全 文 ：收稿日期: 2004-01-06; 修回日期: 2004-03-24
基金项目: 科技基础性工作专项资金项目 ( 2001DEA10004) ; 农业部“九四八”项目 ( 2001-249)
通讯作者: 李怀方 ,教授 ,主要研究方向为植物病毒学以及生物信息学 ; E-mail: plpath@ cau. edu. cn
第一作者: 黄金光 ( 1973- ) ,男 ,山东莱阳人 ,助理研究员 ,中国农业大学植物病理系在读硕士 ,现工作单位:莱阳农学院教务处 ,莱阳
265200。
植物病理学报
AC TA PHYTOPATHOLOGICA SIN ICA　 34( 3): 215-220( 2004)
烟草花叶病毒丁香分离物的分离与鉴定
黄金光 1 , 邓丛良 1 , 范在丰1 , 田国忠 2 , 李怀方 1*
( 1中国农业大学植物病理系 , 北京 100094; 2中国林业科学院森林生态环境保护研究所 , 北京 100091)
摘要: 从表现花叶症状的丁香病株上获得一病毒分离物 ,其在电镜下为约 300 nm× 18 nm的杆状粒子 ;电泳分析表明感病
组织中 dsRNA大约为 6. 4 kbp,而其外壳蛋白分子量约为 17. 6 k Da。以上实验结果初步将该病毒分离物鉴定为烟草花叶病
毒属 ( Tobamovirus)。根据该属病毒复制酶基因序列设计通用引物 ,进行 RT-PCR检测 ,扩增出约 1 000 bp的预期特异片段
( GenBank AY566703)。将 PC R产物克隆后测序 ,序列分析表明 ,与从蚕豆中分离的 TMV-B株系序列 ( GenBank AJ011933. 1)
同源性为 99. 90%。根据烟草花叶病毒 ( Tobacco mosaic virus, TMV )的 RN A CP基因序列设计引物 ,进行 RT-PCR,扩增出
约 800 bp的预期特异片段 ( GenBank AY566702) ,序列分析表明 ,与 TMV-B株系序列 ( GenBank AJ011933. 1)同源性达
99% ,上述实验结果表明 ,该病毒分离物为 TMV。由于该分离物与 TMV-B在指示植物上的症状存在明显差异 ,所以 ,作者
把该分离物暂命名为 TMV-S。
关键词: 丁香 ; 烟草花叶病毒 ; 鉴定 ; 序列分析
Isolation and identification of Tobacco mosaic virus infecting Syringa oblate 　
HUANG Jin-guang
1
, DENG Cong-liang
1
, FAN Zai-feng
1
, T IAN Guo-zhong
2
, L I Huai-fang
1* 　
(1Depar tment of Plant Pa tho log y, China Ag ricultural Univ ersity, Beijing 100094, China; 2 Research Institute of For est
Ecolog y , Envir onment and Pro tection, Chinese Academy o f Fo rest ry , Beijing 100091, China)
Abstract: Rod-shaped virus particles about 300 nm× 18 nm were iso lated from Syringa oblate expressing
systemic mosaic in leaves. Th e double-st randed RN A pat ter n revealed one single band o f about 6. 4 kbp.
The v irus contained coat protein of approx imately 17. 6 kDa. Acco rding to these resul ts, the vi rus iso-
late w as identified as a member o f Tobamovirus. A pai r of primers w ere designed based on Tobamov irus
RNA RdRp gene, and a f ragment o f about 1 000 bp( GenBank AY566703) w as ampli fied by RT-PCR.
The PCR product was cloned and sequenced. The sequence shared 99. 90% homology wi th TMV-B
strain ( GenBank Accession No. AJ011933. 1) . Ano ther pair o f primers w as designed based on TMV
RNA CP gene. A fragment o f about 800 bp( GenBank AY566702) was ampli fied. The recombinant plas-
mid w as obtained and sequenced. The sequence shared 99% homology w ith TMV-B strain ( GenBank
Accession No. A J011933. 1) . CP gene sequence and amino acids shared 99. 37% , 100% homology wi th
TMV -B strain respectiv ely. On the basis o f above resul ts, the vi rus iso lated f rom S. oblate in Bei jing is
Tobacco mosaic virus ( TMV) .
