全 文 ：研究与探讨
2015年第14期
Vol . 36 , No . 14 , 2015
定心藤醇提物不同极性部分的
体外抗氧化活性研究
李维峰1，王娅玲1，郭 芬1，高云涛2，*
（1.云南农业大学热带作物学院，云南普洱 665000；
2.云南民族大学化学与生物技术学院，云南昆明 650031）
摘 要：研究定心藤75%乙醇提取物不同极性部位的体外抗氧化活性，采用5种不同极性溶剂萃取（石油醚、氯仿、乙
酸乙酯、正丁醇、水）得到5种萃取物，分别测定黄酮含量，并通过还原能力测定、DPPH自由基清除能力、羟自由基清除
能力和超氧阴离子自由基清除能力4种测定方法，对各萃取物抗氧化能力进行研究。结果显示，各提取物对Fe3+均有一
定的还原能力，乙酸乙酯萃取物还原效果最为明显；定心藤不同极性部位均具有一定的抗氧化活性，乙酸乙酯萃取物
抗氧化能力最强，DPPH·的半数清除浓度IC50为0.28mg/mL，羟自由基半数清除浓度IC50为0.41mg/mL，在0.2mg/mL浓度
下，对超氧阴离子自由基的清除率达到42.88%，而其黄酮含量最高，达到609.96mg/g，这也许与它具有较高的抗氧化
活性有关。说明乙酸乙酯萃取物具有较好的开发天然抗氧化剂的前景。
关键词：定心藤，不同极性部位，抗氧化活性，总黄酮
Study on antioxidative activities in vitro of different polarity fractions of
ethanol extract from Mappianthus iodioides Hand. Mazz
LI Wei-feng1，WANG Ya-ling1，GUO Fen1，GAO Yun-tao2，*
（1.Faculty of Tropical Crops，Yunnan Agricultural University，Puer 665000，China；
2.School of Chemistry and Biotechnology，Yunnan Nationalities University，Kunming 650031，China）
Abstract：To investigate the antioxidant activities in vitro of different polarity fractions of 75% ethanol extract from
Mappianthus iodioides，five polarities of extracts were obtained by using different polarity solvents，such as
petroleum，chloroform，ethyl acetate，normal butyl alcohol and water. The content of flavonoids was detected by
absorption spectroscopy. Their antioxidant activities were evaluated by reduction energy capability and
scavenging capability of DPPH，hydroxyl free radical and superoxide anion free radical. The results showed
that all of the extracts had strong deoxidization ability of Fe3+. Ethyl acetate extracts had significant deoxidization
ability. All the different polarity fractions of extract antioxidant activities were observed，of which the ethyl
acetate extract had highest antioxidant activity，and 50% inhibitory concentration（IC50） of DPPH of the ethyl
acetate extract was 0.28mg/mL，50% inhibitory concentration（IC50） of·OH of the ethyl acetate extract was
0.41mg/mL. When the concentration of the ethyl acetate extract reached to 0.2mg/mL，O2-· scavenging rate
was 42.88%. In addition，total flavonoids content of ethyl acetate extract was significantly higher than that of
others，reached to 609.96mg/g，which might related with its higher antioxidant activity. It was indicated that ethyl
acetate extract of 75% ethanol extract from Mappianthus iodioides had good development potential for natural
antioxidant.
