全 文 ：收稿日期:2015 － 09 － 08;修回日期:2015 － 10 － 17
基金项目:贵中医科院内项目(［2014］30) ;贵州省国际科技合作计划项目(黔科合外 G字［2012］7006 号);贵州省科技创新人才团队建设项
目(黔科合人才团队［2012］4007 号);贵州省科技计划项目(黔科合高 G字［2010］4009)。
* 通讯作者:E － mail:603952500@ qq. com。
马比木植物内生真菌 Trichoderma sp.
抗癌活性产物的液体发酵工艺优化
陈 旭1，3，雷帮星3，文庭池3，曾 茜2*
(1．贵州省农业资源与环境研究所，贵州 贵阳 550025;2. 贵阳中医学院 基础部微生物研究室，
贵州 贵阳 550025;3. 贵州大学 西南药用生物资源教育部工程研究中心，贵州 贵阳 550025)
摘 要:从马比木植物中分离获得一株木霉属内生真菌 Trichoderma sp．编号为 GX － 8，其代谢产物中含有薯蓣皂
苷类化合物，体外抗癌实验表明该物质对人肝癌细胞 BEL － 7402、人非小细胞肺癌细胞 A549 和人前列腺癌细胞
PC3 均具有中等的细胞毒活力。本实验以上述化合物的含量为主要指标，通过单因素和正交试验的研究分析，优
化确定适宜于菌株 GX －8 积累目标化合物的液体发酵工艺。研究结果表明:GX － 8 发酵生产薯蓣皂苷类化合物
的最优培养基为可溶性淀粉 40 g /L、蛋白胨 10 g /L、色氨酸 40 mg /L、磷酸氢二钾 1 g /L和硫酸镁 2 g /L，pH 6. 0，接
种量 2%(v /v)，于 28℃下摇瓶发酵 16 d，该物质的产量可以达到 87. 38 ± 5. 86 μg /mL，相比优化前的含量 39. 66 ±
3. 27 μg /mL提高了 120. 32%。
关键词:内生真菌;代谢产物;薯蓣皂苷类;抗癌活性;发酵工艺优化
中图分类号:S646. 2 文献标识码:A
文章编号:1008 － 0457(2015)05 － 0033 － 05 国际 DOI编码:10． 15958 / j． cnki． sdnyswxb． 2015． 05． 006
Optimization of liquid fermentation process for producing metabolite containing antitumor com-
pound-Diosgenin by the endophytic fungus Trichoderma sp．
CHEN Xu1，3，LEI Bang-xing3，WEN Ting-chi3，ZENG Qian2* (1． Guizhou Agricultural Ｒesources and Envi-
ronment Institute，Guiyang 550025，China;2． Lab of Microbiology，Guiyang College of Traditional Chinese
Medicine，Guiyang 550025，China;3． Engineering Ｒesearch Center of Southwest Bio － Pharmaceutical Ｒe-
sources，Ministry of Education and Guizhou University，Guiyang 550025，China)
Abstract:The compound extracted from the metabolite produced from a strain named GX － 8 of the endophyt-
ic fungus Trichoderma sp． was identified as Diosgenin． In vitro experiments，diosgenin shows moderate cyto-
toxicity to the human hepatoma cell BEL － 7402，lung cancer cell A549 and prostate cancer cell PC3． The
objective of this research is to use the content of diosgenin as the main index，through the analysis of single
factor and orthogonal tests，to optimize the liquid fermentation process suitable for strain GX － 8 to accumu-
