全 文 ：棉 花 学 报 Cotton Science 2013，25（3）：227~233
海岛棉 A亚组和草棉及阿非利加棉单染色体鉴定
程 华 1,2，甘仪梅 3，刘 方 1，蔡小彦 1，王春英 1，王玉红 1，王坤波 1*
（1. 中国农业科学院棉花研究所 / 棉花生物学国家重点实验室, 河南 安阳 455000；2. 安阳工学院, 河南 安阳 455000；
3. 中国热带农业科学院热带生物技术研究所 / 农业部热带作物生物遗传资源重点实验室, 海南 海口 571101）
摘要：以 1 套 13 个陆地棉 A 亚组染色体特异的 BAC 克隆为探针, 与海岛棉 Pima90-53、红星草棉和阿非利加
棉染色体进行荧光原位杂交。 这些探针均在染色体上产生了特异信号，从而鉴别了这 3 个棉种基因组的单染
色体。因此，这套 BAC 克隆也可以作为这 3 个基因组染色体的细胞遗传学标记。在此基础上，对 3 个棉种的 A
（亚）组染色体物理序号进行了命名。 根据这些分子标记和连锁群的关系，染色体物理序号和遗传连锁图谱间
可实现相互转化。 这将有助于研究棉属不同棉种间的起源演化关系，以及新的遗传标记的染色体物理定位和
构建染色体物理图谱等。
关键词：棉花；单染色体；荧光原位杂交；染色体物理序号
中图分类号：S562.035.3 文献标志码：A
文章编号：1002-7807(2013)03-0227-07
Individual Chromosome Identification in G. barbadense cv. Pima 90-53, G. herbaceum
cv. Hongxing, and G. herbaceum Raced Africanum
CHENG Hua1,2, GAN Yi-mei3, LIU Fang1, CAI Xiao-yan1, WANG Chun-ying1, WANG Yu-hong1, WANG
Kun-bo1*
(1. State Key Laboratory of Cotton Biology / Institute of Cotton Research, Chinese Academy of Agricultural Science, Anyang,
Henan 455000, China; 2. Anyang Institute of Technology, Anyang, Henan 455000, China;3. The Institute of Tropical Bioscience
and Biotechnology of Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences / Key Laboratory of Biology and Genetic Resources
of Tropical Crops, Ministry of Agriculture, Haikou, Hainan 571101, China)
Abstract: Cotton is an important commercial crop around the world, however, its chromosomes are too small and similar to iden-
tify by karyotypic analysis and chromosome banding. The cytogenetics of cotton lag behind many other crop species, and the
nomenclature for individual chromosome hasnt been widely accepted except for G. hirsutum. A set of 13 BAC clones specific to
A-subgenome chromosomes of G. hirsutum are labeled and hybridized with the chromosomes in metaphase of A-subgenome of
G. barbadense cv. pima 90-53, G. herbaceum cv. hongxing, and G. herbaceum raced africanum by BAC-FISH. There are distinc-
tive signals on each chromosome, so these BAC clones are proved to be cytogenetic markers to identify each of them. Most of
signals are located on the terminal of chromosomes. The signals on corresponding chromosomes have similar position among the
three cotton varieties. Six BAC clones are consistent with their SSR markers by comparing the physical map of BAC clones with
the genetic linkage map of SSR markers, and the individual chromosome can be linked with the linkage group. The chromo-
somes were numbered as Ab01- Ab13 (or A（AD）2 01- A（AD）2 13) in A-subgenome of G. barbadense, A101- A113 in G. herbaceum,
and A1a01- A1a13 in G. herbaceum raced africanum. The results will help to analyze the origin and evolution of cotton, to orient
new genetic markers on chromosomes, to construct physical map of chromosomes, and so on.
