全 文 ：基金项目:国家自然科学基金资助项目(81102500);中央高校基本科研业务费专项资金资助:浙江大学基本科研业务费专项资金(5A7000*
172210121 /023);浙江省医药卫生平台骨干人才计划(2013ＲCA015);浙江省中医药科学研究基金计划(No． 2011ZB073)
作者简介:楼燕，女，博士后 研究方向:药物代谢与药物代谢动力学 * 通讯作者:曾苏，男，教授，博士生导师 研究方向:药物代谢与
药物分析 Tel /Fax:(0571)88208407 E-mail:zengsu@ zju. edu. cn
高效液相色谱-质谱法测定大鼠尿、粪便中狼毒色原酮的含量及其排泄
研究
楼燕1，2，郑金琪3，胡海红2，王临润1，张幸国1，胡云珍1，曾苏2* (1. 浙江大学医学院附属第一医院，杭州，310000;2. 浙江大
学药学院，杭州 310058;3. 浙江省食品药品检验研究院，杭州，310004)
摘要:目的 建立大鼠尿、粪便中狼毒色原酮含量测定的方法，并考察其排泄特征。方法 采用高效液相色谱-质谱联用法测
定给药后大鼠尿、粪中狼毒色原酮的含量，分别计算狼毒色原酮在尿、粪便中的累积排泄量及排泄率。色谱条件:XbridgeTM
C18(2. 1 mm × 50 mm，3. 5 μm，Waters柱，流动相为 0. 1%甲酸甲醇-0. 1%甲酸水溶液梯度洗脱，流速 0. 4 mL·min
－1，电喷雾
型质谱检测器，采用 MＲM方式同时进行测定;用于定量分析的离子反应分别为:狼毒色原酮(m/z 543. 3→198. 9)，瑞舒伐他
汀(m/z 481. 9→258. 3)。结果 在 8 ～ 6 400 ng·mL －1狼毒色原酮在尿液和粪便复溶液中线性良好(r2≥ 0. 999 5，n = 5)，最
低检测限为 4 ng·mL －1。低、中、高浓度的质控样品日内、日间精密度和准确度均符合要求。灌胃给予狼毒色原酮后 48 h 的
尿、粪便中累积排泄率分别为(1. 84 ± 0. 290)%、(41. 5 ± 6. 917)%。结论 所建立的分析方法准确、灵敏、快速，符合生物样品
分析要求，适用于粪便、尿液中狼毒色原酮的分析。排泄实验结果表明，粪便是狼毒色原酮的最主要的排泄方式。
关键词:狼毒色原酮;排泄动力学;大鼠;粪便;尿液;高效液相色谱-质谱法
doi:10. 11669 /cpj. 2014. 01. 019 中图分类号:Ｒ917 文献标志码:A 文章编号:1001 － 2494(2014)01 － 0068 － 08
Determination of Chamaechromone in Ｒat Urine and Feces by HPLC-MS and the Excretion Study
LOU Yan1，2，ZHENG Jin-qi3，HU Hai-hong2，WANG Lin-run1，ZHANG Xing-guo1，HU Yun-zhen1，ZENG Su2*
(1. The First Affiliated Hospital，College of Medicine，Zhejiang University，Hangzhou 310000，China;2. Department of Pharmaceutical
Analysis and Drug Metabolism，College of Pharmaceutical Sciences，Zhejiang University，Hangzhou 310058，China;3. Zhejiang Insti-
tute for Food and Drug Control，Hangzhou 310004，China)
ABSTＲACT:OBJECTIVE To develop a new method for the determination of chamaechromone in urine and feces of rats and inves-
tigate its excretion characteristics. METHODS A liquid chromatography tandem mass spectrometry (LC-MS)method was devel-
oped. Chromatographic separation was performed on XbridgeTM C18 column (2. 1 mm × 50 mm，3. 5 μm)with linear gradient elution u-
sing water and methanol，both of which were acidified with 0. 1% aqueous formic acid. The flow rate was 0. 4 mL·min －1. Detection
was performed on a triple-quadrupole tandem mass spectrometer using positive ion mode electrospray ionization (ESI)in multiple reac-
tion monitoring (MＲM)mode. The monitored MS /MS ion transitions were m/z 543. 3→198. 9 and 481. 9→258. 3 for chamaechromone
and rosuvastatin，respectively. ＲESULTS Good linearity was observed over the concentration range of 8 － 6 400 ng·mL －1 in 0. 1
mL of both rat urine and feces. The limit of detection (LOD)was 4 ng·mL －1. The intra-assay and inter-assay variabilities were less
than 14% in both urine and feces. Cumulative urinary and fecal excretion ratios within 48 h at a dose of 100 mg·kg －1 after oral ad-
ministration of chamaechromone accounted for (1. 84 ± 0. 290)% and (41. 5 ± 6. 917)% of the dose respectively. CONCLUSION
This method shows excellent sensitivity， precision， and accuracy， and is successfully applied to evaluate the excretion of
chamaechromone in urine and feces of rats. The results indicate that feces are the major excretion route of chamaechromone after oral
administration. And the most efficient excretion happens in 12-24 h after administration.