Key words: Syringa oblate; Tobacco mosaic virus ( TMV ); identi fication; sequencing
中图分类号: S432. 41　　　文献标识码: A　　　文章编号: 0412-0914( 2004) 03-0215-06
　　丁香为木犀科丁香属 ,落叶灌木 ,是庭院绿化 的主要树种。该属植物在我国分布广泛 ,资源丰富 ,
DOI : 10. 13926 /j . cnki . apps . 2004. 03. 005
主要品种有紫丁香 ( Sy ringa oblate Lindl. )、朝鲜
丁香 ( Syringa diatata Nakai. )和洋丁香 ( Syringa
vulgaris L. )。现代研究表明 ,丁香叶是一种理想的
广谱抗菌药 ,以其为原料生产的胶囊和片剂治疗痢
疾和急性黄疸性肝炎 ,均收到较好的疗效 [1 ]。笔者
从症状表现为花叶的紫丁香叶片上获得一病毒分
离物并对其进行鉴定 ,首次分离鉴定出烟草花叶病
毒 ( Tobacco mosaic v irus , TMV) ,现将结果报道如
下。
1　材料与方法
1. 1　毒源的分离纯化
从北京市海淀区中国农业大学西区校园采集
到呈花叶症状的丁香叶片 ,经苋色藜 3次单斑分离
后 ,获得纯毒株 ,保存在普通烟上。
1. 2　寄主范围测定
采用汁液摩擦接种法 ,在 4科 16种植物 (表 )
上测定其寄主范围。接种的植物放在防虫温室里观
察症状。
1. 3　 dsRNA提取
参照牛建新等 [2 ]的方法提取发病组织的
dsRN A。
1. 4　电镜观察
取发病的普通烟嫩叶和丁香叶片 ,在灭菌的研
钵中研磨 , 3 000 r /min离心 3 min,上清液即为病
毒粗提液 ,用 2%磷钨酸负染 10 s,样品在 JEM -
100 cx II透射电镜下观察。
1. 5　血清学反应
参考 Barker的间接酶联免疫实验 ( ACP-
ELISA)
[3 ]。烟草花叶病毒 ( TMV)抗血清由本研究
室以烟草花叶病毒普通烟分离物为抗原制备并保
存。
1. 6　病毒提纯
主要参考吕典秋等的 PEG沉淀及差速离心方
法 [4 ]。 得到的病毒粗提液置于 20%的蔗糖垫上进
一步纯化。
1. 7　病毒核酸提取
根据 Dijkst ra等 [5 ]的方法 ,从纯化的病毒提取
核酸。
1. 8　病毒外壳蛋白分析 [6 ]
分离胶浓度为 12% ,电泳结束后用 0. 2%考马
斯亮蓝 R-250染色 ,甲醇冰乙酸脱色 ,标准分子量
是上海西巴斯生物技术开发有限公司制剂。
1. 9　病毒物理特性测定
主要参考王 杰等 [ 7]的方法。在枯斑寄主苋色
藜上检测病毒的侵染性 ,计算稀释限点和钝化温
度。
1. 10　植物总 RNA提取
参照 Wilkins等 [8 ]的方法 ,提取发病普通烟叶
片总 RNA。
1. 11　 RT-PCR实验
根据已报道的烟草花叶病毒属病毒复制酶基
因序列设计 ,并于上海申友公司合成如下 2个通用
引物。 TMV rpf引物: 5′-GGA ACA CAA TAG
CAA T TA CA-3′; TMV rpr引物: 5′-CCG CTC
TT T CTT TG A T AC CA-3′。根据已报道的烟草
花叶病毒 RNA CP基因序列设计并于赛百盛公司
合成如下 2个引物 , TMVmpf引物: 5′-AGT TG T
TGA TGA G TT CAT GGA-3′; TMV 3nr引物:
5′-CAA CCC TTC GAT TT A AGT GGA-3′。
以植物总 RNA和提纯病毒 RNA为模板 ,分