Key words: cotton; individual chromosome; fluorescence in situ hybridization; chromosome numbering
收稿日期：2013-03-06
作者简介：程 华（1979-），女，硕士，讲师，chenghua223@163.com；* 通讯作者，wkbcri@163.com
基金项目：国家 863 计划(2012AA101108-02-05)；农业部保种项目(NB2012-2130135-29B)；农业部 948 项目(2011-G1-04)
棉花是世界上重要的天然纤维作物，又是重
要的油料作物， 具有重要的经济价值和战略地
位。 棉属植物广泛分布于全世界，综合棉花植株
形态特征、地理分布、棉花染色体数目和种间杂
棉 花 学 报 25 卷
交后代减数分裂时期染色体的配对行为，可将棉
属分为 A、B、C、D、E、F、G 和 K 共 8 个二倍体基
因组，有 46 个二倍体棉种（2n=2X=26），5 个四倍
体棉种（AD，2n=4X=52）。这些棉种中共有 4个栽
培种 ，即陆地棉 （(AD)1）、海岛棉 （(AD)2）、草棉
（A1）和亚洲棉（A2）[1]。
棉花染色体数目多、个体小、形态相近，多为
中部或近中部着丝粒类型染色体，且很难通过分
带技术等标记各条染色体[2-3]。 长久以来，一直缺
少有效的方法来识别棉花单染色体。 荧光原位杂
交 （Fluorescence in situ hybridization, FISH）技术
是采用标记荧光素的 DNA探针进行染色体原位
杂交，检测 DNA序列在染色体上的分布。 细菌人
工染色体（Bacteria artificial chromosome, BAC）克
隆外源片段达 100 kb，BAC-FISH 技术的发展使
FISH 的信号检出率大大提高 。 近年来陆地棉
（(AD)1）、亚洲棉（A2）和海岛棉 D 亚组（D（AD）2 ）等
棉种或其亚组的单染色体已成功鉴定，并报道了
染色体物理序号 [4-7]。 本文以一套陆地棉 A 亚组
13个 BAC克隆为探针，采用 BAC-FISH技术，鉴
定了 A 基因组的红星草棉（A1）及草棉变种阿非
利加棉（A1-a）和四倍体栽培种海岛棉 Pima90-53
（(AD)2）的 A 亚组（Ab或 A（AD）2 ）等 3 个棉种的单
染色体，并在此基础上对其染色体物理序号进行
了命名。
1 材料与方法
1.1 试验材料
1.1.1 植物材料及其背景。 研究对象是二倍体的
草棉和四倍体海岛棉的 A（亚）基因组。 试验材料
分别是：海岛棉 Pima 90-53，引自美国。红星草棉，
为国内培育棉种。阿非利加棉为棉属 A基因组的
一个野生棉种（草棉的变种），引自位于德克萨斯
州学院城的美国农业部南方平原农业研究中心
作物资源所，长期保存在我国海南三亚的国家野
生棉种质圃，株号为 D2030202；同时也长期保存
在 中 国 农 科 院 棉 花 研 究 所 温 室 ， 株 号 为
H0000101。
1.1.2 探针。试验用 BAC克隆见表 1。BAC克隆
均由南京农业大学作物遗传与种质创新国家重
点实验室张天真教授惠赠。 这些 BAC 克隆通过
染色体特异的简单重复序列（Simple sequence re-
peat, SSR）标记筛选而来[8]。
1.1.3 部分试剂、酶和试剂盒。 一般化学试剂购
自上海生工，部分为 Sigma 分装产品，银染试剂
由北京双环化学试剂厂生产。 Biotin-nick Trans-
lation Kit、Dig-nick Translation Kit、avidin-fluores-
cein 和 anti-digoxigenin-rhodamine 均系罗氏公司
产品。 引物序列由北京三博远志生物有限责任公
司合成。
1.2 方法
1.2.1 BAC DNA 和基因组 DNA 的提取。 BAC
DNA提取方法采用 SDS—碱裂解法。 由于 BAC
DNA 分子量较大，提取过程中动作要轻柔，以保
证 BAC DNA的质量。 棉花基因组 DNA的提取，
采用宋国立等[10]改良的 CTAB法。
1.2.2 SSR 分子标记的鉴定。 分别以海岛棉 Pi-
ma90-53、红星草棉和阿非利加棉的基因组 DNA
为模板，13 对 SSR 引物 PCR 扩增相应 SSR 分子
标记。 10 μL PCR 反应体系：100 ng 模板 DNA，
0.4 U Taq 酶 ，0.5 μmol·L-1 引物 ，200 μmol·L-1
dNTP。 PCR条件：95℃预变性，2 min；94℃，32 s；
表 1 陆地棉 A 亚组染色体特异 SSR 标记及筛选出的
BAC 克隆
Table 1 Chromosome-specific SSR markers and
BAC clones for A-subgenome of G. hirsutum
注：Ah 表示陆地棉 A 亚组；a： 来源于陆地棉标准系
TM-1 BAC 文库 [4]；b：来源于恢复系 0-613-2R 的 BAC 文
库 [9] 。
Note: Ah means A-subgenome of G. hirsutum; a: The
BACs derived from TM-1 BAC library[4]; b: The BACs de-
rived from 0-613-2R BAC library[9].