KEY WOＲDS:chamaechromone;excretion;rat;fece;urine;HPLC-MS
狼毒是传统有毒中药，临床使用已有悠久的历
史，作为有毒中药收载于 2010 年版《中国药典》［1］，
其基源为大戟科植物狼毒大戟(Euphorbia fischriana
Steud. )或月腺大戟(Euphorbia ebracteolata Hayata. )
或瑞香科植物瑞香狼毒(Stellera chamaejasme L. )的
根。狼毒的功效有破积聚，下气行水，杀虫解蛊毒;
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主治寒热水气、肿胀，痰饮咳逆，恶疮鼠瘘，外用疗疥
癣。现代药理研究表明，瑞香狼毒具有抗病毒作
用［2-3］，抗肿瘤作用［4］，抗菌活性［5］，免疫抑制活
性［6］和杀虫活性［7-8］。
研究发现，黄酮类化合物是瑞香狼毒的主要毒
活性成分，狼毒色原酮是双黄酮类化合物，是瑞香狼
毒中的主要成分之一［9］。药理研究表明，狼毒色原
酮的生物活性与瑞香狼毒的临床应用基本一致。已
有文献［3，8］报道狼毒色原酮具有抗乙肝病毒
(HBV)活性和杀虫活性。迄今为止，现有的文献
［3，9-10］主要集中于化学成分和药理活性的研究，
较少涉及狼毒及其主要成分狼毒色原酮的体内吸
收、排泄研究。在前期研究中已经进行了大鼠口服
和静注狼毒色原酮后血中药物动力学行为，获得其
药物动力学参数及其生物利用度等信息［11］，又研究
了狼毒色原酮在大鼠体内的代谢情况，并用肝微粒
体、肠道菌群等体外代谢模型解释了可能的代谢机
制，从研究结果推测狼毒色原酮在体内发生代谢，主
要的代谢途径是羟基化、甲基化、葡萄糖醛酸化、乙
酰化、去羟基化和降解反应［12］。本实验建立了测定
SD大鼠尿样、粪便中狼毒色原酮的 HPLC-MS 方法，
并将该方法应用于狼毒色原酮的排泄研究，结合前
期的研究结果，探讨狼毒色原酮在大鼠体内的吸收、
代谢、排泄情况，为狼毒色原酮及中药瑞香狼毒的深
入开发提供参考。
1 实验仪器和材料
1. 1 药品与试剂
狼毒色原酮由本实验室制备分离得到，内标瑞舒
伐他汀(中国药品生物制品检定所，纯度均 ＞99. 0%)，
结构见图 1。甲醇，乙腈，冰醋酸为色谱纯。超纯水
(18. 2 MΩ)由本实验室 ELGA-purelab Ultra system
(High Wycombe，UK)净水装置制备得到。
1. 2 仪器与设备
Waters Acquity超高效液相色谱仪(美国 Waters
公司)，自动进样器 (美国 Waters 公司)，TQD 三重
四极杆串联质谱仪，配备电喷雾离子源(美国 Wa-
ters公司)，MassLynx V4. 1 数据采集和定量处理软
件(美国 Waters公司)，AL104 分析天平［梅特勒-托
利多仪器(上海)有限公司］，Eppendorf 5415D 离心
机(德国 Eppendorf 公司)，XW － 80A 旋涡混合器
(上海医科大学仪器厂)，纯水仪(PUＲELAB Ultra
Genetic，英国 ELGA公司)，制冰机(AF100，Scotsman
公司)。
图 1 狼毒色原酮和瑞舒伐他汀的化学结构式
Fig. 1 Chemical structures of chamaechromone and rosuvastatin
1. 3 实验动物
Sprague-Dawley 大鼠，雄性，体重 200 ～ 220 g
(浙江省医学科学研究院实验动物中心)，购买后进
行适应性饲养 48 h。严格按照实验动物的要求及浙
江大学动物饲养规则饲养和管理实验动物。实验前
禁食 12 h，期间自由饮水。
2 实验方法
2. 1 色谱条件
色谱柱:XbridgeTM C18色谱柱(2. 1 mm ×50 mm，
3. 5 μm;Waters 公司);流动相:A:甲醇(0. 1%甲
酸)，B:水(0. 1%甲酸)，洗脱程序为:1 min 5% A;5
min 90%A;5. 5 min 90% A;5. 6 min 5% A;6. 0 min
5%A;流速:0. 4 mL·min －1。
电喷雾离子源 (ESI 源)，毛细管电压:1. 8 kV，
取样锥孔电压:27 V，提取锥孔电压:3 V，ＲF透镜电
