全 文 ：中国特有极度濒危植物猪血木的保护遗传学研究
王　艇1 , 苏应娟1 , 叶华谷2 , 欧阳蒲月1 , 江　宇1 ,
孙宇飞1 , 陈国培1 , 邓　锋1 , 张宏达1
(1.中山大学生命科学学院 , 广东 广州 510275;
2.中国科学院华南植物园 , 广东 广州 510650)
摘　要:应用 RAPD标记分析了广东阳春八甲镇猪血木 Euryodendron excelsum H.T.Chang种群全部 14 个个体的遗
传变异和进化关系。23 个引物共检测到 156 个位点 , 其中多态位点 95 个 , 多态位点比率 60.90%。根据所得数据
求出的观察等位基因数为 1.609 0 、 有效等位基因数为 1.347 1、 Nei基因多样性为 0.199 3、 Shannon 多样性指数为
0.153 4。猪血木还保留有比较丰富的遗传多样性。对 Jaccard 相似性系数用 UPGMA 法进行聚类分析表明 , 猪血木
个体明显地分为2 个亚群 , 其中2 号个体同其他成员的遗传关系疏远。RAPD谱带表型的主成分分析 (PCA)支持
聚类分析结果。根据这些结果讨论了种群的管理和保护策略。
关键词:猪血木 Euryodendron excelsum H.T.Chang;种群变异;RAPD标记;保护策略
中图分类号:Q943;Q347　　文献标识码:A　　文章编号:0529-6579 (2005)01-0068-05
　　猪血木 Euryodendron excelsum H.T.Chang 为第
三纪孑遗植物 , 在分类学上隶属于山茶科 Theaceae
猪血木属 Euryodendron , 是我国特有的单属种 。
猪血木属高大乔木 , 它具有两性花及被毛的花药 ,
花柱与柱头简单 、 不分裂 , 芽体极短小 , 苞片细
小 、 绝不为长筒形 , 叶排成多列 , 边缘具锯齿 , 脉
序网状 。张宏达 1963年根据其形态结构特征建立
了猪血木种及猪血木属[ 1-3] 。该植物特产于广东和
广西 , 但由于生态环境的破坏 , 它目前在广西已绝
迹[ 4] 。它在广东的现有分布范围也极其狭窄 , 仅存
于阳春八甲镇。猪血木已被列为国家二级保护濒危
植物[ 5] ;然而 , 参照国际保护协会 (IUCN)的界定
标准 , 它实际上属于极度濒危物种[ 6] 。
形态学方面 , 猪血木兼具红淡比属 Cleyera 花
和柃属Eurya 叶的特征 , 故而对研究这些类群的亲
缘关系以及厚皮香亚科 Ternstroemoideae的系统发育
具有重要意义 。另外 , 猪血木的经济价值也很明
显 , 其木材纹理细而坚硬 , 色泽鲜艳 , 是家具和建
筑的良好用材[ 7] 。因此 , 如何拯救这一中国特有濒
危植物已成为许多人关心的课题。了解濒危物种的
遗传变异水平可以为制定保护策略 , 实施有效管
理 , 直至为最终建立可自我持续发展的种群提供必
需的基础资料[ 8] 。遗憾的是 , 针对猪血木现存种群
的遗传变异分析迄今未见报道 。
随机扩增多态性 DNA (RAPD)技术现已成为
在种内水平上检测物种分子多态性的常规方法 。它
方法简便 、 成本较低 、 无需预先知道特定旁侧区域
的序列信息 , 而且理论上它可以产生无限多的分子
标记从而鉴定出更多多态位点[ 9-11] 。
对珍稀濒危物种的研究 RAPD还具有一些潜在
优势 , 例如 , 由于对 DNA 样品的用量较低 , 即使
要对濒危物种的整个基因组都进行检测 , 所需的组
织 、细胞材料仍很有限 , 不至于对个体造成伤害。
此外 , RAPD片段属于选择上呈中性的标记[ 12] , 这
样群体遗传学上已经建立的许多理论和模型都可直
接用于 RAPD数据的解析 , 而不必顾虑选择的效
应[ 13] 。当然 , RAPD也有局限性 。技术上 , 其带型
可重复性欠佳;此问题可以通过反应条件的预研究
得到较好控制 。另外 , RAPD作为显性标记在数据
统计分析方面带来问题 , 但已被 Stewart和 Excoffier
建立的方法较好解决[ 14] 。
《中国珍稀濒危植物》 记录猪血木在广东阳春
八甲镇仅残存 2株[ 15] 。但到 2000年 , 仅存的 2株
又有1株死亡[ 4] 。幸运的是 , 叶华谷等在再赴广东
阳春的调查中 , 在八甲镇又新发现了 4 株猪血
木[ 4] 。近几年来 , 生态环境的逐步改善可能使猪血
木在当地的繁殖和更新压力得到一定缓解 , 猪血木
的个体数目有了进一步增加 。在开展本研究时 , 我
收稿日期:2004-06-22
基金项目:国家自然科学基金资助项目 (30271094);留学回国人员科研启动基金 (外教司留 [ 2003] 406 号)
作者简介:王艇 (1969年生), 男 , 副教授;E_mail:lsswt@zsu.edu.cn
　第 44 卷　第 1 期
2005年　1 月
中山大学学报 (自然科学版)
ACTA　SCIENTIARUM　NATURALIUM　UNIVERSITATIS　SUNYATSENI
Vol.44　No.1
Jan.　2005 　
们在阳春八甲镇共发现 14 株猪血木个体 。运用
