全 文 ：华 南 理工 大 学 学 报 (自 然 科 学 版 )
第 34卷 第 5期 Journa l o f South China Unive rsity of Techno logy Vo.l 34　No. 5
2006年 5月 (Na tura l Science Ed ition) M ay　2006
文章编号:1000-565X(2006)05-0043-05
　
　收稿日期:2005-07-12
*基金项目:广东省重点科技攻关项目(A301020201)
　作者简介:谢秀祯(1960-), 男 , 在职博士生 , 海南师范大
学教授 , 主要从事基因工程的研究. E-m a il:x iex iuzhen@
sina. com
† 通讯作者:郭勇 , 教授 , E-m ail:btyguo@ scu.t edu. cn
根癌农杆菌介导的玫瑰茄细胞遗传转化*
谢秀祯　林俏慧　郭成栓　郭　勇†
(华南理工大学 生物科学与工程学院 , 广东 广州 510640)
摘　要:以玫瑰茄无菌苗的子叶和下胚轴为受体材料 ,农杆菌 LBA4404和 EHA105为供
体菌株 ,对玫瑰茄细胞外植体遗传转化的基本条件进行研究 ,建立了一个高效的玫瑰茄细
胞遗传转化体系.利用这一转化体系获得了 2个稳定表达新霉素磷酸转移酶活性的玫瑰
茄转化细胞系. β-葡萄糖苷酸酶活性的组织化学检测和 PCR扩增鉴定的结果表明 ,外植
体总转化率达 29. 4%.试验结果还显示农杆菌 LBA4404菌株较适合玫瑰茄外植体的转
化 ,转化时不需添加乙酰丁香酮.
关键词:玫瑰茄;根癌农杆菌;遗传转化;β-葡萄糖苷酸酶;新霉素磷酸转移酶
中图分类号:Q 812　　　　文献标识码:A
　　玫瑰茄 (Hibiscus sabdariffa L. )是锦葵科木槿属
一年生草本植物 ,原产非洲苏丹 ,分布于热带 、亚热
带地区 ,当前在我国广东 、广西 、云南 、浙江 、江西 、福
建 、台湾广泛种植.玫瑰茄是一种具有多种经济用途
的作物 ,其花萼合成的花青苷色素作为一种天然色
素 ,已广泛应用于食品及饮料工业 [ 1] ;此外玫瑰茄
细胞产生的花青苷还具有抗氧化 、抗突变作用 [ 2] ,
可用于治疗高血压 、心脏病 、发烧 、发炎 、肝脏机能障
碍和免疫系统紊乱等 [ 3-4]疾病 ,因此受到医学界的
普遍重视.据报道 ,玫瑰茄的提取物对肿瘤 、白血病
和胆固醇引起的动脉粥样硬化具有良好的治疗效
果 [ 5] . Chang等[ 6]和 Lin等[ 7]通过研究初步揭示了
玫瑰茄提取物诱导人前髓白血病细胞和胃癌细胞发
生细胞凋亡的机理 ,从而为将玫瑰茄提取物开发成
肿瘤预防和治疗药物奠定了理论基础.
自 20世纪 90年代以来 ,国内外学者对利用玫
瑰茄细胞培养技术生产花青苷进行了广泛的研究 ,
并取得了可喜的成果 [ 8] ,但从目前的研究结果来
看 ,生产周期长 (约 16天)已经成为制约这一技术
走向产业化的瓶颈之一.因此 ,如何获得快速增殖的
玫瑰茄细胞系已成为一个急需解决的问题. 一条可
供选择的技术路线就是通过植物基因工程技术将诸
如拟南芥 Phy tosu lfok ine-α的基因导入玫瑰茄细胞 ,
以期获得快速增殖的细胞系 ,在此基础上筛选花青
苷高产细胞株.尽管至今鲜见玫瑰茄遗传转化的报
道 ,但现有的多种技术路线可供借鉴 ,其中农杆菌介
导的遗传转化技术最为成熟. 本文中报道了通过农
杆菌介导转化玫瑰茄外植体获得转基因愈伤组织和
转基因细胞系的条件和技术方案. 这将为利用基因
工程培育花青苷高产新品系创造条件.
1　材料与方法
1. 1　材料
1. 1. 1　植物材料
玫瑰茄种子来源于华南植物园引种部.
1. 1. 2　农杆菌菌株和质粒
根癌农杆菌 (Agrobacterium tumefaciens)菌株
LBA4404和 EHA105,植物表达载体 pB I121.