压:0. 1 V;源温度:110 ℃;脱溶剂气(N2)流速和温
度分别为:550 L·h －1和 350 ℃;锥孔气流速为 50
L·h －1;正离子方式检测;采用 MＲM 方式同时进行
测定;用于定量分析的离子反应分别为:狼毒色原酮
(m/z 543. 3→198. 9)，瑞舒伐他汀(m/z 481. 9→
258. 3)，Argon (99. 999 9%)作为碰撞气，流速为
0. 12 ～ 0. 14 L·h －1;碰撞电压为 12 eV。碰撞诱导
解离(CID)电压为 10 eV(狼毒色原酮)和 30 eV(内
标)，扫描时间为 0. 2 s。
2. 2 相关溶液的配制
2. 2. 1 狼毒色原酮给药溶液 精密称取 200 mg 的
狼毒色原酮，溶解于 1 mL 的无水乙醇中，然后用含
3‰ CMC-Na的溶液稀释至 20 mL，配制成质量浓度
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为 10 mg·mL －1的给药溶液。
2. 2. 2 标准工作液和质控样品的配制 狼毒色原
酮标准储备液:精密称取狼毒色原酮样品，置于 5
mL棕色量瓶中，甲醇溶解，定容至刻度，摇匀，得
1. 60 mg·mL －1的标准储备液，－ 20 ℃保存。
瑞舒伐他汀(内标)标准储备液:精密称取瑞舒
伐他汀标准品，溶于 1 mL 甲 醇 中，得 25. 0
mg·mL －1标准储备液，－ 20 ℃保存。临用现配成
125 ng·mL －1的甲醇溶液。
①尿液中相关试剂的配制:取健康 SD 大鼠，置
于代谢笼中，收集空白尿液，取 1 mL尿液样品，加入
1 mL乙酸乙酯提取，涡旋 5 min，13 000 r·min －1离
心 20 min，取上清液，浓缩至干，加 100 μL 甲醇复
溶，－ 20 ℃保存。
狼毒色原酮尿药浓度测定标准对照液:分别精
密量取储备液适量，用甲醇逐级稀释成 6 400，
5 120，3 200，640，320，64，32，16，8 ng·mL －1的
标准溶液，－ 20 ℃保存。
狼毒色原酮尿药浓度测定质控样品(QC):取质量
浓度为51 200，6 400，120 ng·mL －1的标准对照液各10
μL分别加入 90 μL的空白尿液中，涡旋混匀，配成质
量浓度为 5 120，640，12 ng·mL －1的质控样品。
② 粪便中相关试剂的配制:取健康 SD大鼠，置
于代谢笼中，收集空白粪便，风干，粉碎后称重，取
0. 1 g 粪便加入 5 mL 甲醇超声提取 3 次，每次 30
min，13 000 r·min －1离心 10 min，取上清液，离心浓
缩至干，加 1 mL甲醇复溶，－ 20 ℃保存。
狼毒色原酮粪便浓度测定标准对照液:分别精
密量取储备液适量，用甲醇逐级稀释成 6 400，
5 120，3 200，640，320，64，32，16 ng·mL －1的标
准溶液，－ 20 ℃保存。
狼毒色原酮粪便浓度测定 QC:取质量浓度为
51 200，6 400 ，120 ng·mL －1的标准对照液各 10
μL，分别加入 90 μL 的空白粪便甲醇溶液中，涡旋
混匀，配成质量浓度为 5 120，640，12 ng·mL －1的
质控样品。
2. 3 样品采集
健康雄性 SD大鼠 12 只，分为 2 组，分别放入代
谢笼中，禁食 16 h，自由饮水，收集空白尿样和粪便
样品后，大鼠灌胃给予狼毒色原酮(给药剂量为 100
mg·kg －1)后收集 0 ～ 4、4 ～ 8、8 ～ 12、12 ～ 24、24 ～
32、32 ～ 48 h 时间段内的尿液和粪便，尿液记录体
积，密封冷冻保存，待测。粪便烘干，称重，研成粉，
甲醇超声提取，取上层溶液，密封冷冻保存，待测。
2. 4 样品预处理
取 1 mL 尿液样品，加入内标溶液(125 ng·
mL －1)10 μL，涡旋混匀 2 min，加入 1 mL 乙酸乙酯
提取，涡旋 5 min，13 000 r·min －1离心 20 min，取上
清液，浓缩至干，加 100 μL 甲醇复溶，取上清液 7
μL用于 HPLC-MS分析待测。
取 0. 1 g粪便加入甲醇 5 mL超声提取 3 次，每
次 30 min，取上清液加入内标溶液(125 ng·
mL －1)，13 000 r·min －1离心 10 min，取上清液，离