染色体
Chromosome
SSR 标记及其大小
SSR markers (size)
BAC 克隆
BAC colones
Ah01 BNL3580 (230 bp) 52D06b
Ah02 BNL3971 (140 bp) 94K09b
Ah03 BNL3441 (205 bp) 104O10a
Ah04 NAU2235 (155 bp) 84C03b
Ah05 BNL2448 (135 bp) 87P01b
Ah06 NAU1277 (275 bp) 47N15b
Ah07 NAU542 (260 bp) 09N05b
Ah08 BNL3627 (180 bp) 35J07a
Ah09 BNL3779 (225 bp) 37F22b
Ah10 BNL2960 (180 bp) 50P05b
Ah11 BNL4094 (190 bp) 14G14a
Ah12 NAU2096 (200 bp) 43C02b
Ah13 BNL1495 (120 bp) 98H10a
228
3 期 程 华等：海岛棉 A 亚组和草棉及阿非利加棉单染色体鉴定
在海岛棉 Pima 90-53 基因组 DNA 中，SSR
标记引物扩增产生的多条带中主带片段大小与
预期大小一致， 或者 PCR 产物所有的片段中含
有与预期大小相一致的条带，说明这些 SSR 标记
在陆地棉和海岛棉中高度保守或保守性较高。
在红星草棉基因组 DNA 中，SSR 标记引物
扩增产生的大部分产物片段大小与预期一致，但
有两个 SSR 标记 BNL3441 (Ah03)和 NAU542
(Ah07)有差异：BNL3441 (Ah03)片段（130）明显小
于预期大小 （205）；NAU542 (Ah07)片段 （250）略
小于预期大小（260）。
在阿非利加棉基因组 DNA 中，SSR 标记引
物扩增产生的大部分产物片段大小与预期也一
致 ， 但 BNL3441 (Ah03)、NAU2235 (Ah04)、NAU
1277 (Ah06)和 NAU542 (Ah07)大小有差异：BNL
3441 (Ah03)片段与红星草棉大小相近（130），明显
小于预期大小（205）；NAU2235 (Ah04)片段（180）
大于预期大小（155）；NAU1277 (Ah06)片段（170）
明显小于预期大小 （275）；NAU542 (Ah07)片段
（240）略小于预期大小（260）。
2.2 三个基因组的单染色体鉴别
分别以陆地棉 A亚组染色体特异 BAC 克隆
55 ℃，46 s；72 ℃，1 min(共 32 次循环，最后一次
循环 94 ℃，1 min；55℃，46 s；72 ℃，5 min)，4 ℃保
存。 聚丙烯酰胺凝胶电泳检测片段大小。
1.2.3 染色体制片。 棉花种子播种于经煮沸消毒
过的潮湿的细沙中，待根长至 3～5 cm 时，取根
尖，放线菌酮（25 mg·kg-1）预处理，固定液固定，
2%纤维素酶和 1%果胶酶酶解后，经 60%乙酸压
片，相差显微镜下镜检，选择分裂相较好且多的
制片保留。 于液氮中冷冻，揭盖片，4℃储存备用。
1.2.4 探针标记。以含有染色体特异的 SSR分子
标记的 BAC 克隆为探针， 同时以 45S rDNA 和
5S rDNA为探针作为阳性对照。 探针采用缺刻平
移法进行标记，BAC DNA 和 5S rDNA 经生物素
缺刻平移试剂盒标记，45S rDNA 经地高辛缺刻
平移试剂盒标记，按罗氏公司提供的标准流程操作。
1.2.5 荧光原位杂交及检测。 荧光原位杂交参照
王春英等[11]提供的流程操作，包括杂交前制片的
准备、配制杂交混合液、杂交、洗脱和荧光观察等
步骤。 杂交混合液含有三种探针各 25～100 ng·
片 -1， 洗脱后， 甩干封阻液， 加 Anti-DIG-Rho-
damine 和 Anti-BIO-FITC 抗体，分别与地高辛和
生物素结合， 使探针显示红色和绿色荧光信号。
每个材料选取 10个以上的细胞观察并分析结果。
2 结果与分析
2.1 SSR 标记在海岛棉、 草棉和阿非利加棉基
因组中的鉴定
将筛选 BAC克隆的 SSR 标记引物对 3 个棉
种的基因组 DNA扩增， 聚丙烯酰胺凝胶电泳检
测。这些 SSR标记引物在 3个棉种基因组中均能
扩增出条带（图 1）。 大部分 SSR标记引物在海岛
棉 Pima 90-53产生了较多的条带。 红星草棉和阿
非利加棉个别 SSR 标记引物产生了较多条带，阿
非利加棉基因组产生的单一条带最多。