1. 1. 3　酶和试剂
聚合酶 TaqDNA购自大连宝生生物公司;PCR
引物由上海 B ioasia生物技术有限公司合成;卡那霉
素(Km)为 S igma公司产品;硫酸链霉素 (Str)为
Am resco公司产品;乙酰丁香酮 (AS)为 A ldrich公司
产品;X-G luc 为 Genv iew 公司产品;头孢霉素
(Ce fo)、氯霉素 (Cm)及其他试剂为国产或进口分装
分析纯.
1. 1. 4　培养基
YEB(Yeast Extrac t B roth)培养基:酵母浸出粉
1.0g,蛋白胨 5.0 g,蔗糖 5.0g, MgSO4 0.493g, pH =
7.2.侵染液为 B5培养基附加质量分数为 2%的蔗
糖 , pH =5.8.
预培养基 、共培养基和愈伤组织诱导培养基成
分相同 ,其组成为 B5培养基附加 1mg /L二氯苯氧
乙酸 (2, 4-D), 0.1mg /L激动素 (KT),质量分数为
3%的蔗糖和质量分数为 0. 8%的琼脂 , pH =5.8.愈
伤组织继代培养基的组成为 B5培养基附加 2mg /L
2, 4-D, 0.1mg /L KT ,质量分数为 3%的蔗糖和质量
分数为 0.8%的琼脂 , pH =5.8. 细胞悬浮培养基组
成为 B5培养基附加 1mg /L 2, 4-D, 0.1mg /L KT和
质量分数为 2%的蔗糖 , pH =5.8.
1. 2　方法
农杆菌感受态细胞的制备以及质粒在不同农杆
菌菌株上的加载按文献 [ 9]进行操作 ,获得的单菌
落按文献 [ 9]提取质粒进行验证.
1. 2. 1　农杆菌的活化
农杆菌在含有 50mg /L Km 和 25mg /L S tr或
34mg /L Cm的 YEB培养基上划线暗培养 (28℃).
长出菌落后挑取单菌落在新的选择培养基上涂平
皿 ,取适量培养 48 h后的菌体悬浮于侵染液中 ,可
同时加入终浓度为 100μmo l /L的 AS, 27 ～ 28℃,
180 r /m in培养 30m in后 ,调整侵染液菌含量 ,使吸光
度 A600至合适的数值用于浸染.
1. 2. 2　玫瑰茄外植体及其预处理
将玫瑰茄无菌苗分成子叶 、下胚轴下段和下胚
轴上段 3部分. 子叶剔除叶脉后剪成 0.5 cm ×
0.5 cm 的小块 ,下胚轴则切成 0. 8 ～ 1 cm长的切段.
外植体预培养一段时间.
1. 2. 3　农杆菌侵染及共培养
将玫瑰茄外植体浸泡于上述活化的农杆菌悬浮
液 ,间歇摇动使外植体与菌液充分接触.浸泡一定时
间后 ,取出外植体用无菌滤纸吸干表面菌液 ,转入固
体共培养基中 ,于 25℃、黑暗条件下共培养 2 ～ 3天.
1. 2. 4　抗性愈伤组织的筛选
将共培养后的外植体转移到含适当质量浓度
Km和 300mg /L C efo的愈伤组织诱导培养基上 ,在
黑暗条件下 25℃选择培养. 待长出愈伤组织后 ,再
将其切下并转移到逐步提高 Km质量浓度的选择培
养基上进行继代培养 ,以消除生理抗性带来的假阳
性. 培养条件为 25℃,光照强度为 1 400 Lx,光周期
为光照 16 h /d.
1. 2. 5　抗性细胞系的获得
将经 3次继代培养的适量愈伤组织转移到含
100mg /L Km 和 300mg /L C efo的悬浮培养基中 ,
25℃, 100 r /m in,微光照培养 , 2 ～ 3周继代一次. 最
后 2次继代时 ,培养基中不加 Km. 取适当细胞密度
的培养物作平板培养 , 25℃微光照培养 12天 ,分别
计算有无 Km条件下细胞的植板率 ,借此检测其 Km
抗性的遗传稳定性.
1. 2. 6　GUS活性的检测
组织化学法检测.将待检愈伤组织切成小块 ,用
无菌水泡洗数次 , 无菌滤纸吸干后 ,取一小块加入
50μL X-G luc反应液 , 37℃保温 12h,观察蓝色反应.