心浓缩至干，加 1 mL甲醇复溶，取上清液 5 μL用于
HPLC-MS分析。
2. 5 数据计算与统计
累积排泄量 =∑ρn × Vn，累积排泄率 =∑ρn ×
Vn /给药剂量 × 100%。其中，n 代表收集样品的第
n小时，ρn为样品浓度，Vn为样品体积，实验数据均
由 Prism version 5. 0 处理。
3 实验结果
3. 1 专属性实验
分别取 6 只空白大鼠尿样或粪便、空白大鼠尿
样或粪便加狼毒色原酮标准对照液(加内标)和尿
液或粪便样品，按照“2. 4”项下方法处理后进样，色
谱图见图 2，3。狼毒色原酮的保留时间为 3. 68
min，内标保留时间为 3. 95 min，分离良好，且尿液或
粪便中的内源性杂质不干扰样品的测定，方法专属
性良好。
3. 2 线性范围及灵敏度
精密吸取狼毒色原酮对照品溶液适量，分别加
入大鼠空白基质(尿液和粪便提取液)，配制成不同
质量浓度的狼毒色原酮生物样品(尿液:6 400，
5 120，3 200，640，320，64，32，16，8 ng·mL －1;
粪便:6 400，5 120，3 200，640，320，64，32，16，8
ng·mL －1)，以上样品分别经过预处理后，吸取 7 μL
(尿样)或 5 μL(粪便复溶液的质量浓度为 100
mg·mL －1)进样分析，每个浓度平行测 6 次，记录色
谱图，以待测物浓度为横坐标，待测物与内标的峰面
积比值为纵坐标，用加权 1 /x2最小二乘法进行回归
运算，求得的直线回归方程即为标准曲线。典型的
标准曲线分别为 y = 0. 019 3x + 0. 029 6(尿样)，y =
0. 037 6x － 0. 416;相关系数 r2≥0. 999 5(尿样)，
r2≥0. 999 5(粪便复溶液)。在尿样和粪便复溶液
(100 mg·mL －1)中狼毒色原酮在其线性范围内线
性关系良好，检测限均为 4 ng·mL －1(n = 5，S /N ＞
3)，定量下限(LLOQ)均为 8 ng·mL －1(ＲE ＜ 20%，
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图 2 大鼠尿液中狼毒色原酮 MＲM图
A1、A2 －空白尿液;B1、B2 －空白尿样中加入内标和狼毒色原酮对照品;C －大鼠灌胃狼毒色原酮后的尿液
Fig. 2 MＲM chromatograms of chamaechromone in urine
A1，A2 － blank urine;B1，B2 － blank urine spiked with chamaechromone at LLOQ and rosuvastatin at 12. 5 ng·mL －1;C － urine sample at 8 － 12 h after oral administra-
tion of chamaechromone
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图 3 大鼠粪便中狼毒色原酮 MＲM图
A1、A2 －空白粪便;B1、B2 －空白粪便中加入内标和狼毒色原酮对照品;C －大鼠灌胃狼毒色原酮后的粪便
Fig. 3 MＲM chromatograms of chamaechromone in feces
A1，A2 － blank feces;B1，B2 － blank feces spiked with chamaechromone at LLOQ and rosuvastatin at 12. 5 ng·mL －1;C － fecal sample at 8 － 12 h after oral administration
of chamaechromone
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ＲSD ＜ 20%，S /N ＞ 10)，线性范围均为 8 ～ 6 400
ng·mL －1，均符合分析方法确证的要求。
3. 3 准确度和精密度
取 QC样品，分别按照“2. 4”中尿液样品和粪便
样品的处理方法处理，进样测定，记录图谱，将测得
的峰面积按照随行测定的标准曲线计算得到实测浓
度，计算方法的日内准确度和精密度。采用相同的
方法，分别于 5 d 内测定 QC 样品的浓度，计算分析