a：SSR 标记在海岛棉 Pima 90-53 中 PCR 扩增结果；b：SSR 标记在红星草棉中 PCR 扩增结果；c：SSR 标记在阿非利
加棉中 PCR 扩增结果；M：DNA分子量标准；1-13：分别为 Ah1- 13 号染色体特异 SSR 标记 PCR 扩增产物。
a: PCR products of G. barbadense cv. pima 90-53; b: PCR products of G. herbaceum cv. hongxing; c: PCR products of G.
herbaceum raced africanum; M: DNA marker; 1-13: PCR products of Ah 1-13 chromosomes-specific SSR markers, respectively.
图 1 SSR 筛选标记在海岛棉 Pima 90-53 和红星草棉、阿非利加棉中 PCR 鉴定
Fig. 1 Test of SSR markers in G. barbadense cv. Pima 90-53, G. herbaceum cv. hongxing, and G. herbaceum
raced africanum by PCR
400
350
300
250
200
150
100
400
350
300
250
200
150
100
400
350
300
250
200
150
100
bp M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 111213 bp M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 111213 bp M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 111213
229
棉 花 学 报 25 卷
和 45S rDNA、5S rDNA 共 3 个探针与 3 个棉种
前中期染色体进行双色荧光原位杂交。 经过多次
重复，13 个 BAC DNA 在海岛棉 Pima90-53 根尖
细胞有丝分裂中期 26 条染色单体上都能产生杂
交信号。 通过杂交信号位置、强弱程度、染色体形
态等特征对比分析， 能够较好地配对为 13 对同
源染色体， 表明这些来源于陆地棉的 BAC 克隆
可以作为海岛棉 Pima90-53A 亚组染色体的
FISH标记。 同样，这些 BAC 克隆在 A 基因组两
个棉种红星草棉和阿非利加棉的染色体上也产
生了特异杂交信号。 因此，这些 BAC克隆可以用
来鉴定 3 个棉种的单染色体。 BAC DNA 杂交信
号在染色体上的分布大部分位于染色体近端部，
并且 3 个棉种的 BAC-FISH 杂交信号在染色体
上的分布相似程度较高（图 2）。
2.3 SSR 分子标记与 BAC 克隆在染色体上的
位置比较
所有的陆地棉 A亚组染色体特异 BAC 克隆
在 3个棉种染色体上都产生特异杂交信号。 将这
些产生杂交信号的单染色体与 SSR 分子标记所
A：红星草棉第 01-13 号染色体；B：阿非利加棉第 01-13 号染色体；C：海岛棉 Pima 90-53 第 01-13 号染色体；D：遗传
连锁图（参照 Guo et al., 2007[12]，单位：cM，包括两个末端分子标记和一个染色体特异的 SSR 标记）；绿色信号为 BAC
DNA和 5S rDNA杂交信号，5S rDNA较 BAC DNA 信号明显；红色信号为 45S rDNA。
A: Chromosome 01-13 of G. herbaceum cv. hongxing; B: Chromosome 01-13 of G. herbaceum raced africanum; C: Chro-
mosome 01-13 of G. barbadense cv. Pima 90-53 A-subgenome; D: Linkage map (According to Guo et al, 2007 [12], unit: cM, in-
cluding two ends markers and one chromosome-specific SSR marker); Green signals indicate BAC DNA and 5S rDNA, and 5S
rDNA is brighter than BAC DNA; Red signals indicate 45S rDNA.