1. 2. 7　转化材料的 PCR检测
从转化材料中提取植物总 DNA进行 PCR扩增
鉴定. DNA粗提液微量制备按文献 [ 18]的方法进
行. 以转化材料的 DNA为模板 ,未转化材料的 DNA
作阴性对照.用 CaMV 35S启动子引物 5′ATGACG-
CACAATCCCACTATCCTTCG 3′和 Nos终止子引物
5′GATAATCATCGCAAGACCGGCAACAG3′对 gus基
因进行 PCR扩增. 扩增条件为:94℃预变性 4m in,
94℃变性 1m in, 55℃退火 45 s, 72℃延伸 1m in , 30
个循环后于 72℃继续延伸 10m in. 预期扩增片段大
小为 2 063 bp.
用 nptⅡ基因的两个引物 5′GACTGGGCACAA-
CAGACAATCGG3′和 5′AGCAATATCACGGGTAGC-
CAACG 3′对转化细胞总 DNA进行 PCR扩增 ,扩增
条件为:94℃预变性 4m in后 , 94℃变性 45 s, 55℃
退火 30 s, 72℃延伸 45 s, 30个循环后于 72℃继续延
伸 10m in.预期扩增片段大小为 621bp.
2　结果与讨论
2. 1　外植体的选择
选择 7 ～ 18天龄的玫瑰茄无菌苗 ,将它分为子
叶 、下胚轴上段和下胚轴下段进行愈伤组织诱导 ,结
果显示 ,用玫瑰茄下胚轴下段作外植体 ,愈伤组织诱
导效果最好 ,诱导率达 93.94% ～ 100%,子叶次之 ,
而下胚轴上段最差.另外 ,我们还发现苗龄的长短对
愈伤组织诱导率也有一定的影响 , 10 ～ 12天龄的无
菌苗诱导效果最好 ,其子叶和下胚轴的诱导率分别
达到 93. 7%和 100%.以上结果表明了不同的苗龄 、
44 华 南 理 工 大 学 学 报 (自 然 科 学 版) 第 34卷
不同的外植体种类 、甚至是同一组织器官的不同部
位 ,其愈伤组织诱导率是不同的 ,这可能是这些材料
在内源激素水平和细胞全能性潜在趋势上存在较大
差异所致.为了获得较高的转化率 ,一般都选择愈伤
组织诱导率高的外植体作为转化的受体材料. 因此 ,
选择 10 ～ 12天龄的玫瑰茄无菌苗的子叶和下胚轴
下段作为转化的受体.
2. 2　外植体对卡那霉素和头孢霉素的敏感性
共培养后的脱菌和转化体的选择是转化体系的
关键操作.抗生素敏感性试验结果表明 ,随着 Km质
量浓度的提高 ,外植体的死亡率也随着增大;当 Km
质量浓度达到 50mg /L 时 , 外植体的死亡率达到
100%,愈伤组织的诱导率为 0,可见卡那霉素是玫
瑰茄细胞的有效选择标记.因此 ,用玫瑰茄子叶和下
胚轴进行遗传转化时 , Km的质量浓度为 50mg /L.
用类似的方法 ,我们还测得培养基中头孢霉素的质
量浓度为 300mg /L时 ,对外植体诱导愈伤组织及其
后愈伤组织的生长没有影响 ,但已能有效地控制农
杆菌的增殖.
2. 3　预培养时间对转化的影响
将下胚轴下段接入预培养基上进行不同时间的
预培养后 , 于 A600为 0.5的 LBA4404菌液中侵染
10m in,共培养 3天 ,再进行 GUS染色鉴定 ,统计 gus
基因瞬时表达率和外植体褐化率 ,结果见图 1. 图 1
显示 ,预培养对玫瑰茄外植体的转化率有一定的影
响 ,经过 2 ～ 3天预培养的外植体的 gus基因瞬时表
达率比没经培养的高.当预培养时间超过 3天时 , gus
基因表达率有所下降 ,而褐化率有所增高. 因此 ,玫瑰
茄下胚轴在转化前最好经 2 ～ 3天的预培养.
图 1　预培养时间对外植体转化的影响
F ig. 1　Effec t o f pre-cu ltiva tion tim e on gene tic transform ation
o f exp lants
　　有研究结果表明[ 9] ,外植体在转化前进行预培
养有利于促进细胞分裂 ,而处于分裂状态的细胞更
容易整合外源 DNA ,从而提高外源基因的瞬时表达
率和转化率.但有时也得到相反的结果. 因此 ,在转
化前外植体是否要预培养 ,预培养多长时间 ,需要根
据不同植物 、不同外植体而定.
