全 文 ：人心果 AFLP反应体系的建立与优化
文亚峰 a ,谢碧霞 a ,何　钢b
(中南林业科技大学 a.资源与环境学院 ; b.生命科学与技术学院 ,湖南长沙 410004)
摘　要: 为给人心果分子生物学研究奠定基础 ,以人心果嫩叶为材料 ,采用改良 CT AB法提取到高质量的
总 DN A,可用于 AFL P实验分析。通过优化酶切—连接反应、预扩增和扩增反应过程中的关键因素 ,建立了适
合人心果的 AFLP实验体系和反应条件 ,得到了带型清晰、多态性丰富的 AFLP指纹图谱。 研究结果对人心
果遗传多样性分析及其分子标记辅助育种具有重要意义。
关键词: 人心果 ; AFL P;反应体系 ; PCR
中图分类号: S759. 3; Q943. 2　　文献标识码: A　　文章编号: 1003- 8981( 2008) 02- 0035- 04
Establishment and Optimization of AFLP System inManilkara zapotae
WEN Ya-fenga , XIE Bi-xiaa , HE Gangb
( a. Co llege o f Resour ces and Envir onment; b. Co lleg e of Life Science and Tech no lo gy ,
Centr al South Univ ersity of Fo restry & Techno log y , Chang sha 410004, Hunan, China )
Abstract: In o rder to pr ovide a basis fo r molecular bio lo gy o f Manilkara zapota , improved
C TAB method was used to ex tract high qua lity g enomic DN A fr om leaves of M . z apota, w hich
could be used in amplified fragment-leng th po lymo rphism ( AFLP) analysis. PCR reaction
system and conditions suitable fo r M . z apota were established, th rough optimi zation o f some
key facto rs affecting restriction-liga tion r eac tion, pr e-amplification and selectiv e amplification
r eac tions, and clear po lymorphic AFLP fingerprints we re obtained. The r esults w er e impo r tant
fo r analysis of g enetic div er sity and mo lecula r marker assisted breeding in M . zapota.
Key words: Manilkara z apota; AFLP; reaction system; PC R
人心果 Manilkara z apota为山榄科铁线子属常绿乔木 ,是一种具有广泛用途的热带果树 [1, 2 ]。 但由于资源
稀少、商品化栽培面积较小 [3 ] ,长期以来 ,人心果的经济价值尚未得到充分和认识和应有的重视。与其它同类热
带果树相比 ,其相关研究相对滞后 ,甚至在不少研究领域中尚存空白 [4 ]。 AFLP( ampli fied f ragment-leng th
polymo rphism )作为一种新兴的 DNA分子标记技术 [5 ] ,已被广泛应用于植物亲缘关系、种质鉴别及遗传多样性
的研究中 [ 6～ 8]。文中参照美国 Applied Biosystems公司的植物荧光 AFLP操作指南 [9 ] ,采用梯度实验方法 ,确定
并建立了人心果的 AFLP反应体系 ,可用于人心果遗传多样性及亲缘关系的研究中 ,对其种质资源保存、品种
分类及分子标记辅助育种等都具有十分重要的意义。
1　材料与方法
1. 1　材　料
人心果实验样品采自广西壮族自治区南宁市人心果种质资源圃 ,各品种样品均选取新鲜幼叶 5～ 10枚 ,用
冰盒带回实验室 ,置于 - 80℃低温冰箱中保存备用。
经济林研究　 2008, 26( 2): 35-38
Nonwood　 Forest　Research 　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
收稿日期: 2008-02-18
基金项目: 国家林业局“ 948”国际引进项目“人心果优良品种及其培育技术引进” ( 2002— 29)。
作者简介: 文亚峰 ( 1971— ) ,男 ,陕西岐山人。 副教授 ,博士 ,主要从事经济林栽培与育种的研究。
DOI : 10. 14067 /j . cnki . 1003 -8981. 2008. 02. 011