late the compound diosgenin． The results showed that the best medium and fermentation process are:soluble
starch 40g /L，peptone 10g /L，tryptophan 40mg /L，K2HPO4 1g /L，MgSO4 2g /L，initial pH 6. 0，inocula-
tion volume 2% (v /v)，at 28℃ in fermentation for 16 days． The yield of diosgenin could reach up to
(87. 38 ± 5. 86)μg /mL，which is an increase of 120. 32% compared to the pre － optimized yield of (39. 66
± 3. 27)μg /mL．
Key words:endophytic fungus;metabolite;diosgenin;antitumor activity;fermentation process optimization
山 地农业生物学报 34(5):033 ～ 037，2015
Journal of Mountain Agriculture and Biology
植物内生真菌(Plant Endophytic Fungi)是指存
活于宿主植物的全部或几乎全部的生理周期中，而
寄主不会表现任何病症的一类真菌，它们是生活在
植物组织内微生物群体中的主要成员，是植物微生
态系统的重要构成部分［1］。植物内生真菌拥有丰富
的种质资源，且不同内生真菌可产生活性多样的次
生代谢产物，是一个研究深度尚浅，生境特殊的微生
物类群，因此内生真菌作为一个天然活性药物开发
的巨大资源而备受研究者们关注［2］。然而，微生物
的生长代谢除自身基因调控外，还极大地受限于环
境中营养条件(培养基配比)和生长条件(培养环
境)，其中任何因素改变都可能影响微生物的正常生
长过程，导致其代谢产物含量、组成的变化，甚至是
物质种类的改变［3］。因此，在微生物来源的天然药
物开发中，针对目标代谢产物积累而筛选出适宜的
培养基配比和培养环境具有重要的现实意义。
癌症(Cancer)，又称恶性肿瘤(Malignant neo-
plasm)，是由于细胞生长增殖机制失常而引起的疾
病，具有极高的发病率和致死率，严重威胁人类健
康［4］。现代医疗技术发展至今，依然无法有效治愈
癌症。目前，临床上采取化疗和手术为主，其他手
段为辅的综合疗法;然而，化疗药物靶标性弱、数量
有限、毒副作用明显、价格成本昂贵等诸多问题，严
重制约癌症治疗及相关行业的发展。此外，肿瘤细
胞多药耐药现象的出现，给癌症治疗带来了新的挑
战。为有效解决上述问题，开发特定功能微生物，
合理利用并投入生产制药逐渐成为了研究热点;微
生物因具备生长周期短、易调控、成本低并且可以
选择性遗传改造等特性［5］，早已在天然药物研发、
生产等领域发挥重要作用。因此，本研究前期已从
马比木植物的内生真菌中筛选出具有产抗癌活性
物质的菌株 GX － 8，针对其发酵产物，通过分离纯
化和结构鉴定，初步断定该活性物质为薯蓣皂苷类
化合物，现以该化合物的含量为主要考察指标，通
过单因素和正交试验的筛选，利用 HPLC(高效液
相色谱)技术对发酵液进行检测，较为系统地研究
了易于菌株 GX －8 积累该化合物的发酵培养基配
比及条件，为进一步的开发利用奠定基础。
1 材料与方法
1. 1 材料和试剂
1. 1. 1 菌种 一株分离自马比木(Nothapodytes
pittosporoides)植物的木霉属(Trichoderma)内生真
菌，菌株编号为 GX － 8，现保存于贵州大学生化工
程中心真菌学实验室。
1. 1. 2 培养基 PDA 培养基，液体基础培养基均
参照于 Zheng等［6］的方法配制。
1. 1. 3 试剂 三氯甲烷 －分析纯，重庆川江化学
试剂厂;甲醇 －色谱纯，TEDIA。
1. 1. 4 仪器设备 1260 型高效液相色谱分析仪，
Agilent Technology。
1. 2 方法
1. 2. 1 菌种的活化及培养 采用通常的真菌菌种
活化培养方法，具体参照于 Ｒehman等［7］的方法。
1. 2. 2 目标化合物含量标准曲线的测定 将纯化
获得的化合物 A(95%以上)配制成浓度分别为
0. 2，0. 4，0. 6，0. 8，1. 0 和 1. 2 mg /mL 的 6 种溶
液［8］，通过 HPLC检测不同浓度溶液的峰面积值并
记录。以峰面积值为 Y 轴，样品浓度为 X 轴绘制
化合物 A的标准曲线并建立回归方程。
1. 2. 3 碳源、氮源、前体物质的单因素研究 通过
在液体基础培养基中添加不同的考察单因素，筛选
出适宜的碳源、氮源和前体物质，具体方法参照于