方法的日间准确度和精密度。结果表明，方法的日
内、日间精密度和准确度均符合要求，见表 1，2。
3. 4 回收率实验
QC样品，按“2. 4”中尿液样品处理方法处理，
获得相应峰面积 UA1。同时另取大鼠空白尿样 1
mL，加入相应体积的不同浓度标准溶液，按“2. 4”中
尿液样品处理方法处理，获得相应峰面积 UA2。以
每一浓度 2 种处理方法的峰面积比值计算提取回收
率 U-ＲE(UA1 /UA2)。见表 3。
QC样品，按“2. 4”中粪便样品处理方法处理，
获得相应峰面积 FA1。同时另取大鼠空白粪便 0. 1
g，加入甲醇 5 mL 超声提取 3 次，每次 30 min，取上
清液加入内标溶液(125 ng·mL －1)和加入相应体
积的不同浓度标准溶液，13 000 r·min －1离心 10
min，取上清液，离心浓缩至干，加 1 mL甲醇复溶，取
上清液 5 μL 用于 HPLC-MS 分析，获得相应峰面积
FA2。以每一浓度 2 种处理方法的峰面积比值计算
表 1 狼毒色原酮在尿液中日内、日间的精密度和准确度实
验结果
Tab. 1 Intra-and inter-batch precision and accuracy for deter-
mination of chamaechromone in urine
Spiked
/ng·mL －1
Intra-batch precision and accuracy
(n =5)
Inter-batch precision and accuracy
(n =3)
珋x ± s ＲSD/% ＲE/% 珋x ± s ＲSD/% ＲE/%
12 11. 7 ±1. 5 13. 2 －2. 4 12. 5 ±1. 5 12. 4 4. 1
640 626. 3 ±38. 6 6. 2 －2. 1 630. 1 ±25. 3 4. 0 －1. 5
5 120 5 059. 6 ±223. 2 4. 4 1. 2 5 166. 8 ±235. 4 4. 6 0. 9
表 2 狼毒色原酮在粪便中日内、日间的精密度和准确度实
验结果
Tab. 2 Intra-and inter-batch precision and accuracy for deter-
mination of chamaechromone in feces
Spiked
/ng·mL －1
Intra-batch precision and accuracy
(n =5)
Inter-batch precision and accuracy
(n =3)
珋x ± s ＲSD/% ＲE/% 珋x ± s ＲSD/% ＲE/%
12 12. 4 ±1. 6 12. 6 3. 7 12. 4 ±1. 4 11. 7 2. 9
640 628. 6 ±53. 9 8. 6 －1. 8 606. 9 ±52. 7 8. 7 －5. 2
5 120 5 227. 0 ±244. 4 4. 7 2. 1 5 202. 2 ±284. 4 5. 5 1. 6
表 3 狼毒色原酮与内标在尿液和粪便中的回收率 . n = 6，
珋x ± s
Tab. 3 Ｒecovery for the assay of chamaechromone and IS in u-
rine and feces. n = 6，珋x ± s
ρ /ng·mL －1 U-ＲE /% F-ME /%
LDSYT
12 86. 7 ± 0. 32 90. 5 ± 1. 2
640 81. 2 ± 4. 9 99. 1 ± 2. 2
5 120 94. 1 ± 1. 3 97. 4 ± 1. 1
IS
12. 5 107. 5 ± 6. 3 109. 1 ± 5. 3
注:ME －基质效应;ＲE －回收率
Note:ME － matrix effects;ＲE － recovery
回收率 F-ＲE(FA1 /FA2)。见表 3。
3. 5 样品稳定性
分别考察未处理的尿、粪便样品室温放置 8 h
的稳定性，处理后的尿液、粪便样品于 20 ℃样品池
放置 24 h的稳定性，尿液、粪便样品经历 3 次冷冻-
解冻循环的稳定性和尿液、粪便样品于 － 20 ℃冷冻
放置 40 d的稳定性，结果见表 4 和表 5。
上述实验结果表明，测定大鼠体内狼毒色原酮