1. 2　 DNA的提取
利用并略加以改进 CT AB法以提取 DNA。 用 DU-640核酸蛋白仪对抽提的 DNA进行纯度和浓度检测。
DNA提取质量用 0. 8%琼脂糖凝胶电泳进行检测 , 根据检测结果将符合实验要求的 DNA样品稀释到
100μg· mL- 1 ,以备 AFLP实验之用。
1. 3　 AFLP反应体系
1. 3. 1　酶切—连接体系
在连接酶为 1. 0μL( 3. 0 U)时 ,将酶切—连接时间分别设为 2. 0、 3. 0、 4. 0、 5. 0、 6. 0、 7. 0 h共 6个处理 ,确定
合适的酶切—连接时间。
限制性内切酶 PstⅠ 和 MseⅠ的用量设为 1. 0μL ( 4. 0 U)、 2. 0μL( 8. 0 U)、 3. 0μL( 12. 0 U)共 3个梯度 ,确
定合适的酶用量。
样品 DNA用量设为 100、 200、 300、 400、 500 ng共 5个梯度 ,根据最佳酶切效果组合确定合适的 DNA用量。
酶切—连接完成后 ,取酶切产物 5. 0～ 8. 0μL,加入 load buffer 2. 0μL混合后 ,在 0. 8%的琼脂糖凝胶中检
测酶切效果。
1. 3. 2　预扩增体系
反应体系总体积为 25μL,预扩增引物用量设 0. 5、 1. 0、 1. 5μL共 3个梯度 ,确定合适的引物用量。反应条件
决定了将扩增循环次数由 20轮增加到 30轮 ,并在预扩增的最后一轮增加 5 min的延伸时间。预扩增完成后 ,取
5. 0μL预扩增产物和 Lload buffer2. 0μL混合后 ,在 0. 8%的琼脂糖凝胶中检测预扩增效果。
1. 3. 3　选择性扩增体系
反应体系总体积为 25. 0μL,预扩增产物的稀释倍数设为 5、 10、 15、 20、 30倍 ,选择性扩增引物设为 0. 5、
1. 0、 1. 5μL共 3个梯度 ,确定适宜的稀释倍数和引物用量。
泳道 1、 8为 DNA marker; 泳道 2～ 7分别为酶切—连
接时间 2. 0、 3. 0、 4. 0、 5. 0、 6. 0和 7. 0 h的电泳结果。
Lan e 1 and 8: DN A mark er; Lane 2- 7: elect roph o-
resi s resul t of res t rict ion-ligation reaction for 2. 0-
7. 0 h.
图 1　酶切—连接时间梯度实验结果
Fig. 1　 Result of restriction-ligat ion reaction
time gradient experiment
1. 4　扩增产物的检测
移取扩增产物 1. 0μL,加入 lo ading buf fer 1. 0μL,将经过
94℃热变性 3 min处理后的样品置于 ABI377测序仪电泳 3. 5 h,荧
光检测扩增产物。
2　结果与分析
2. 1　 DNA提取质量
以改良 CT AB法抽取到了较高质量的 DNA,样品纯度在
1. 7～ 2. 0之间 ,浓度约为 120 ng· μL- 1。 0. 8%琼脂糖凝胶电泳检
测的 DNA纯度较高 ,无降解现象 ,可以满足 AFLP的实验要求。
2. 2　酶切—连接体系结果分析
2. 2. 1　酶切—连接时间
酶切—连接时间为 2. 0、 3. 0、 4. 0、 5. 0、 6. 0、 7. 0 h ,电泳检测结
果如图 1所示。由图 1可知 , 6个处理中酶切 5 h的效果最好。 在
0. 8%琼脂糖凝胶电泳检测酶切片段时 ,可见弥散的 smea r现象 ,
少于 4 h则酶切—连接不充分 ,这将影响扩增结果 ,而酶切时间过
长 ,则易引起内切酶的错误识别 ,降低扩增片段的特异性。
2. 2. 2　限制性内切酶的用量
内切酶用量梯度实验结果如图 2所示。 从图 2中可以看出 ,
PstⅠ和 MseⅠ 的用量以 2. 0～ 3. 0μL较为合适 ,若用量小于 2. 0μL,则酶切不充分 ,用量为 2. 0和 3. 0μL的酶
切效果基本一致 ,从药品的经济因素考虑 ,选用 2. 0μL较为适宜。
2. 2. 3　样品 DNA用量
样品 DNA用量为 100～ 500 ng时 ,其扩增效果基本一致 ,考虑到 DNA太少会影响实验结果 , DN A太多又
会消耗较多的内切酶和连接酶 ,所以模板 DNA的用量以 200 ng为最佳。
2. 3　预扩增体系结果分析
预扩增引物用量共设 3个梯度 ,分别为 0. 5、 1. 0、 1. 5μL。电泳结果如图 3所示。图 3表明: 3个梯度的扩增
效果基本一致 ,引物用量以 1. 0μL为宜。
36 经　　济　　林　　研　　究 第 26卷　
泳道 1为 DN A mark er,泳道 2～ 4分
别为内切酶用量 1. 0～ 3. 0μL的酶
切结果。
Lane 1: DN A mark er; Lane 2～ 4:
result of res t riction enzym e diges tion
by endonuclease 1. 0- 3. 0μL.