RAPD标记 , 对这所有14个个体的分子遗传变异水
平和式样进行了研究 。
1　材料和方法
1.1　实验材料
分别采摘分布于广东阳春八甲镇的 14 个猪血
木个体的新鲜叶片 , 于-20 ℃保存 。
1.2　DNA提取
采用改进的十六烷基三甲基溴化胺 (CTAB)
法[ 16] 。测定紫外光吸收以确定 DNA 浓度和纯度 ,
琼脂糖凝胶电泳检查 DNA完整性。
1.3　引物的筛选
从上海生工公司合成的 137 个 10碱基随机寡
核苷酸引物中筛选出 50个有扩增产物的引物 , 完
成其中 23个扩增产物稳定 、 重复性好的引物的
RAPD扩增 , 引物序列见表 1。
表1　RAPD分析的随机引物及序列
Tab.1　Random oligonucleotide primers and
their sequences used for RAPD analysis
引物 序列 (5′※3′) 引物 序列(5′※3′)
S17 AGGGAACGAG S85 CTGAGACGGA
S103 AGACGTCCAC S120 GGGAGACATC
S121 ACGGATCCTG S151 GAGTCTCAGG
S155 ACGCACAACC S178 TGCCCAGCCT
S236 ACACCCCACA S240 CAGCATGGTC
S258 GAGGTCCACA S312 TCGCCAGCCA
S345 CTCCATGGGG S346 TCGTTCCGCA
S397 AGCCTGAGCC S463 CTGATACGCC
S471 AACGCGTCGG S501 TGCGGGTCCT
S506 GTCTACGGCA S512 ACAGGTGCGT
S1017 CAGTGGGGAG S1512 CTCCCAGGGT
S1518 GTGGGCATAC
1.4　RAPD扩增与检测
经预实验优化条件后确定反应体系为:总体积
25 μL , 其中 10×PCR 缓冲液 (500 mmol/L KCl ,
100 mmol/L Tris_HCl , 1.0%Triton X_100 , 20 mmol/
L MgCl2)2.5 μL , 引物 (1.5 μmol/L)0.3 μL ,
dNTPs (0.2 mmol/L)0.5 μL , 模板 2 μL (25 ng),
Taq酶 0.2μL (0.5U), 反应混合物用 20μL 石蜡油
覆盖。Taq酶和主要试剂购自上海生工公司。扩增
条件:94 ℃200 s预变性;94 ℃60 s , 36 ℃60 s;
72 ℃120 s , 40个循环;72 ℃延伸 10 min。所有反
应在 Gene Amp PCR System 2400 (Perkin Elmer
Corporation)上进行。扩增产物经 1.5%的琼脂糖凝
胶电泳检测 , 紫外灯下观察 、照相。
1.5　数据分析
在某一特定位点上 , 若扩增片段出现的频率小
于 0.99 , 则此位点称为多态位点。多态位点比率
即在所有检测位点中多态位点所占的比例 。
Shannon 多样性指数计算公式为:
H =-∑pi ln pi
其中 pi 为表型频率 , 即某一扩增带在第 i 个种群
中出现的频率。
利用 PopGen32[ 17] 软件计算观测等位基因数 、
有效等位基因数 、 基因多样度指数。
应用NTSYSpc2软件[ 18]进行聚类分析和主成分
分析 (PCA)。
2　结果
用 23个随机引物对阳春八甲镇猪血木种群 14
个个体的基因组 DNA 进行的 RAPD分析显示 (图
1), 每个引物检测到的位点数在 3 ～ 9个之间 , 扩
增片段长度介于 150 ～ 3 000 bp 。23个引物共检测
到 156个位点 , 平均每个引物检测到的位点数为
6.78 。23个引物中 , 除引物 S155 、 S1512外 , 其余
21个引物均能扩增出多态产物 , 总共检测到 95个
多态位点;多态位点所占比率为 60.90%。
图 1　用引物 S17对猪血木个体 (1-14)
扩增出的 RAPD带型
Fig.1　RAPD profile of Euryodendron excelsum
samples obtained with primer S17
M:100 bp ladder marker
根据所有引物检测到的数据求出的观察等位基因数
为 1.609 0 、有效等位基因数为 1.347 1 、 Nei基因
多样性为 0.199 3 、 Shannon多样性指数为 0.153 4。
至于由各引物扩增出的条带分别估算的相应值见表
2。
对 Jaccard相似性系数用 UPGMA法进行聚类分
析的结果 (图 2)表明 , 阳春八甲镇的猪血木个体
明显地分为 2个亚群 , 其中 2号个体同其他成员的
遗传关系疏远。
69　第 1 期 王　艇等:中国特有极度濒危植物猪血木的保护遗传学研究
表 2　猪血木种群的基因多样性
Tab.2　Gene diversity of the Euryodendron excelsum population
引物 位点数 多态位点数多态位点比率/ % 观察等位基因数 有效等位基因数 Nei基因多样性 Shannon 指数