Kang［9］等。
1. 2. 4 发酵培养基主要成分的正交试验 通过
1. 2. 3 筛选出的适宜碳源、氮源和前体物质，再利
用正交试验来确定培养基中各组分的最佳浓度，从
而获得有利于 GX －8 菌株积累目标化合物的培养
基组分配比。本实验选择可溶性淀粉、蛋白胨、色
氨酸、K2HPO4和 MgSO4共 5 种培养基组分，每种组
分设置 4 个浓度梯度进行正交实验(见表 1)
表 1 正交试验因素水平表 L164
5
Tab． 1 The factors and levels orthogonal test L164
5
水平
因素 Factors(g /L)
A －可溶性淀粉 B －蛋白胨 C －色氨酸 D －磷酸氢二钾 E －硫酸镁
1 20 5 0. 01 0. 5 0. 5
2 30 10 0. 02 1. 0 1. 0
3 40 15 0. 03 1. 5 1. 5
4 50 20 0. 04 2. 0 2. 0
1. 2. 5 发酵条件优化 在 1. 2. 4 筛选出的优化培
养基组分基础上，对培养温度、初始 pH、发酵时间
和接种量进行单因素考察，具体方法参照于
Kang［9］等。
1. 2. 6 试验数据分析 每个试验进行 3 次平行
重复，结果以 M ± SD表示。实验数据统计方法采
用多重方差分析，并利用 SPSS 17. 0 统计软件分
43 山地农业生物学报 2015 年
析数据。
2 结果与分析
2. 1 目标化合物含量标准曲线的绘制
通过 HPLC检测，获得了目标化合物(95%以
上)在浓度分别为 0. 2，0. 4，0. 6，0. 8，1. 0 和 1. 2
mg /mL时的峰面积。以峰面积数值为 Y 轴，样品
浓度为 X轴绘制目标化合物的标准曲线(见图 1)，
并利用峰面积 Y 与样品浓度 X 进行回归分析，得
到回归方程为 y = 369. 57x － 8. 033 3，决定系数 Ｒ2
= 0. 977 2。
图 1 化合物的标准曲线
Fig． 1 Standard curve of compound
2. 2 碳源、氮源、前体物质的单因素研究
通过 HPLC检测，当分别选用可溶性淀粉为碳
源、蛋白胨为氮源和色氨酸为前体物质时，发酵物
中目标物质的含量最高，达到 57. 93 ± 6. 24、68. 56
± 6. 28 和 71. 85 ± 6. 93 μg /mL(见图 2、3、4)。
图 2 不同碳源对化合物产量的影响
Fig． 2 Effect of carbon source
on the production of compound
图 3 不同氮源对化合物产量的影响
Fig． 3 Effect of nitrogen source
on the production of compound
图 4 不同前体对化合物产量的影响
Fig． 4 Effect of precursor
on the production of compound
2. 3 发酵培养基主要成分的正交试验
由表 2 可得:各因素对目标化合物产量的影响
由大到小依次是:A ＞ C ＞ B ＞ E ＞ D，即可溶性淀粉
＞色氨酸 ＞蛋白胨 ＞硫酸镁 ＞磷酸氢二钾，可溶性
表 2 正交试验结果
Tab． 2 The results of orthogonal test
试验组
Ｒun
A B C D E
化合物 A含量
(μg /mL)
1 1 1 1 1 1 17. 93 ± 2. 15
2 1 2 2 2 2 58. 33 ± 7. 36
3 1 3 3 3 3 32. 65 ± 2. 58
4 1 4 4 4 4 57. 64 ± 4. 02
5 2 1 2 3 4 21. 59 ± 1. 33
6 2 2 1 4 3 43. 10 ± 5. 47
7 2 3 4 1 2 54. 06 ± 6. 84
8 2 4 3 2 1 23. 70 ± 1. 83
9 3 1 3 4 2 64. 35 ± 5. 24
10 3 2 4 3 1 89. 67 ± 8. 63
11 3 3 1 2 4 71. 08 ± 4. 72
12 3 4 2 1 3 59. 92 ± 3. 88
13 4 1 4 2 3 56. 98 ± 6. 03
14 4 2 3 1 4 57. 24 ± 4. 46
15 4 3 2 4 1 29. 66 ± 2. 58
16 4 4 1 3 2 21. 12 ± 1. 87
k1 41. 638 40. 212 38. 308 47. 288 40. 240
k2 35. 612 62. 085 42. 375 52. 523 49. 465
k3 71. 255 46. 863 44. 485 41. 258 48. 163