别用 TMVrpr、 TMV3nr引物作为反转录引物合
成 cDN A第 1链。 再分别以 2对引物进行 PCR。
1. 12　 PCR片段的克隆和序列分析
基因克隆、筛选、质粒提取均参照 Sambrook
等 [9 ]的方法进行。 回收的目的片段与克隆载体
pMD 18-T ( TaKaRa ) 连接并转化大肠杆菌
DH5α,经蓝白斑筛选 ,质粒 PCR验证。阳性克隆送
到上海申友公司测序 ,核苷酸序列分析用 BLAS T
和 DNAM AN 4. 0 ( Lynnon BioSof t )软件。
2　结果与分析
2. 1　寄主范围及症状
经汁液摩擦接种后 ,在供试的 4科 16种鉴别
216 植物病理学报 34卷
寄主中 ,该分离物侵染 2科 9种植物 (表 )。 在曼陀
罗和克利夫兰烟上 ,没有出现症状 ,但是血清学检
测发生阳性反应 ,说明为隐症带毒。 根据国际病毒
分类委员会第 7次报告 [ 10] ,黄瓜是 TMV鉴别寄
主 ,很容易侵染 ,但本实验接种 3次均未成功。
Table　 Symptoms induced in different plant
species by TMV-S and ACP-ELISA va-
lues obtained with TMV antiserum
Test plants Sym ptoms I / H*
Solanaceae
　
Lycopersicum
esculentum
-
　
1. 3
　
Nicotiana
tabacum
S /Mo /M
　
≥ 30. 2
　
N . glutinosa L /NL 5. 2
N . tabacum -
Xanthi nc
L /NL
　
12. 6
　
N . tabacum -
White Burley
L /NL
　
14. 5
　
Datura
stramonium
LS
　
10. 3
　
Capsicum
annuum
-
　
2. 1
　
N . clevelandii LS 9. 2
N . debney i S /M ≥ 30. 2
Physalis
f loridana
-
　
1. 8
　
Chenopodi-
aceae
Chenopodium
amaranticolor
L /CS
　
5. 7
　
C . quinoa L /CS 6. 2
Legumino sae Vigna sinensis - 0. 8
Phaseolus
aconitif olia
-
　
1. 3
　
Glycine max - 1. 8
Cu-
curibitaceae
Cucumis
sativas
-
　
1. 4
　
Oleaceae Syringa oblate S /M 1. 1
Note: L: local sym ptoms; S: s ystemic s ymptoms; CS: ch lorotic
spot; M: mosaic; Mo: mo tt le; N L: necrosis lesion; LS:
laten t sym ptoms; - : noinfection.
* : Indicates positiv e reaction ( absorbance at 405 nm≥ 3. 0) ; Ab-
sorbance of blank w el l is 0. 026; I /H= ( Absorbance of sample
- absorbance of blank w ell) / ( Absorbance of H- Absorbance
of blank w el l) .