图 2　内切酶用量梯度实验结果
Fig. 2　 Result of endonuclease
gradient experiment
泳道 1为 DN A Marker,泳道 2～ 4
分别为预扩增引物用量 0. 5、 1. 0、
1. 5μL的扩增结果
Lane 1: DN A marker; Lane 2～ 4:
resul t of pre-am plifi cation b y
primer 0. 5- 1. 5μL.
图 3　预扩增引物用量梯度实验结果
Fig. 3　 Result of pre-amplif ication
primer gradient experiment
A为预扩增产物的稀释倍数梯度实
验结果 ( 2次重复 ) , A1～ A5为预扩
增产物的稀释倍数分别为 5、 10、 15、
20、 25倍的选扩结果 ; B为选扩引物
用量梯度实验结果 ( 2次重复 ) , B1
～ B3为选扩引物用量分别为 0. 5、
1. 0、 1. 5μL的选扩结果。
A: result of diluted times g radient
experiment of p re-amplif ication
product ( 2 times ) ; A1- A5: dilu-
ted 5, 10, 15, 20, 25 t imes of p re-
ampli fication product; B: result of
ampli fication primer gradient ex-
perim ent ( 2 tim es ) ; B1- B3: am-
plifi cation p rimer 0. 5- 1. 5μL.
图 4　选择性扩增体系梯度实验
Fig. 4　Result of selective
amplif ication system
gradient experiment
2. 4　选择性扩增体系结果分析
预扩增产物的稀释倍数设 5个梯度 ,分别为 5、 10、 15、 20、 25倍 ;选扩引物用
量设 3个梯度 ,分别为 0. 5、 1. 0、 1. 5μL。选择性扩增体系梯度实验结果如图 4所
示。从图 4中可以看出 ,稀释 20、 25倍的扩增带 ( 4和 5)清晰、明亮 ,效果较好。选
扩引物用量以 1. 0～ 1. 5μL为最佳 ,从药品的经济因素考虑 ,以 1. 0μL为宜。
3　结论与讨论
3. 1　人心果 AFLP标准化实验体系
根据分析结果 ,人心果 AFLP实验反应体系的优化体现在以下几个方面:酶
切时间从 2 h延长到 5 h,增加限制性内切酶用量 ,样品 DNA用量从 500 ng减少
为 200 ng ,以使酶切反应更为充分。 预扩增产物稀释倍数以 20、 25倍为宜。 PCR
反应中 ,预扩增循环次数增加到 30轮 ,并在预扩、选扩的最后一轮增加 5 min的
延伸时间。最终确定的人心果 AFLP标准化实验体系如下。
( 1)酶切—连接体系:总体积为 20. 0μL,含样品 DNA 2μL( 200 ng ) , PstⅠ /
MseⅠ 酶 ( 4 U· μL- 1 )各 2μL, PstⅠ /M seⅠ接头各 1. 0μL, 10× Reaction buffer
2. 5μL, 10 mM ATP 2. 5μL, T4 Ligase( 3 U·μL- 1 ) 1μL, AFLP-Water 6μL。
将上述混合液置于 0. 5 mL的离心管中 ,混匀离心数秒 , 37℃保温 5 h, 8℃保温
4 h, 4℃过夜。
( 2)预扩增体系: 总体积为 25. 0μL,包括模板 DNA 2μL, Pre-ampmix 1μL,
DN TPs 0. 5μL, 10 XPCR buf fer 2. 5μL, Taq酶 ( 2 U· μL- 1 ) 0. 5μL,超纯水