k4 41. 250 40. 595 64. 588 48. 688 51. 888
Ｒ 35. 643 21. 873 26. 280 11. 265 11. 648
Optimal
level
3 2 4 2 4
53第 5 期 陈 旭，等:马比木植物内生真菌 Trichoderma sp. 抗癌活性产物的液体发酵工艺优化
淀粉对化合物 A的产量起主导作用，色氨酸次之;
最佳培养基成分配比为 A3 B2 C4 D2 E4，即可溶性淀
粉 40 g /L，蛋白胨 10 g /L，色氨酸 40 mg /L，磷酸氢
二钾 1 g /L和硫酸镁 2 g /L。
此外，本试验校正模型的 F 值为 28. 692，P 值
为 0. 006，表明所用的模型具有统计学意义，可用
于模型中其他因素显著性的检验。由表 3 可知，因
素 A、B和 C 的 P 值均小于 0. 05，表明这 3 个因素
对目标化合物的产量影响显著。
表 3 有重复观测值正交试验结果方差分析表
Tab． 3 Analysis of variance of orthogonal results
变异来源
SS离均差
平方和
自由度
df
均方
MS
F P
校正模型 10501. 185a 15 700. 079 28. 692 0. 006
截距 24390. 683 1 24390. 683 983. 230 0. 000
A 2638. 297 3 879. 432 31. 662* 0. 009
B 2149. 513 3 716. 504 28. 978* 0. 041
C 2278. 038 3 759. 346 29. 681* 0. 036
D 1729. 002 3 576. 334 24. 434 0. 095
E 1806. 335 3 602. 112 25. 398 0. 074
误差 41. 906 3 13. 969
总计 34933. 774 19
校正的总计 10543. 091 18
2. 4 发酵条件优化
通过 HPLC 检测，当分别设置培养温度为
28℃、培养基初始 pH 为 6. 0、接种量为 2%(v /v)
和发酵时间为 16 d 时，发酵物中目标物质的含量
最高，达到 78. 90 ± 5. 72、82. 79 ± 7. 87、85. 67 ±
6. 34 和 87. 38 ± 6. 24 μg /mL(见图 5、6、7、8)。
图 5 不同温度对化合物产量的影响
Fig． 5 Effect of temperature on
the production of compound
图 6 不同初始 pH对化合物产量的影响
Fig． 6 Effect of initial pH on
the production of compound
图 7 不同接种量对化合物产量的影响
Fig． 7 Effect of volume of inoculum on
the production of compound
图 8 不同发酵时间对化合物产量的影响
Fig． 8 Effect of fermentation time on
the production of compound
3 讨 论
木霉(Trichoderma spp．)作为重要生防真菌之
一，在农作物病害的生物防治中发挥了举足轻重的
作用。研究发现，木霉的拮抗防病机制表现出多样
性，并且木霉还能够诱导、协同植物产生系统抗病
性，木霉菌的拮抗作用主要针对约 18 个属 29 种病
63 山地农业生物学报 2015 年
原菌［10］。目前，有关木霉诱导抗性机制的研究已
经取得了一定进展，但是还不够完善。对于木霉属
真菌代谢产物生物活性的研究主要集中在其生防
作用方面，其活性代谢产物主要有单端孢霉烯毒素
类、吡喃酮类、吡喃类、杂环氮类、聚酮类和环戊烯
酮类等［11］。然而，仅有极少数研究者从木霉属真
菌中分离获得具有抗癌活性的代谢产物［12，13］。
微生物代谢产物中蕴藏着丰富的天然产物资
源，有待于科研工作者开发和利用。曾茜［14］等分
离获得一株具有抗癌活性的蒿属植物内生真菌，通
过单因素、正交试验，并结合 PB 和中心组合设计，
将其活性代谢产物的产量提高了 3. 48 倍。另外，
秦捷敏［15］等对一株酿酒酵母工程菌 ChIFN － α 的
摇瓶发酵条件进行优化，为进一步饲料酵母的生产
奠定基础。还有研究者以麦角固醇含量为检测指
标，筛选红曲霉 Monascus － ZZ 的液体发酵培养基，
优化后麦角固醇含量达到原本的 1． 83 倍［16］。雷
帮星［17］等完成了 SM96 菌株工业发酵工艺的优化，
得到最佳生产 Ara(花生四烯酸)和 EPA(廿碳五烯
酸)的条件。笔者首次从马比木植物内生真菌中分
离获得一株木霉属内生真菌，具有代谢生产薯蓣皂
苷类抗癌化合物的能力，通过对该菌株液体发酵工