2. 4　农杆菌菌株和 AS对转化的影响
在本实验中 ,采用两种常用的 、遗传背景不同的
农杆菌菌株(LBA4404和 EHA 105)对经预培养 2天
的玫瑰茄下胚轴下段进行转化 (菌液吸光度 A600 =
0.5,侵染时间为 10m in),并比较添加 (添加量为
100μmo l /L)和不添加 AS对转化效果的影响. 经过
3天共培养后 ,统计 GUS组织化学反应呈阳性的外
植体所占的比例 ,结果见图 2.
图 2　AS和不同农杆菌菌株对外植体遗传转化的影响
F ig. 2　E ffec t of AS and differen tA. tum efaciens strains on ge-
ne tic transform ation of explants
　　由图 2可见 ,两种菌株对玫瑰茄外植体的侵染
能力有较大的差异 , 无论是否添加 AS , 菌株
LBA4404的侵染能力都明显强于菌株 EHA105. 另
外 ,在菌悬液和共培养基中无论加与不加入 AS对
gus基因的瞬时表达影响均不大 ,这说明玫瑰茄下
胚轴在受到创伤时能渗出足以活化 vir基因的酚类
物质 ,使 T-DNA向植物细胞转移. 因此 ,可选用菌株
LBA4404对玫瑰茄无菌苗下胚轴进行转化 ,转化时
不必加入 AS.
农杆菌作为植物遗传转化的工具 ,其属性对转
化的成功有决定性的影响.根据转化能力的强弱 ,农
杆菌分为超毒株和普通株. 研究结果[ 10]表明 ,不同
植物对农杆菌侵染的敏感性不同 ,而同一种植物对
不同的农杆菌菌株也具有不同的敏感性.在本试验
中 ,普通株 LBA4404的转化率明显高于超毒株
EHA 105,这可能跟玫瑰茄细胞的受伤分泌物 、细胞
的内源激素及细胞壁的结构等有关. 另外 , 还有研
究[ 11]显示 ,在酸性条件下添加一定量的外源酚类化
合物 (如 100μmo l /L AS)对农杆菌转化某些植物可
起到较好的促进作用 ,但在本试验中 , AS的作用并
不明显 ,这可能跟植物的基因型有关.
45　第 5期 谢秀祯 等:根癌农杆菌介导的玫瑰茄细胞遗传转化
2. 5　菌液中农杆菌含量对转化的影响
分别用 5种不同菌含量的农杆菌 LBA4404菌
液侵染外植体 10m in,结果(见图 3)表明 ,当菌含量
对应的 A600小于 0.55时 ,随着菌含量的提高 , gus基
因的瞬时表达率也随着增加 ,并且在 A600为 0.55左
右时达到最高值 50.6%. 菌液 A600超过 0.55后 ,不
仅 gus基因的瞬时表达率有所降低 ,而且外植体的
褐化死亡加剧 ,尤其是 A600达到 0.95时 ,外植体的
褐化率达到 18%,且抑菌很困难 ,即使在 500mg /L
Cefo的作用下 ,培养 3天后外植体也被繁殖的农杆
菌包裹 ,最后褐化死亡. 鉴于此 , 建议用 A600为 0.5
左右的菌液侵染玫瑰茄外植体.
图 3　A. tum efaciens含量对外植体遗传转化的影响
F ig. 3　Effect o fA. tumefaciens content on genetic transform a-
tion of explan ts
2. 6　共培养时间对转化的影响
用 A600约为 0.5的农杆菌 LBA4404侵染经过 3
天预培养的玫瑰茄下胚轴下段 10m in,在不同的共
培养时间取样进行 GUS染色鉴定 ,统计下胚轴 gus
基因瞬时表达率和褐化率 ,结果如图 4所示.由图可
见 ,开始时 ,随着共培养时间的延长 ,外植体的 gus
基因表达率也随着提高 , 3天时达到最高值 49%,此
后 gus基因表达率有所下降 ,同时外植体的褐化率
急剧增大 ,到 6天时褐化率达到 45.2%.