2. 2　 dsRNA
提取病毒的 dsRN A, 0. 7%的琼脂糖凝胶电泳
检测显示一条带 ,根据 Lambda DN A /HindⅢ +
EcoRI,这条带大约 6. 4 kbp(图 1) ,与烟草花叶病
毒 ds RN A大小一致。
Fig. 1　 Electrophoresis pattern showing virus
dsRNA
Lane 1: DN A-marker ( Lambda DN A /Hin d III+ EcoR I
Lane 2: Virus dsRNA
2. 3　病毒物理特性测定
TMV-S的稀释限点为 10- 8 ,钝化温度为 96℃。
2. 4　电镜观察
感病的普通烟叶片汁液和丁香叶片汁液分别
经负染置透射电镜下观察 ,普通烟叶片汁液中可见
到大量短杆状病毒粒子 ,长度约 300 nm ,宽度约 18
nm (图 2) ,其中部分病毒粒子较短 ,很可能是研磨
过程中病毒粒子被折断造成的 ;而丁香叶片汁液中
只见到数量较少的杆状病毒粒子 (图略 )。说明在自
然寄主中病毒含量较低 ,在实验寄主普通烟上支持
更大量的病毒复制。
2. 5　血清学反应
间接酶联免疫实验表明 ,感病的丁香叶片与已
有 TMV抗血清呈阴性反应。汁液摩擦接种的指示
植物与 TMV抗血清反应结果 (表 )表明 ,系统侵染
的寄主支持更大量的病毒复制 , I /H值更高 ;局部
侵染的寄主 I /H值在 10左右 ;不侵染的寄主 I /H
值在 1左右。
2173期 黄金光 ,等 :烟草花叶病毒丁香分离物的分离与鉴定
Fig. 2　 Electron micrograph of virus particles
(× 21 000)
2. 6　病毒外壳蛋白分析
聚丙烯酰胺凝胶电泳结果显示 ,丁香分离物的
外壳蛋白分子量大约为 17. 6 kDa (图 3)。
Fig. 3　 Electrophoresis pattern of SDS-PAGE
showing virus capsid protein
Lane 1: Pr otein mo lecula r w eight standa rds
Lane 2: V irus coat pr otein
2. 7　RT-PCR实验结果
1%琼脂糖凝胶电泳检查 PCR扩增产物 ,从发
病的普通烟叶片及提纯病毒中均扩增出约 976 bp
目的片段 ( TMVrpf、 TMV rpr引物 ) (图 4) ,与预期
片段大小一致。从发病的普通烟叶片及提纯病毒中
均扩增出约 800 bp目的片段 ( TMVmpf、 TMV3nr
引物 ) (图 5) ,与预期片段大小一致 ,没有非特异性
DNA条带。
Fig. 4　 Electrophoresis pattern of RT-PCR pro-
ducts ( TMVrpf、 TMVrpr primer)
Lane 1: DN A-marker ( Lambda DN A /Hind III+ EcoR I)
Lane 2: The produc ts of RT-PCR from N . tabacum in-
fec ted by TMV
Lane 3: The products of RT-PCR fr om purified virion
Fig. 5　 Electrophoresis pattern of RT-PCR pro-
ducts ( TMVmpf、TMV3nr primer)
Lane 1: DNA-marker ( Lambda DNA /Hin d III+ EcoR I)
Lane 2: The products of RT-PCR from N . tabacum infec-
ted by TMV
Lane 3: The products of RT-PCR fr om purified virion
218 植物病理学报 34卷
2. 8　 PCR产物的克隆及序列分析
PCR扩增片段与克隆载体 pMD18-T连接并
转化大肠杆菌 DH5α,经筛选和用 Hin d III+ EcoR
I双酶切、质粒 PCR验证 ,分别获得含有插入片段
的阳性克隆 (图略 )。
复制酶基因部分序列分析结果表明 , 2个样品