浓度的 HPLC-MS /MS方法专属性强、快速、灵敏，待
测物在大鼠尿液和粪便复溶液中的 LLOQ 均为 8. 0
ng·mL －1，样品分析时间仅为 6. 0 min。该方法经
过方法学验证，可用于狼毒色原酮在大鼠体内的排
泄动力学研究。
3. 6 狼毒色原酮在大鼠体内的排泄
大鼠随机分为 2 组，每组 6 只，灌胃给药 100
mg·kg －1狼毒色原酮。给药后，大鼠单独置于代谢
笼中，于给药前和给药后 0 ～ 4、4 ～ 8、8 ～ 12、12 ～
24、24 ～ 32、32 ～ 48 h 收集尿液和粪便，按“2. 4”项
下方法处理样品，并按“2. 1”项下条件进行测定。
大鼠给予狼毒色原酮后，在各时间点的尿液累积排泄
率曲线见图 4。灌胃给予狼毒色原酮 48 h内，大鼠尿
液中共回收到相当于给药剂量约(1. 84 ±0. 290)%的
狼毒色原酮，说明从尿液中排泄的量非常小，从排泄
速度看，给药 12 ～24 h 内，大鼠尿液中狼毒色原酮的
排泄速度较其他时间段快。在各时间点的粪便累积
排泄率曲线图和总排泄率见图 4。灌胃给予狼毒色
原酮 48 h内，大鼠粪便中共回收到相当于给药剂量
约 (41. 5 ±6. 917)%的狼毒色原酮。可见，狼毒色原
酮在大鼠体内主要从粪便排出体外，仅微量狼毒色原
酮(1. 84 ±0. 290)%从尿液排泄。
4 讨 论
狼毒色原酮是中药瑞香狼毒的主要成分，目前
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表 4 狼毒色原酮在尿液中的稳定性 . n = 5
Tab. 4 Stability of chamaechromone in urine. n = 5
ρ
/ng·mL －1
24 h(auto-sampler) 8 h(bench-top) 3rd freeze-thaw 40 d at －20 ℃
ρ /ng·mL －1 Accuracy /% ρ /ng·mL －1 Accuracy /% ρ /ng·mL －1 Accuracy /% ρ /ng·mL －1 Accuracy /%
12 11. 4 ±1. 1 94. 8 12. 6 ±0. 7 105. 3 11. 6 ±1. 0 96. 8 12. 8 ±0. 9 106. 7
640 628. 4 ±18. 1 98. 2 630. 8 ±12. 0 98. 6 622. 4 ±18. 7 97. 3 607. 4 ±23. 9 94. 9
5 120 5 193. 8 ±177. 2 101. 4 5 226. 6 ±114. 8 102. 1 5 103. 2 ±228. 6 99. 7 5 089. 4 ±182. 1 99. 4
表 5 狼毒色原酮在粪便中的稳定性 . n = 5
Tab. 5 Stability of chamaechromone in feces. n = 5
Spiked
/ng·mL －1
24 h(auto-sampler) 8 h(bench-top) 3rd freeze-thaw 40 d at －20 ℃
ρ /ng·mL －1 Accuracy /% ρ /ng·mL －1 Accuracy /% ρ /ng·mL －1 Accuracy /% ρ /ng·mL －1 Accuracy /%
12 11. 6 ±1. 7 96. 3 12. 5 ±1. 3 104. 2 11. 6 ±1. 7 96. 8 13. 0 ±1. 3 108. 2
640 632. 2 ±25. 8 98. 8 630. 4 ±19. 0 98. 5 626. 4 ±32. 5 97. 9 609. 8 ±33. 8 95. 3
5 120 5 193. 8 ±229. 1 101. 4 5 268. 6 ±157. 3 102. 9 5 143 ±369. 3 100. 4 5 095. 4 ±184. 5 99. 5
图 4 狼毒色原酮在大鼠体内的累积排泄量与时间曲线．
n = 6，珋x ± s
A －狼毒色原酮在大鼠体内的尿液累积排泄量与时间曲线;B －狼毒色原酮在
大鼠体内的粪便累积排泄量与时间曲线;C － 狼毒色原酮总排泄量与时间
曲线
Fig. 4 Excretion-time profile of chamaechromone. n = 6，珋x ± s