艺进行优化，实现了目标活性物质产量达到 87. 38
μg /mL，相比未优化前的 39. 66 μg /mL 提高了
120. 32%。该结果能为后续采用多因素试验设计
法对培养基组成和培养条件的深度优化提供一定
的参考依据。
参 考 文 献:
［1］ 王利国，潘超关，贺 红，等．抗肿瘤药用植物及其内生菌活性代谢产物研究进展［J］．广州中医药大学学报，2008，25
(2):183 － 186．
［2］ 王瑶瑶，韩烈保，曾会明．禾本科植物内生菌研究进展［J］．生物技术通报，2008(3):33 － 38．
［3］ WEN T C，LI G Ｒ，Kang J C，et al． Optimization of Solid － state fermentation for fruiting body growth and Cordycepin pro-
duction by Cordyceps militaris［J］． Chiang Mai J． Sci，2014，41(4) :858 － 872．
［4］ Adlercreutz H，Fotsis T，Heikkinen Ｒ，et al． Excretion of the lignans enterolactone and enterodiol and of equol in omnivorous
and vegetarian postmenopausal women and in women with breast cancer［J］． Lancet，1982，2(8311) :1 295 － 1 299．
［5］ Gunatilaka A A L． Natural products from plant － associated microorganisms:distribution，structural diversity，bioactivity and
implications of their occurrence［J］． J Nat Prod，2006(69) :509 － 526．
［6］ ZHENG J H，KANG J C，LEI B X，et al． Diversity of endophytic fungi associated with Ginkgo biloba． L［J］． Mycosystema，
2013，32(4) :671 － 681．
［7］ Ｒehman S，Shawl A S，Sultana S，et al． In vitro cytotoxicity of an endophytic fungus isolated from Nothapodytes foetida［J］．
Annals of Microbiology，2009(59) :157 － 161．
［8］ 陈 旭．两个植物内生真菌的抗癌活性物质研究［D］．贵阳:贵州大学生命科学学院，2014．
［9］ KANG C，WEN T C，KANG J C，et al． Optimization of large － scale culture conditions for the production of cordycepin with
Cordyceps militaris by liquid static culture［J］． The Scientific World Journal，2014，30(3):655 － 668．
［10］ Cook Ｒ J，BAKEＲ K F． The nature and practice of biological control of plant pathogens［M］． APS［C］，1983，p539．
［11］ 闫 峰，徐凤花，顾金刚，等．木霉属真菌的生物降解及生物转化作用［J］．微生物学杂志，2009，29(3):77 － 80．
［12］ Samuels G J． Trichoderma:a review of biology and systematics of the genus［J］． Mycologycal Ｒesearch，1996，100(8) :
923 － 935．
［13］ 杨依军，王 勇，杨秀荣，等．拮抗木霉菌在生物防治中的作用［J］．天津农业科学，2000，6(3):29 － 33．
［14］ 李美芽，吴运帷，蒋福升，等．一株具有抗 HepG2 活性的胡桃楸内生真菌的分离及研究［J］．中国中药杂志，2009，34
(13):1 623 － 1 627．
［15］ 于湘莉，赵静雅，张利达，等．楸树内生真菌抗癌性能研究［J］．上海医药，2012，33(13):49 － 52．
73第 5 期 陈 旭，等:马比木植物内生真菌 Trichoderma sp. 抗癌活性产物的液体发酵工艺优化