Key words：Mappianthus iodioides；different polarity fractions；antioxidant activity；total flavones
中图分类号：TS255.1 文献标识码：A 文 章 编 号：1002-0306（2015）14-0107-05
doi：10.13386/j.issn1002-0306.2015.14.012
收稿日期：2014－11－18
作者简介：李维峰（1981-），男，硕士，讲师，主要从事天然产物化学方面的研究。
* 通讯作者：高云涛（1962-），男，教授，主要从事分析科学与技术方面的研究。
基金项目：云南省教育厅科学研究基金一般项目（2013Y536）。
傣族“雅解”药中定心藤称为邓嘿罕，是“雅解”
药多种单方或复方解药的重要药物之一，为茱萸科
植物定心藤（Mappianthus iodioides Hand. Mazz）的干
燥藤茎。据《傣药学》记载该药性凉，微苦，涩、平，祛
风活络，消肿、解毒，用于风湿性腰酸腿痛，手足麻
痹，跌打损伤等症[1]。相关研究表明，定心藤中含有黄
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Science and Technology of Food Industry 研究与探讨
2015年第14期
酮、多糖、有机酸、强心苷、皂苷和鞣质等多种化学成
分[2-5]，研究这些成分的药理活性作用，对开发定心藤
类药物、保健品，促进我国民族医药的发展具有重要
意义。
前人研究发现，定心藤中多糖及挥发性油类均
具有一定的抗氧化活性[6-7]，而其总黄酮类提取物对
DPPH具有较强的清除作用[8]，但对定心藤的抗氧化
作用仅局限于从其活性成分的总类（如总多糖、总挥
发油和总黄酮）上进行研究，具体是这些活性成分的
何种结构或何部分物质起到主要抗氧化作用，目前
还未见研究报道。
因此，本文专门采用五种极性溶剂对定心藤乙
醇提取物进行萃取，获得五种不同的极性部分，通过
比较各部分黄酮含量、清除DPPH自由基、羟自由基
的能力和超氧阴离子自由基以及还原能力，比较各
极性萃取物抗氧化能力，目的在于探讨定心藤抗氧
化作用机理，为定心藤的进一步开发提供理论参考。
1 材料与方法
1.1 材料与仪器
定心藤 2013年10月采自云南省普洱市柏枝
寺，采集树龄5年的定心藤地上无损伤部分约1kg，经
云南农业大学热带作物学院马晓老师鉴定为真品。
样本切片，于60℃干燥后粉碎过40目筛，冷藏备用；
芦丁标准品（HPLC≥98%） 购自上海士锋科技有限
公司，20mg/瓶，产品批次：20140212；其他试剂 均
为国药集团分析纯。
FW-200万能粉碎机 北京中兴伟业仪器有限
公司；SK5210HP超声清洗仪 上海科导超声仪器有
限公司；UV759紫外-可见分光光度计 上海精科仪
器有限公司；AL204电子分析天平 梅特勒-托利多
公司；DZF-6053真空干燥箱 上海一恒科学仪器有
限公司；EV321旋转蒸发仪 莱伯泰科有限公司；
HC-3018高速冷冻离心机 安徽中科中佳科学仪器
有限公司。
1.2 实验方法
1.2.1 样品制备 取800g上述定心藤粉末，用8L 70%
乙醇回流提取4h，过滤，滤渣重新用8L 70%乙醇回
流提取两次，合并滤液，旋转蒸发仪减压蒸干得到
31.215g提取物浸膏，浸膏用500mL去离子水分散溶解
后，依次用600mL石油醚、氯仿、乙酸乙酯和正丁醇
各萃取三次，合并各部分萃取液，减压蒸干，得到定
心藤醇提物的不同极性萃取物备用。
1.2.2 定心藤不同极性萃取物黄酮含量的测定
1.2.2.1 标准曲线绘制 总黄酮含量的测定采用分
光光度法，配制0.2mg/mL芦丁为标准溶液，分别取
1.00、2.00、3.00、4.00、5.00、6.00、7.00mL于25mL比色
管中，加入1mL 5%亚硝酸钠溶液，摇匀后放置6min，
然后加入1mL 10%硝酸铝溶液，摇匀后放置6min，再
加入6mL 4%氢氧化钠溶液，用30%乙醇定容至刻度
线[9]，摇匀，放置15min，于510nm测定吸光度，以吸光
度A为纵坐标，芦丁浓度（mg/mL）为横坐标，绘制标
准曲线。
1.2.2.2 黄酮含量的测定 不同极性萃取物分别配
制成浓度为0.5mg/mL的样品液，精确移取0.5mg/mL
的各极性部位萃取液1mL，按照1.2.2.1的方法于510nm
处测定其吸光度值，并利用回归方程计算各极性部
位的黄酮含量。
1.2.3 还原力的测定 采用Galbe的方法[10]，不同极
性萃取物配制10个浓度（0.025、0.1、0.15、0.2、0.4、
0.8、1.2、1.6、2.0、2.4mg/mL）梯度样品液，取20mL的
试管，加入3mL 0.2mol/L pH=6.6的磷酸缓冲溶液、