图 2 海岛棉 Pima 90-53、红星草棉、阿非利加棉染色体上 BAC 杂交信号物理位置和 SSR 分子标记遗传连锁图谱中的
位置比较
Fig. 2 Contrast SSR markers on linkage map with physical location of BAC clones on 13 individual chromosomes
of G. herbaceum cv. hongxing, G. herbaceum raced africanum and G. barbadense cv. Pima 90-53 (A-subgenome)
230
3 期
在的遗传连锁图绘制成图（图 2）。通过比较发现，
这些 SSR 标记在各棉种染色体上的物理位置较
一致 ，但除了 BNL3971(Ah02)、BNL3441(Ah03)、
NAU2235(Ah04)、NAU542(Ah07)、BNL2960(Ah10)、
NAU2096(Ah12)和 BNL1495(Ah13)在各棉种染色
体上的物理位置和遗传连锁图保持了较好的共
线性关系， 其他 SSR 标记二者的位置差别较大，
如 ：BNL3580 (Ah01)、BNL2448 (Ah05)、NAU1277
(Ah06)、BNL2448 (Ah08)、BML3779 (Ah09)、BNL
4094 (Ah11) 来自于遗传连锁图的中部， 但经
BAC-FISH定位于染色体长（或短）臂近末端。
2.4 单染色体物理序号的命名
这套 BAC 克隆探针分别来自陆地棉 A亚组
01-13号染色体。 根据同源转化的原则，海岛棉 A
亚组 13 对单染色体按照陆地棉 A亚组的顺序进
行编号， 即陆地棉 A亚组 Ah01 号染色体特异的
BAC 克隆与海岛棉 Pima90-53A 亚组杂交的染
色体为 Ab01（或 A（AD）2 01），依次类推到 Ab13（或
A（AD）2 13）；同理，A基因组红星草棉和阿非利加棉
的 13 对单染色体依据陆地棉 A亚组的顺序进行
编号，即 Ah01 号染色体特异的 BAC 克隆与这两
个棉种杂交的染色体为 A101（红星草棉）和 A1a01
（阿非利加棉）， 依次类推到 A113 （红星草棉）和
A1a13（阿非利加棉）。这样，对 3个基因组 13对单
染色体的物理序号分别命名：海岛棉 Pima90-53A
亚组为 Ab01- Ab13（或 A（AD）2 01- A（AD）2 13）；红星草
棉为 A101- A113；阿非利加棉为 A1a01- A1a13。
3 讨论
3.1 棉花染色体物理序号
陆地棉染色体物理序号系基于棉花单体、易
位系等非整倍体材料种间杂交花粉母细胞减数
分裂的染色体行为和棉花形态学标记等命名 [13]，
随后发现的遗传标记即定位于染色体上。Kohel[14]
建议根据陆地棉 A 和 D 亚组染色体的部分同源
关系命名染色体物理序号，即 A亚组染色体分别
命名为 A01-13，D 亚组与 A 亚组同源的染色体
依次命名为 D01-13。该陆地棉染色体物理序号命
名沿用至今。 陆地棉染色体物理序号的确立为其
他棉种的染色体物理序号的命名奠定了基础。 本
文 BAC克隆是来源于染色体特异的 SSR 分子标
记的筛选， 通过分子标记筛选 BAC 克隆经过荧
光原位杂交即 BAC-FISH 技术是鉴定单染色体
的有效手段[15-16]。同时，根据遗传图谱中 SSR标记
所在的位置，即可将 SSR 标记所在连锁群和染色
体物理序号统一起来[8]。
四倍体海岛棉、 达尔文棉和黄褐棉也是 AD
基因组，其染色体物理序号可根据与陆地棉染色
体的同源关系而确立，即根据各种分子标记来识
别染色体。 二倍体 A 和 D 基因组棉花染色体同
样可用这种方法来确立染色体物理序号。 本文经
过多次反复试验， 验证了陆地棉单染色体特异