S17 9 6 66.67 1.6667 1.3838 0.2269 0.2110
S85 9 8 88.89 1.8889 1.3982 0.2370 0.2221
S103 7 3 42.86 1.4286 1.2133 0.1286 0.1214
S120 6 2 33.33 1.3333 1.3024 0.1585 0.0694
S121 7 6 85.71 1.8571 1.4031 0.2427 0.2221
S151 6 2 33.33 1.3333 1.0717 0.0553 0.0911
S155 3 0 0.00 1.0000 1.0000 0.0000 0.0000
S178 9 9 100.00 2.0000 1.6729 0.3776 0.2738
S236 6 2 33.33 1.3333 1.3026 0.1583 0.0934
S240 8 4 50.00 1.5000 1.3104 0.1788 0.1262
S258 5 2 40.00 1.4000 1.1674 0.1141 0.1282
S312 5 4 80.00 1.8000 1.5195 0.2859 0.1260
S345 8 6 75.00 1.7500 1.5123 0.2997 0.2541
S346 8 8 100.00 2.0000 1.5113 0.2869 0.1980
S397 7 2 28.57 1.2857 1.2099 0.1205 0.0555
S463 5 4 80.00 1.8000 1.3102 0.2021 0.2141
S471 9 8 88.89 1.8889 1.3629 0.2072 0.1980
S501 8 5 62.50 1.6250 1.3914 0.2148 0.1522
S506 7 3 42.86 1.4286 1.1792 0.1075 0.1147
S512 5 3 60.00 1.6000 1.5403 0.2843 0.1097
S1017 8 4 50.00 1.5000 1.3246 0.1792 0.1305
S1512 4 0 0.00 1.0000 1.0000 0.0000 0.0000
S1518 7 4 57.14 1.5714 1.3727 0.2165 0.1277
所有引物 156 95 60.90 1.6090 1.3471 0.1993 0.1534
图 2　猪血木14个个体 Jaccard 相似性系数
经 UPGMA 法构建的树系图
Fig.2　UPGMA tree showing relationships among
14 individuals in Euryodendron excelsum established from
Jaccard similarity coefficients
　　图 3 是对 RAPD 谱带表型进行主成分分析
(PCA)获得的 3 维分布图 , 显示了个体间相似性
的格局 , 支持 UPGMA 聚类结果 。提取的前 3个主
成分 (PC1 、 PC2及 PC3)共代表着 54.7%的方差。
图 3　基于 RAPD表型特征的主成分分析 (PCA)
Fig.3　Plot of principal components ananlysis
(PCA)based on RAPD phenotypic characters
3　讨　论
采用分子标记技术研究山茶科植物种群遗传变
异的报道还相对很少 , 并且这些工作也多集中在具
重要经济价值的茶 Camellia sinensis 方面。例如 ,
Singh等应用 RAPD 标记分析印度喜玛拉雅生物资
源研究所茶种群发现 , 平均每个引物检测到 6.3个
70 中山大学学报 (自然科学版) 第 44 卷　
位点 , 所用 20 个引物中仅有 1 个引物能检测到 1
个多态位点 , 表现出极低水平的变异性[ 19] 。Kaudun
和Park对分布于韩国的 6个茶种群进行 RAPD分析
显示 , 40个能扩增出清晰谱带的引物中 , 只有 12
个引物能检测到共 25个多态位点;他们仅对这 12
个能扩增出多态性产物的引物所获得的谱带数据作
了进一步分析 , 发现多态位点比率介于 72%～
90%, Nei基因多样性取值范围为 0 ～ 0.5[ 20] 。本研
究对猪血木目前存于广东阳春八甲镇的 14株个体
的 RAPD分析表明 , 它还保留有比较丰富的遗传多
样性 。
一般认为 , 濒危物种所经历的个体数目遽减会
直接造成残留种群的遗传多样性丧失[ 6] 。根据中性
理论的推断 , 中性座位的遗传多样性同有效种群大
小呈正相关。种群大小受限时 , 遗传漂变将致使大
多数基因座位上等位基因被固定的概率增加[ 21] 。
因而小种群对遗传漂变的作用比大种群更为敏感 ,
尤其是稀有等位基因在小种群中丢失得更快 。
Limonium cavanillesii属极度特有植物 (现存种群的
所有 29 个个体生长在一个地点), Palacios 和
Gonzalez_Candelas 使用 11 个引物对该种群进行
RAPD分析 , 结果观察到的带型全部一致 , 没有检