A － urinary excretion-time profile of chamaechromone;B － fecal excretion-time pro-
file of chamaechromone;C － total excretion-time profile of chamaechromone
国内外关于狼毒色原酮分析及定量方面的研究主要
是利用 LC-MS［9］、ＲＲLC-DAD［10］、ESI-TOF /MS［10］进
行狼毒色原酮在瑞香狼毒中的含量测定及利用
HPLC从植物中分离纯化［13］及应用 HＲ-ESMS、NMＲ
进行化合物结构鉴定。目前笔者尚未见有关狼毒色
原酮排泄方面的报道，本实验首次建立了双黄酮类
成分狼毒色原酮在大鼠尿、粪便中的 HPLC-MS 测
定方法，其灵敏度、准确度和精密度均符合要求，
实现了对尿、粪便中该成分的定量测定，并成功用于
狼毒色原酮的尿、粪便排泄研究。该实验为更好地
开发有毒中药狼毒及其临床应用提供药物代谢动力
学依据。
实验中采用的 HPLC-MS方法，对其进行了一系
列条件的优化。首先是提取条件的优化:本实验分
别考察了液-液萃取(LLE)和沉淀蛋白(PP)的方法
从大鼠尿液中提取狼毒色原酮和内标。结果表明，
液液萃取法能得到较少干扰的样品。其次，高效液
相色谱条件的优化:比较色谱柱 Acquity UPLCHSS
T3 (2. 1 mm × 100 mm，1. 8 μm，Waters)和
XbridgeTM C18(2. 1 mm ×50 mm，3. 5 μm，Waters)的
峰型、响应值以及保留时间等，结果发现后者在本实
验中更有优势。比较狼毒色原酮或者内标在二元溶
剂系统乙腈-水、甲醇-水中的离子响应情况，发现待
测物和内标在甲醇-水溶剂系统中的离子响应较好。
再者，MS条件的优化:通过比较狼毒色原酮和内标
在正、负电离模式下的离子响应情况，发现这 2 个化
合物在正离子模式下可以电离生成丰度较高的
［M － H］+准分子离子峰，而且背景干扰较小。同
时，在质谱参数的优化过程中，锥孔电压和脱溶剂气
·2412· Chin Pharm J，2014 January，Vol. 49 No. 1 中国药学杂志 2014 年 1 月第 49 卷第 1 期74
温度对离子响应起到了关键的作用，所以在仪器自
动调谐的基础上，通过手动调谐的方式又对这两个
参数进行了优化。
灌胃给药狼毒色原酮 48 h 内，大鼠粪便中共回
收到相当于给药剂量约(41. 5 ± 6. 917)%的狼毒色
原酮，大鼠尿液中共回收到相当于给药剂量约
(1. 84 ± 0. 290)%的狼毒色原酮，说明从尿液中排
泄的量非常小，粪便排泄是其主要排泄方式。本课
题组之前的研究结果显示，狼毒色原酮在大鼠体内
的绝对生物利用度较低，仅为 8. 9% ［11］，结合本实
验结果分析狼毒色原酮在大鼠体内的口服吸收较
差。据文献［14-15］报道，黄酮类化合物的肠壁渗透性
差或者在肠内发生大量的代谢反应会导致较低的生
物利用度。对于口服给药方式，灌胃给药后狼毒色
原酮在大鼠血浆中的药-时曲线呈现明显的双峰现
象［11］，在许多双黄酮药物的药动学研究中也曾报道
过这种双峰现象［16］，结合本实验的结果，分析可能
导致这种现象的原因如下:①狼毒色原酮的吸收发
生在小肠不同部位中;②双黄酮类化合物可能由于
分子量较大会存在肝肠循环［17-18］，狼毒色原酮可能
在胃部、十二指肠被快速吸收，随后被肝脏和胆囊吸
收，最后在回肠或者盲肠又被缓慢地吸收。
综上所述，所建立的分析方法准确、灵敏、重复
性好，适用于尿液、粪便中狼毒色原酮的分析;狼毒
色原酮在大鼠体内的排泄实验说明狼毒色原酮在大
鼠体内主要通过粪便排泄。
ＲEFEＲENCES
［1］ Ch. P(2010)Vol I(中国药典 2010 年版，一部)［S］. 2010:
269.
［2］ ASADA Y，SUKEMOＲI A，WATANABE T，et al. Stelleralides
A-C，novel potent anti-HIV daphnane-type diterpenoids from
Stellera chamaejasme L［J］. Org Lett，2011，13(11) :2904-
2907.