(分别以植物总 RNA和提纯病毒为模板 PCR产
物 )测序结果一致 ,重组质粒插入片段全长为 957
nt (不包含人工合成引物 ) ( GenBank AY566703)。
对获得的核苷酸序列与已报道的 TMV核苷酸序
列同源性比较表明 ,它们之间的同源性介于
91. 00% ～ 99. 90%之间 ;与周雪平等 [11 ]报道的从
蚕豆中 分离 的 TMV-B株 系序 列 ( GenBank
A J011933. 1)同源性最高 ,达 99. 90% ,仅有一个核
苷酸的差异。 CP基因及 3′部分序列分析结果表
明 , 2个样品重组质粒插入片段序列一致 ,全长为
773 nt (不 包 含 人 工 合 成 引 物 ) ( GenBank
AY566702) ,其中包括完整的 CP基因序列。对获
得 的 全 长 核 苷 酸 序 列 与 已 报 道 的 TMV
核苷酸序列同源性比较表明 ,它们之间的同源
性介于 97%～ 99%之间 ; 与 TMV-B 株 系序 列
( GenBank AJ011933. 1)的同源性最高 ,达 99% ,
其中 CP基因核苷酸同源性达 99. 58% ,仅有 2个
核苷酸的差异 ,氨基酸同源性为 100%。
3　结论与讨论
通过生物学、电镜观察、血清学、病毒外壳蛋白
以及分子生物学实验等研究表明 ,引起丁香花叶的
病 毒分离物为烟草花叶病毒 ( Tobacco mosaic
v irus, TMV )。
烟草花叶病毒寄主范围广 ,可侵染 30科 199
种植物 [12 ] ,但是侵染木犀科丁香属丁香 ,这是国内
外首次报道。
TMV -S与 TMV-B株系的复制酶与 CP基因
的序列同源性很高 ,但是 ,在生物学症状上表现出
明显的差异。TMV -S不侵染番茄 ,而 TMV -B侵染
番茄表现轻花叶 ; TMV-S侵染普通烟 ,早期为斑
驳 ,后期为系统花叶症状 ,而 TMV-B引起普通烟
花叶症状 ; TMV-S引起白肋烟局部坏死 ,而
TMV -B在白肋烟上为系统花叶症状 ; TMV-S侵
染苋色藜和昆诺藜引起局部褪绿斑症状 ,而 TMV -
B引起局部坏死症状 ;在辣椒上 , TMV -S不侵染 ,
而 TMV-B在接种叶表现枯斑 ,在上部叶表现系统
花叶。 而且 TMV-S体外抗性要比 TMV-B强 ,如
TMV-S体外钝化温度为 96℃ ,而 TMV-B体外钝
化温度为 85～ 90℃ [13 ]。 TMV株系的划分没有明
确统一的标准 ,已经划分的株系大多依据生物学症
状 ,根据 TMV-S的特点 ,作者将其暂命名为 TMV
丁香分离物。
血清学研究表明 ,该病毒分离物在丁香叶片中
与 TMV抗血清无血清学关系 ,而该病毒分离物接
种到指示植物 (重复 4次 ) ,出现症状后 , ACP-
ELISA表明: 该病毒与 TMV抗血清有血清学关
系。初步分析原因为:从生物学症状表现及电镜观
察可以得出丁香叶片中 TMV病毒含量很低 ,而血
清学实验检测浓度下限为 1～ 10 ng /mL,如果低于
这个临界值 ,可能无反应。
丁香叶中含有丰富的有机酸、苷类成份及生物
碱等有机物质 ,具有广谱抗菌和抗病毒作用 [ 14 ] ,而
烟草花叶病毒是一种侵染性极强的植物病毒。发病
的丁香叶片表现轻微的斑驳症状 ,而且在植株上仍
旧存在健康的叶片 ,说明丁香中存在抗病毒的物
质。刘 洪等 [15 ]认为 ,丁香水煎剂有明显抑制人巨细
胞病毒 ( HCMV)的增殖作用。 目前高等植物对病
毒产生抑制作用的机理还不完全清楚 ,但从现有的
报道结果来看 ,天然抑制剂主要是使病毒粒子的蛋
白凝聚和蛋白合成受阻 ,从而使病毒不能进行复制
增殖。 丁香与 TMV的互作 ,为我们研究病毒致病
机理提供了很好的材料 ,丁香对 TMV的抑制作用
仅限于初步了解 ,其真正的作用机理还需要进行深
入细致的研究。
丁香是一种优美的庭院观赏植物和药用植物 ,
被 TMV侵染后 ,降低了其观赏价值和经济价值。
TMV侵染性强 ,可通过嫁接、修剪等农事操作传
染 ,因此 ,生产上严格管理操作是十分必要的。
参考文献
[1 ]　王 迪 , 张贵军 , 李仁郁 . 黑龙江省丁香属植物药资
源研究 [ J]. 中医药信息 , 1985, 16( 3): 32.