2.5mL不同浓度样品液、2.5mL 1%铁氰化钾，摇匀后
50℃水浴20min，快速冷却，加2.5mL质量浓度10%三
氯乙酸，离心10min（3000r/min），取5mL上清液，分别
加1mL 0.1%的三氯化铁，超纯水4mL，放置10min后，
700nm测吸光度。以同等浓度的抗坏血酸作为阳性
对照，进行实验。每一吸光度值平行测定3次，取平
均值。
1.2.4 清除羟自由基能力的测定 参考陈留勇等的
水杨酸法[11]，并略加改动。利用双氧水和亚铁离子混
合产生羟自由基，再向反应液中加入水杨酸，使其反
应产生有色化合物，在510nm处测定其吸光度值。实
验时，不同极性萃取物配制13个浓度（0.05、0.1、0.15、
0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8、2.0mg/mL）梯度
样品液，取1支20mL试管，依次加入样品液2mL、
9mmol/L硫酸亚铁溶液2mL、0.1%双氧水溶液2mL，
混匀静置10min，然后加入9mmol/L水杨酸2mL，混匀，
37℃水浴反应30min，流水冷却，12000r /min离心
6min，上清液在510nm处测定其吸光度值为A1；以蒸
馏水代替双氧水得到的吸光度值为空白对照A0，以
70%乙醇代替样品溶液作为本底液吸光度值A2，样
品液对羟自由基的清除率：
K（%）=[1-（A1-A0）/A2]×100
以相同浓度的VC做阳性对照。每个样品平行测
定3次，取平均值。
1.2.5 超氧阴离子自由基清除能力的测定 参照万
军等的邻苯三酚自氧化法[12]。不同极性萃取物配制8
个浓度（0.05、0.1、0.15、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mg/mL）梯
度样品液，取50mmol/L pH8.2的Tris-HCl缓冲液4.5mL，
加入3.2mL蒸馏水于试管中，放到25℃水浴中预热
20min，分别加入1mL不同浓度的样品溶液，立即加入
0.3mL 25℃水浴中预热的3mmol/L邻苯三酚，迅速混
匀，然后放置于25℃水浴中精确反应4min，立即加入
2滴8mol/L HCl终止反应，以蒸馏水代替样品溶液做
空白实验，以10mmol/L HCl代替邻苯三酚溶液作为
调零空白，320nm处测定各管的吸光度值，每个样品
重复实验3次，取平均值，以VC做阳性对照，样品液对
超氧自由基的清除率
K（%）=[（A0-A1）/A0]×100
式中，A0对照组吸光度值；Ai为样品组吸光度值。
1.2.6 DPPH自由基清除能力的测定 参考Tseng等
的方法[13]，不同极性萃取物配制11个浓度（0.025、0.05、
0.1、0.15、0.2、0.25、0.3、0.35、0.4、0.45、0.5mg/mL）梯
度样品液，取0.325mmol/L DPPH乙醇溶液2mL，加入
2mL样品溶液，摇匀，在黑暗处放置20min，以无水乙
醇为空白在517nm处测定其吸光度，每个样品平行测
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研究与探讨
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图4 定心藤乙醇提取物不同极性部分的DPPH自由基清除能
力（n=3）
Fig.4 Scavenging DPPH·activities of different polar fraction
from ethanol extract of Mappianthus iodioides（n=3）
样品浓度（mg/mL）
0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6
100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
DP
PH
·
清
除
率
（
%）
VC 水相 正丁醇相 乙酸乙酯相 氯仿相 石油醚相
定3次，样品液对DPPH的清除率：
K（%）={1-[（A1-A3）/A2]}×100
式中，A1：样品溶液2mL+DPPH液2mL溶液的吸
光度；A2：DPPH液2mL+无水乙醇2mL溶液的吸光度；
A3：样品液2mL+无水乙醇0.5mL溶液的吸光度。
1.3 数据处理
采用Excel统计软件进行数据处理与作图，以上
测定均重复三次，图中数据均为三次重复平均值加
标准差。
2 结果与分析
2.1 定心藤乙醇提取物不同极性部分的黄酮含量比较
由图1可知，芦丁溶液质量浓度x（mg/mL）与y（吸
光度值A）的回归方程：y=12.559x+0.0034，相关系数
R2=0.9996，线性范围为0.008～0.056mg/mL。
定心藤不同极性部位黄酮含量如图2所示。由
图2可以看出，乙酸乙酯相中黄酮类物质明显高于