BAC克隆在海岛棉 Pima90-53A亚组、 红星草棉
和阿非利加棉染色体上均有特异信号，这些 BAC
克隆也可作为这 3 个棉种单染色体细胞学标记，
这就为 3 个棉种的染色体物理序号的确立提供
了一条可行的途径。四倍体棉种由二倍体 A和 D
基因组棉种组合演变而来，在进化过程中，四倍
体棉种 A 亚组第 2、3 染色体之间和第 4、5 染色
体之间发生了两次易位。 经过多个染色体特异的
BAC 克隆同时标记， 证明这几条染色体特异的
BAC 克隆未涉及到易位区段 [6]，因此，这些 BAC
克隆仍可同时作为四倍体和二倍体的染色体特
异的细胞学标记。 棉属染色体物理序号的统一，
有望加快棉属基因组学和棉花遗传育种的研究
进程。 但是，并不是所有的棉种都能采用这种方
法对染色体进行命名。 经这套 BAC克隆鉴定，雷
蒙德氏棉部分 BAC 克隆同时存在于多条染色
体上[17]。
3.2 BAC克隆在不同棉种的比较物理作图
以 3 个棉种基因组 DNA 扩增 SSR 标记引
物， 海岛棉与陆地棉 A亚组中，SSR 标记的大小
保持了较好的一致性。 但在红星草棉和阿非利加
棉中， 个别 SSR 标记扩增的片段大小与预期不
同，说明这些 SSR 标记在这两个棉种中与陆地棉
存在多态性，其串联重复数有差异。 然而，这种串
联重复数的差异并不影响 BAC 克隆作为染色体
的细胞遗传学标记。 由 BAC-FISH在不同物种间
比较共同的遗传标记在染色体上的分布，揭示染
色体或染色体片段的共线性关系，进行比较物理
作图，进一步分析不同物种的基因组结构及基因
程 华等：海岛棉 A 亚组和草棉及阿非利加棉单染色体鉴定 231
棉 花 学 报 25 卷
组进化历程[18-20]。 四倍体陆地棉和海岛棉 SSR 标
记大小和 BAC 克隆在染色体上的物理位置基本
一致，二者 A 亚组染色体亲缘关系较近，其二倍
体供体种也可能相同。BAC克隆在 3个棉种染色
体上的物理位置相对一致，这进一步证明了四倍
体陆地棉和海岛棉 A亚组可能是起源于草棉。四
倍体和二倍体 A（亚）基因组 SSR 分子标记大小
的不同，很可能是在基因组多倍化进程中产生的
重复数差异。 阿非利加棉是草棉的变种，作为野
生棉其更有可能是四倍体 A亚组的供体种。以不
同的二倍体 A 基因组为探针与四倍体棉种染色
体进行基因组原位杂交 （Genome in situ hy-
bridization, GISH）， 对比 DA 值分析产生的信号
强度， 以及杂交信号在染色体上分布的信号模
式，阿非利加棉可能是所有供试的四倍体棉种 A
亚组的供体种[21-22]。
3.3 单染色体鉴定与分子标记定位
通过分析 SSR 分子标记在遗传连锁图和染
色体上物理位置的关系，这些 SSR 分子标记在不
同棉种间保持了较好的共线性关系，但一些 SSR
标记与其相应的 BAC 克隆在染色体上的位置不
一致。 这可能是由于连锁群的覆盖率较低造成
的[8]。大部分的 BAC克隆杂交信号分布在染色体
近末端， 说明染色体的亚端部是重组活跃区，这
与水稻、高粱、金鱼草等植物中基因的分布是相
似的[23-24]。
另外，还有许多遗传标记有待定位于特定染
色体上。 真核细胞核糖体 DNA（rDNA）具有高度
保守的重复序列，分析不同棉种间 rDNA 分布的
多态性，可进一步研究棉属不同棉种间的亲缘关
系和进化历程。 将 rDNA 和染色体特异的 BAC
克隆共标记，即可分析特定染色体上 rDNA 分布
的特点， 便于对 rDNA 进行定性和定量的分析。
将这些特定的 DNA 序列在染色体上定位和排
序，并构建棉花染色体物理图谱。 棉花染色体物
理图谱发展相对滞后。 棉花单染色体鉴定技术的
发展，必将推动棉花染色体物理图谱的构建。
参考文献：
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