18. 5μL。混匀离心数秒 , PCR扩增程序为: 94℃、 2min后 ,按照 94℃、 30 s, 56℃、
30 s, 72℃、 80 s的参数循环 30轮。最后 , 72℃、 5 min, 4℃保温。用 TE buffer按
1∶ 20的比例稀释样品 , - 20℃条件下保存备用。
( 3)选择性扩增体系: 预扩增产物稀释 20倍 ,反应体积为 25. 0μL,包括预扩
增稀释样品 2μL, 10 XPC buf fer 2. 5μL, dN T Ps 0. 5μL, PstⅠ ( 5 ng· μL- 1 )
1μL, M seⅠ ( 30 ng·μL- 1 ) 1μL, Taq酶 ( 2 U· μL- 1 ) 0. 5μL,超纯水 17. 5μL。
混匀离心数秒 ,按照 94℃、 30 s, 65℃、 30 s, 72℃、 80 s的参数进行第 1轮扩增 ;以
37第 2期 文亚峰等:人心果 AFLP反应体系的建立与优化
后每轮循环温度降低 0. 7℃ ,共设 12个循环 ;接着按 94℃、 30 s, 55℃、 30 s, 72℃、 80 s的参数扩增 23个循环。最
后 , 72℃、 5 min, 4℃保温。
3. 2　关于人心果基因组 DNA的提取
利用改良 CTAB法提取到较高浓度和纯度的人心果基因组 DNA。提取过程中 ,有如下两点比较重要。一
是提取材料的选择。有些人心果品种刚发出来的嫩叶呈淡红色 ,用它做实验材料 ,得到的 DNA量少且质量差 ,
最好选取红色褪去而呈淡绿色的叶片。二是要注意防止褐化。人心果叶片组织中富含胶液 ,何钢等人 [10 ]的研究
结果表明:人心果胶主要由蛋白质、酚类、萜烯类、糖、鞣质等物质构成 ,大量的酚类物质使得人心果 DNA在提
取时容易褐化 ,影响抽提质量。本实验在采用 CTAB抽提方法的基础上 ,采用两个步骤来防止氧化:首先 ,在叶
片研磨时就加入少量的 PV P-40以防止酚类物质在温育时氧化 ,其效果比提取缓冲液中加入 B-巯基乙醇的要
好 ;第二步是配制 DNA沉淀液 ,其中加入 B-巯基乙醇 0. 4 mm用于抗氧化 ,用沉淀液和无水乙醇反复 2次沉淀
DNA,抽提到的 DNA质量较好 ,无褐化现象 ,完全可以满足 AFLP的实验要求。
3. 3　关于酶切—连接的一步完成
传统的 AFLP实验流程中 ,酶切和连接两个反应是分两步进行的 ,因为所用内切酶和连接酶要求的最适温
度有所差别 ,分别为 37℃和 16℃ ,如果采用“一步法” ,可能会影响酶的活性。但是 ,根据 Applied Biosystems公
司 AFLP操作指南并参考有关研究者的经验 [11, 12 ] ,本次实验将酶切与连接两步合为一步进行 ,不仅减少了操作
程序 ,而且实验效果也相当不错。
3. 4　关于荧光 AFLP技术
在众多的分子标记技术中 , AFLP具有可靠性好、重复性高、多态性丰富、检测效率高诸多优点。 但是 ,
AFLP实验对 DNA质量的要求较高 ,反应体系的流程复杂 ,对不同的实验材料 ,反应体系也不尽相同。荧光
AFLP技术是当前新发展的分子标记方法 ,它克服了传统 AFLP制胶、跑胶、染色等复杂程序的缺点 , DN A扩
增产物在自动测序仪上扫瞄鉴定 ,带的式样是被电子捕获而用于分析的 ,类似于自动 DNA序列分析 ,大大提高
了检测片段的精度 ,使 AFLP技术自动、高效、灵敏而精确。但是 ,对于不同的材料和物种而言 , AFLP标准化体
系的确定依然非常重要 ,只有在选择并确定合适的因素和条件的基础上 ,才有可能得到较好的实验结果。
参考文献:
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[本文编校:伍敏涛 ]
38 经　　济　　林　　研　　究 第 26卷