其他各极性部位，达到 609.96mg/g，而在氯仿相
（260.00mg/g）和正丁醇相（311.03mg/g）中黄酮类也
明显多于其他两种溶剂，水相中存在的黄酮类物质
较少，为150.1mg/g，石油醚相中黄酮类化合物最少，
仅为118.92.96mg/g。测定表明，黄酮类化合物在极性
溶剂中的溶解度顺序为：乙酸乙酯相＞正丁醇相＞氯
仿相＞水相＞石油醚相。
2.2 定心藤乙醇提取物不同极性部分的还原力测定
抗氧化剂的活性与其还原能力存在密切的联
系，抗氧化剂通过提供电子使具有氧化活性的自由
基还原而达到清除自由基的效果，所以其还原力越
强，则抗氧化活性越高。因此可以根据还原力的大小
判断抗氧化剂活性的强弱[14]。如图3所示，在实验测
定范围内各极性部位实验样品浓度与还原力呈正相
关，随着试液浓度增大，还原力均不断增强，表明定
心藤各极性萃取物均具有一定的还原力，但是，在同
等浓度下，它们的还原能力始终弱于VC。根据图3，在
低浓度范围内，乙酸乙酯相与其他萃取相的还原能
力差异不大；但随着浓度的逐渐增加，乙酸乙酯相的
还原能力明显高于其他相，还原能力顺序为：乙酸乙
酯相＞正丁醇相＞氯仿相＞水相＞石油醚相。
2.3 定心藤乙醇提取物不同极性部分的DPPH自由
基清除能力比较
DPPH可以在有机溶剂中形成稳定的自由基，呈
紫红色，在517nm处有强吸收。当存在自由基清除剂
时，由于自由基清除剂与其单电子配对而使其吸收
消失，其褪色程度与所接受的电子数成定量关系[15]。
定心藤不同极性醇提物和VC对DPPH·的清除作用结
果见图4。由图4可知，定心藤各极性部位均表现出
较强的DPPH·的清除能力，尤其是乙酸乙酯相，在
0.5mg/mL的浓度下，对DPPH·清除作用可以达到同
等VC浓度的77%。经过实验得出DPPH·被清除一半
时各极性部位的所需的浓度（IC50）分别为石油醚相
0.94mg/mL、氯仿相0.44mg/mL、乙酸乙酯相0.28mg/mL、
正丁醇相0.49mg/mL、水相0.87mg/mL。
图1 芦丁的标准曲线
Fig.1 The standard curve of rutin
芦丁标准溶液浓度（mg/mL）
0 0.01 0.02 0.03 0.04 0.05 0.06
0.8
0.7
0.6
0.5
0.4
0.3
0.2
0.1
0
吸
光
度
A
图2 定心藤乙醇提取物不同极性部分的黄酮含量
Fig.2 Total flavonoids contents of different polar fraction from
ethanol extract of Mappianthus iodioides
水相 正丁醇相乙酸乙酯相氯仿相 石油醚相
700
600
500
400
300
200
100
0
黄
酮
含
量
（
m
g/
g）
图3 定心藤乙醇提取物不同极性部分的还原能力（n=3）
Fig.3 Reducing power of different polar fraction from ethanol
extract of Mappianthus iodioides（n=3）
样品浓度（mg/mL）
0 0.5 1 1.5 2 2.5 3
3.0
2.5
2.0
1.5
1.0
0.5
0.0
吸
光
度
VC 水相 正丁醇相 乙酸乙酯相 氯仿相 石油醚相
109
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图6 定心藤乙醇提取物不同极性部分的羟自由基清除能力
（n=3）
Fig.6 Scavenging hydroxyl free radical activities of different
polar fraction from ethanol extract of Mappianthus iodioides（n=3）
样品浓度（mg/mL）
0 0.5 1.0 1.5 2.0
100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
羟
自
由
基
清
除
率
（
%）
VC 水相 正丁醇相 乙酸乙酯相 氯仿相 石油醚相
2.4 定心藤乙醇提取物不同极性部分的超氧阴离子
自由基清除能力比较
超氧阴离子自由基是生物体内较稳定的一类自
由基，通常可以与其他物质反应产生其他自由基，从
而对生物体产生伤害[16]。定心藤各极性部位对超氧
阴离子自由基的清除作用见图5。由图5中可以看出，
定心藤各极性部位表现出的清除超氧阴离子自由基
的能力差异较大，其中乙酸乙酯部分清除能力最强，
在0.2mg/mL浓度下，其对超氧阴离子自由基的清除
率达到42.88%，而正丁醇部分为33.42%，水相部分为
20.75%，氯仿部分为20.64%，石油醚部分仅为9.12%，
说明乙酸乙酯部分对超氧阴离子的清除作用最好，