图 4　共培养时间对外植体遗传转化的影响
F ig. 4　Effect of co-cultiv ation time on genetic transfo rm ation o f
exp lants
　　由于农杆菌的附着 、T-DNA的转移及整合都是
在共培养时期完成的 ,因此农杆菌与外植体的共培
养是整个转化过程中非常重要的一个环节. 共培养
时间必须超过 16 h的细胞调节期 ,但共培养时间太
长 ,则会因为农杆菌过度生长使植物细胞受到毒害
而死亡.因此 ,本试验的共培养时间选择 3天为宜.
2. 7　抗性愈伤组织的检测和鉴定
从本试验获得的 Km抗性愈伤组织中随机挑取
10块 ,用组织化学法测定细胞 GUS活性 ,其中 7块
有阳性反应 , 3块为阴性反应 ,阴性对照无蓝色反
应. 进一步用 CaMV 35S启动子和 N os终止子特异
性引物对 7块有 GUS阳性反应的愈伤组织总 DNA
进行 PCR扩增 ,均得到预期扩增片段约 2 060 bp的
条带 ,与质粒 DNA扩增出的条带大小相同 ,而未转
化的愈伤组织的 DNA中未扩增出相应的条带 (见
图 5). 这表明通过外植体 -农杆菌共培养法已经将
外源 gus基因导入了玫瑰茄细胞并获得表达 ,外植
体总转化率为 29.4%.
图 5　转化愈伤组织的 PCR扩增结果
F ig. 5　PCR am plification results of transgenic ca lli
M— DNA M arker;1—阳性对照;2—阴性对照;3～ 9—转化愈伤组织
本试验中 , PCR分析鉴定结果显示 ,并不是所
有抗性愈伤组织都表现出阳性反应 ,仍然有假转化
体存在.当然 ,假转化体的产生是目前遗传转化中普
遍存在的现象.
2. 8　抗性细胞系的获得及其检测
抗性愈伤组织经过原代和 5次继代悬浮选择培
养后得到抗性细胞系 ,再经无选择压力下继代培养
2代 ,培养物在含 Km和不含 Km的平板中培养 ,其
植板率没有明显差别(见表 1).进一步用 nptⅡ基因
特异引物进行 PCR扩增 ,得到了预期扩增片段 ,大
小约 620 bp(见图 6). 说明转化细胞系的 nptⅡ能稳
定表达和遗传.
表 1　Km抗性细胞系的遗传稳定性检测
Table 1　De tec tion o f gene tic stab ility of Km re sistant cell lines
抗性细胞系 有 Km时的植板率 /% 无 Km时的植板率 /%
KRS-1 8. 03 8. 12
KRS-2 7. 96 8. 05
46 华 南 理 工 大 学 学 报 (自 然 科 学 版) 第 34卷
图 6　转化细胞系的 PCR扩增结果
F ig. 6　PCR amp lification results of transgenic ce ll lines
M—G eneRu lerTM 100bp DNA Ladder Plus;1—阳性对照;
2—阴性对照;3～ 4—转化细胞系
3　结论
通过研究 ,初步建立了一套高效的农杆菌介导
的玫瑰茄细胞遗传转化体系.该体系的操作程序如
下:(1)取 10 ～ 12天龄玫瑰茄无菌苗下胚轴下段 ,
切成 0.8 ～ 1 cm长的切段 ,在预培养基中 25℃培养
2 ～ 3天;(2)把外植体浸泡在 A600约为 0.5的根癌
农杆菌 LBA4404菌液中 10m in后 ,取出 ,用无菌滤
纸吸干菌液;(3)置共培养基上 ,于黑暗条件下 25℃
共培养 3天;(4)将外植体转移到附加 50mg /L Km
和 300mg /L Cefo的愈伤组织诱导培养基上 ,于 25℃
选择培养 , 2 ～ 3周继代一次;(5)取适量 3次继代后
的抗性愈伤组织接入悬浮培养基中 , 25℃, 100 r /m in
培养 2 ～ 3周后 ,继代培养获得抗性细胞系;(6)用
组织化学法和 PCR扩增法鉴定转化愈伤组织和细
胞系.
利用上述转化体系 ,已成功地将外源基因导入
玫瑰茄细胞 ,获得稳定表达 GUS的转化愈伤组织和
稳定表达 NPTⅡ的转化细胞系.抗性愈伤组织生成
率达 42%,其中 GUS阳性率为 70%,总的外植体转
化率达 29.4%. 此外 ,本试验结果还证明了 AS对玫
瑰茄的转化效果没有明显的影响;农杆菌普通株
LBA4404更适合于玫瑰茄的转化. 这一简单而有效
的转化方法将为玫瑰茄的品种改良和细胞株的选育
提供新的途径.