测到遗传变异[ 22] 。台湾特有的珍稀蕨类植物伊藤
原始观音莲座蕨 Archangiopteris itoi在其原发现地的
“模式” 种群由于人为破坏已完全消失 。所幸的是 ,
在台湾北部的乌来又发现了该植物的另一残遗种
群。Hsu等通过研究这一新发现种群的所有 18 个
个体的 RAPD图谱 , 检测到低水平的变异性;所用
40个引物中 , 只有 1 个引物能扩增出多态产物 ,
共获得 6种谱型[ 23] 。但是 , 需要强调的是 , 并非
所有野生植物的种群大小和遗传多样性都具正相
关。加州扇叶棕榈 Washingtonia filifera 就是例
外[ 24] 。我们在猪血木中也检测到较高的遗传变异 。
这一方面可能是因为猪血木具有两性花 , 授粉率较
高[ 25] ;另一方面可能是因为历史上猪血木分布于
阳春八甲镇的种群具有丰富的遗传多样性 。据载 ,
阳春八甲的猪血木曾成片分布 , 直至 20世纪 50年
代大跃进时才被大量砍伐[ 25] 。
发现猪血木仍保留有较为丰富的遗传多样性无
疑对其现有种群的恢复和新种群的建立具有重要意
义。根据本研究结果 , 我们提出应该尽快在阳春八
甲镇建立保护区 , 对猪血木的 14株个体全部进行
原地保护 , 特别是对遗传关系相对孤立的 2号个体
应实施重点保护 。同时还应积极改善当地生境 , 推
进猪血木种质资源的收集和基因库的建立 , 加速开
展繁殖生物学 、 生理生态学研究 , 深入了解其生物
学特性 。在获得这些资料的基础上 , 再尝试将猪血
木引入新的栖息地 。
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Genetic Differentiation and Conservation of 14 Surviving Individuals of
Euryodendron excelsum Endemic to China
WANG Ting1 , SU Ying_juan1 , YE Hua_gu2 , OUYANG Pu_yue1 , JIANGYu1 ,
SUN Yu_fei 1 , CHEN Guo_pei 1 , DENGFeng1 , ZHANG Hong_da1
(1.School of Life Sciences , Sun Yat_sen University , Guangzhou 510275 , China;
2.South China Botanical Garden , Chinese Academy of Sciences , Guangzhou 510650 , China)
Abstract:RAPD markers were used to assess the genetic variations and the evolutionary relationships among all 14
individuals of a critically endangered Euryodendron excelsum (Theaceae)population remaining at Ba Jia Zhen ,
Yangchun , Guang dong , China.Twenty_three random primers detected 156 sites , out of which 95 (60.26%)were
polymorphic loci.Number of observed alleles was 1.6090 , number of effective alleles was 1.3471 , Nei s gene diversity
was 0.1993 , and Shannon index was 0.1534.Relatively high level of genetic variation was identified in E.excelsum.
UPGMA tree established from Jaccard similarity coefficients exhibited that 14 individuals were clustered into two
subgroups , showing that the number 2 plant was genetically distant from the rest of plants.The UPGMA clustering was
also lent support by a principle components analysis(PCA)of RAPD phenotypic data.Management and conservation
strategy of E .excelsum was proposed based on our results.
Key words:Euryodendron excelsum ;population genetic variation;RAPD markers;conservation management
72 中山大学学报 (自然科学版) 第 44 卷