石油醚部分最差。与VC相比较，在0.2mg/mL浓度下，
乙酸乙酯部分对超氧阴离子自由基等清除作用大约
为VC的59.5%。
2.5 定心藤乙醇提取物不同极性部分的羟自由基清
除能力比较
羟自由基对生物组织危害性较强，其会导致细
胞膜系统氧化损伤，进而影响膜的流动性，使膜通透
性升高，引起膜内物质外泄。羟自由基也会使生物体
内生物大分子氧化，对生命活动产生危害[17-18]。定心
藤不同极性部位对羟自由基的清除能力如图6所示。
由图6中可知，定心藤不同极性部位均具有一定的清
除羟自由基的能力，且有明显的量效关系，其中乙酸
乙酯清除羟自由基能力最强，在2.0mg/mL浓度下，清
除率大小顺序为乙酸乙酯相＞正丁醇相＞氯仿相＞水
相＞石油醚萃相；在此浓度下，与阳性对照VC相比，乙
酸乙酯相、氯仿相、正丁醇相、水相、石油醚相对羟自
由基的清除率分别为VC的95.2%、60.63%、61.6%、
41.9%、32.6%，即乙酸乙酯部分对超氧阴离子自由基
的清除能力与VC大体相当，其他极性部位的清除能
力弱于VC。
3 结论
定心藤乙醇提取物的不同极性萃取物抗氧化实
验结果表明，不同极性萃取物均具有抗氧化活性，其
中以乙酸乙酯相抗氧化能力最强，其次是氯仿相和
正丁醇相，最弱的为水相及石油醚相，这与黄酮类化
合物在各极性部位的分部相一致，从而说明黄酮类
化合物可能是定心藤中抗氧化活性的主要成分。
乙酸乙酯极性部位相对于其他极性部位表现出
较强的还原能力和清除自由基的能力，可以作为定
心藤抗氧化活性成分研究的主要极性部位进行深入
研究。本实验为从定心藤中提取分离有效成分提供
一定思路参考，并为进一步探讨定心藤的抗氧化机
制提供了一定的理论基础，也为定心藤进一步资源
化利用和相关产品的开发提供了技术支撑。
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图5 定心藤乙醇提取物不同极性部分的超氧阴离子自由基
清除能力（n=3）
Fig.5 Scavenging superoxide anion free radical activities of
different polar fraction from ethanol extract of
Mappianthus iodioides（n=3）
样品浓度（mg/mL）
0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0超
氧
阴
离
子
自
由
基
清
除
率
（
%） VC 水相 正丁醇相 乙酸乙酯相 氯仿相 石油醚相
（下转第114页）
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得的提取物抑制金黄色葡萄球菌的能力比山豆根总
生物碱和醇提物的抑菌能力强。
其次是氯仿部位，它对普通变形杆菌和铜绿假
单胞菌的抑制作用最强，抑制其他实验菌的能力仅
次于乙酸乙酯部位。正丁醇提取部位对这6种细菌的
抑制作用都比较弱，乙醇提取部位对这6种细菌的抑
制作用是4种溶剂提取物中最弱的。乙酸乙酯、氯仿
提取物均能抑制白色念珠球菌，这与吴荣达等在研
究山豆根水煎液对白色念珠菌的抗菌作用得到的结
论吻合[18]。
3 结论
本实验采用了4种体外抗氧化活性评价方法对
山豆根不同溶剂提取物进行实验筛选。结果表明，山
豆根的不同溶剂提取物都具有一定的抗氧化活性，
但它们的抗氧化活性差别较大，其中乙酸乙酯部位
和氯仿部位抗氧化性较强，正丁醇部位和乙醇部位
抗氧化性较弱。此外，在抑菌活性测试实验中，乙酸
乙酯部位和氯仿部位对7种实验菌都显示了一定的
抑制作用，尤其是乙酸乙酯提取物表现了较强的抑
菌性。综合上述结果可得出山豆根乙酸乙酯提取部
分和氯仿提取部分的抗氧化及抑菌活性最好，可将
其作为研究重点，进一步分离有效活性成分，确定山
豆根抗氧化及抑菌的化学物质。
参考文献
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菌种 氯仿部 乙酸乙酯部 正丁醇部 乙醇部
金黄色葡萄球菌 1.25 0.313 2.50 5.00
大肠埃希菌 2.50 1.25 >5.00 >5.00
普通变形杆菌 0.625 0.625 2.50 5.00
铜绿假单胞菌 1.25 2.50 1.25 2.50
肺炎克雷伯氏菌 1.25 1.25 5.00 5.00
乙型溶血性链球菌 1.25 0.625 1.25 5.00
白色念珠球菌 1.25 0.625 >5.00 >5.00
表4 样品对实验菌的最低抑菌质量浓度（mg/mL）
Table 4 MIC of samples to the test bacteria（mg/mL）
（上接第110页）
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