pH 为自然;表中数据为 3次(每次 4个样)重复平行
　　　 试验的平均值。 “ - ”表示没有结果。
　　由表 5可知 ,该黄酮提取物对金黄色葡萄球菌
和枯草杆菌有一定的作用 , 4%浓度时对面包酵母有
作用 , 2%浓度时对黑曲霉有作用。
3　结论
(1)研究了超声波法提取溪黄草中总黄酮的最
佳工艺 ,并与常规回流法作了比较研究 。结果表明 ,
超声波法优于常规回流提取法。超声波法的最佳提
取条件为:在 60%乙醇 、温度 60 ℃、料液比为 1 ∶40
的条件下超声波辅助提取 20 m in , 2次黄酮提取率
可达 99. 81%。超声波法的黄酮提取率较高 ,可节
省大量的时间和资源 ,为开发利用溪黄草提供了有
益的参考 。
(2)溪黄草黄酮提取物具有一定的抗自由基和
抑菌活性 ,有良好的预防保健应用前景 。
黄酮类物质具有广泛的生理和药理活性 ,包括
抗病毒 、抗癌 、抗氧化 、抗炎 、抗衰老等。因此 ,对该
类化合物的研究已成为国内外医药界的热门课
题[ 6] 。
参考文献:
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