[2 ]　牛建新 , 李东栋 . 葡萄病毒病的双链 RN A( ds RN A)
检测技术研究 [ J]. 果树学报 , 2002, 19( 3): 149-
152.
[3 ]　 Ba rker I. Development and routine use of EL ISA in
2193期 黄金光 ,等 :烟草花叶病毒丁香分离物的分离与鉴定
plant v irus diagno sis pesticide [ J]. Science, 1989,
26( 3): 319- 320.
[ 4]　吕典秋 , 李学湛 , 何云霞 , 等 . 烟草花叶病毒 ( TMV )
和马铃薯 X病毒 ( PVX )的提纯及抗血清的制备 [ J].
中国马铃薯 , 2000, 14( 4): 212- 215.
[ 5]　 Dijkst ra J, De Jager C P. RN A ex tr action from puri-
fied v irus pa rticles [ A ]. Practica l Plant V iro lo gy ,
Pro toco ls and Exercises [ M ]. Heidelbe rg , Ge r-
many: Springer-Ve rla g , 1998. 308- 311.
[ 6]　周顺伍 . 生物化学实验技术 [ M ]. 北京: 北京农业
大学出版社 , 1991. 96- 106.
[ 7]　王杰 , 张大伟 , 范卫红 , 等 . 侵染西瓜的烟草花叶病
毒 ( TMV )的生物学种类鉴定 [ J ]. 安徽农业科学 ,
2003, 31( 6): 972- 974, 982.
[ 8 ]　 Wilkins T A , Smar t L B. Isolation of RNA fr om
plant tissue [ A ]. K rieg P A. A Labo ra tor y Guide to
RNA: Iso la tion, Ana ly sis and Synth esis [ M ]. New
Yo rk: Wiley-Liss Inc. , 1994. 21- 41.
[ 9]　 Sambrook (萨姆布鲁克 ) J, Fritsch (弗里奇 ) E F,
Mania tis (曼尼阿蒂斯 ) T.金冬雁 , 黎孟枫等译 . 分
子克隆实验指南 . 第 2版 [ M ]. 北京: 科学出版社 ,
1992.
[10 ] International Committee on Taxonomy of V iruses
( ICTV ). The Univ ersal V irus Database based on
the seventh r epo r t o f the ICTV [ R ]. Canbe rra
( Australia ): Inte rnationa l Union of Microbio log y
Society , 2000.
[11 ] Zhou X P, Xue C Y , Chen Q , et al. Complete nu-
cleotide sequence and genome o rganiza tion of tobacco
mosaic v irus isolated from Vicia f aba [ J]. Science in
China ( Series C) , 2000, 43( 2): 200- 208.
[12 ] Zaitlin M H, Isra el W . Tobacco mosaic vir us ( type
strain) [ A ]. CMV / AAB Description of Plant V iru-
ses. No. 151 [ M ]. Kew , Sur rey , UK: Common-
w ealth Mycological Institute o f Applied Biolog ists,
1975.
[13 ] 周雪平 , 张龙存 , 陈集双 , 等 . 侵染蚕豆的烟草花叶
病毒研究 [ J]. 中国病毒学 , 1995, 10( 1): 81- 85.
[14 ] 李永吉 , 吕邵娃 , 王艳宏 , 等 . 丁香叶药用研究进展
[ J]. 中医药信息 , 2003, 20( 1): 22- 24.
[15] 刘 洪 , 貌盼勇 , 鞠连才 , 等 . 中药丁香体外抑制人巨
细胞病毒作用研究 [ J]. 解放军医学杂志 , 1997, 22
( 1): 73.
责任编辑:林春芽
220 植物病理学报 34卷