［3］ YANG G H，CHEN D F． Biflavanones，flavonoids，and couma-
rins from the roots of Stellera chamaejasme and their antiviral
effect on hepatitis B virus［J］. Chem Biodivers，2008，5(7) :
1419-1424.
［4］ WANG L P，DUAN H Y，WANG Y S，et al. Inhibitory effects
of Lang-du extract on the in vitro and in vivo growth of melanoma
cells and its molecular mechanisms of action［J］. Cytotechnolo-
gy，2010，62(4) :357-366.
［5］ SHI G L，LIU S Q，CAO H，et al. Acaricidal activities of ex-
tracts of Stellera chamaejasme against Tetranychus viennensis
(Acari:Tetranychidae) ［J］. J Econ Entomol，2004，97(6) :
1912-1916.
［6］ XU Z，QIN G W，LI X Y，et al. New biflavanones and bioactive
compounds from Stellera chamaejasme L［J］. Acta Pharm Sin
(药学学报)，2001，36(9) :669-671.
［7］ WANG Y W，ZHANG G Z，XU H H，et al. Biological activity
of extract of Stellera chamaejasme against five pest insects［J］. J
Insect Sci，2002，9(3) :17-22.
［8］ TANG X Ｒ，HOU T P. Isolation and identification of 2-isopropyl-
5-methylphenol from Stellera chamaejasme and its insecticidal ac-
tivity against Aphis craccivora and Pieris rapae［J］. Nat Prod
Ｒes，2011，25(4) :381-386.
［9］ SU X L，LIN Ｒ C，WONG S K，et al. Identification and charac-
terization of the chinese herb Langdu by LC-MS /MS analysis
［J］． Phytochem Anal，2003，14(1) :40-47.
［10］ ZHAO L，LOU Z Y，ZHU Z Y，et al. Characterization of con-
stituents in Stellera chamaejasme L. by rapid-resolution liquid
chromatography-diode array detection and electrospray ionization
time-of-flight mass spectrometry ［J］ . Biomed Chromatogr，
2008，22(1) :64-72.
［11］ LOU Y，HU H H，LIU Y，et al. Determination of chamaechromone
in rat plasma by liquid chromatography-tandem mass spectrometry:
Application to pharmacokinetic study［J］. J Pharm Biomed Anal，
2011，55(5):1163-1169.
［12］ LOU Y，ZHENG J Q，WANG B H，et al. Metabolites character-
ization of chamaechromone in vivo and in vitro by using ultra-per-
formance liquid chromatography /Xevo G2 quadrupole time-of-
flight tandem mass spectrometry［J］. J Ethnopharmacol，2013，
http:/ /dx. doi. org /10. 1016 / j. jep. 2013. 10. 027.
［13］ JIN C，MICHETICH Ｒ G，DANESHTALAB M. Flavonoids from
Stellera chamaejasme［J］． Phytochem，1999，50(3) :505-508.
［14］ WANG G N，PAN Ｒ L，LIAO Y H，et al. An LC-MS /MS meth-
od for determination of forsythiaside in rat plasma and application
to a pharmacokinetic study［J］． J Chromatogr B Analyt Technol
Biomed Life Sci，2010，878(1) :102-106.
［15］ DAI J Y，YANG J L，LI C. Transport and metabolism of fla-
vonoids from Chinese herbal remedy Xiaochaihu-tang across hu-
man intestinal Caco-2 cell monolayers［J］． Acta Pharm Sin(药
学学报)，2008，29(9) :1086-1093.
［16］ MICHLEＲ H，LAAKMANN G，WAGNEＲ H. Development of
an LC-MS method for simultaneous quantitation of amentoflavone
and biapigenin，the minor and major biflavones from Hypericum
perforatum L. ，in human plasma and its application to real blood
［J］． Phytochem Anal，2011，22(1) :42-50.
［17］ CATTEＲALL F，KING L J，CLIFFOＲD M N，et al. Bioavail-
ability of dietary doses of 3H-labelled tea antioxidants (+)-cate-
chin and (－)-epicatechin in rat［J］． Xenobiotica，2003，33
(7):743-753.
［18］ TSANG C，AUGEＲ C，MULLEN W，et al. The absorption，me-
tabolism and excretion of flavan-3-ols and procyanidins following
the ingestion of a grape seed extract by rats ［J］． Br J Nutr，
2005，94(2) :170-181.
(收稿日期:2013-09-13)
·3412·
中国药学杂志 2014 年 1 月第 49 卷第 1 期 Chin Pharm J，2014 January，Vol. 49 No. 1 75