参考文献:
[ 1] 　李玉萍. 玫瑰茄及其利用 [ J] . 世界热带农业信息 ,
2003(11):24-26.
L i Yu-ping. Hibiscus Sabdariffa L. and its u tiliza tions
[ J] . T rop ica lAg ricu ltu re In fo rm ation o f theW orld, 2003,
(11):24-26.
[ 2] 　Tsa ia P i-jen , JohnM c Intoshb, Ph ilip Pea rceb, e t a .l An-
thocyanin and an tiox idant capacity in Rose lle (H ibiscus
Sabdariffa L. ) extrac t[ J] . F ood Resea rch In te rnational,
2002, 35:351-356.
[ 3] 　Dafa llah A A, al-M ustafa Z. Investigation of the anti-in-
flamma to ry activ ity of Acacia n ilotica andH ibiscus sabda-
riffa [ J] . Am J Ch in M ed, 1996, 24:263-269.
[ 4] 　H a ji F M , H a ji T A. The effect o f sour tea (H ibiscus sab-
dariffa) on e ssentia l hypertension [ J] . J Ethnopha r-
m aca l, 1999, 65:231-236.
[ 5] 　Chen C C, H su J D, W ang S F, e t a .l H ibiscus sabdariffa
ex trac t inhibits the deve lopm ent o f athe rosclero sis in cho-
le ste ro l-fed rabb its [ J] . J Ag ric Food Chem , 2003, 51:
472-477.
[ 6] 　Chang Y C, H uang H P, H su J D, et a.l Hibiscus an thocya-
nins rich ex trac t-induced apoptotic ce ll death in hum an
promye locy tic leukem ia cells[ J] . Tox ico logy and Applied
Pha rmaco logy, 2005, 205:201-212.
[ 7] 　L in H H , Huang H P, Huang C C , e t a.l H ibiscus po lyphe-
no l-rich ex tract induce s apoptosis in hum an gastric carci-
nom a cells v ia p53 pho spho ry lation and p38MAPK /FasL
cascade pathw ay [ J] . Mo lecu lar Carcinogenesis, 2005, 43
(2):86-99.
[ 8] 　阮茜 ,郭勇. 磷限制培养中玫瑰茄细胞生长及花青苷
形成动力学 [ J] . 华南理工大学学报:自然科学版 ,
1999, 27(1):86-90.
Ruan Q ian, Guo Yong. Dynam ics on the g row th o fH ibiscus
sabdariffa L. cell and the fo rm a tion of anthocyanin in
phosphorus-lim ited culture [ J] . Journa l of South China
University of Techno logy:Na tu ra l Science Edition, 1999,
27(1):86-90.
[ 9] 　王关林 ,方宏筠. 植物基因工程 [M ] . 北京:科学出版
社 , 2002.
[ 10] 　Kazuhito A, H ideak i S, Sho zo O, et a.l E fficien t transfo r-
m ation o f Arabidopsis thaliana:comparison o f the effi-
c iencies w ith various o rgans, plan t eco types and
Agrobacterum stra ins [ J] . P lant Ce ll Rep, 1992, 12:7-11.
[ 11] 　李学宝 , 白永延 ,许智宏 , 等. 紫云英细胞转化条件的
研究 [ J] .植物学报 , 1994, 36(6):437-443.
L i Xue-bao, Ba i Yong-yan, Xu Zh i-hong, e t a .l S tudy on
the conditions of ce ll transfo rm ation in Astraga lus sinicus
[ J] . A c ta Botanica S inica, 1994, 36(6):437-443.
(下转第 52页)
47　第 5期 谢秀祯 等:根癌农杆菌介导的玫瑰茄细胞遗传转化
bio log ica S inica, 2002, 42(6):657-661.
[ 10] 　罗立新,汪薇,潘力.粘细菌发酵生产新型微生物药物的
初步研究 [ J] .食品与发酵工业 , 2005, 31(7):10-12.
Luo L i-xin, W angW ei, Pan L .i A new k ind of m ic robio-
log ica l drug produced by fe rm en ta tion of myxobacteria
[ J] . F ood and Ferm entation Industrie s, 2005, 31(7):
10-12.
[ 11] 　王菊芳 , 吴晖.前体物质对阿维菌素生物合成的影响
[ J] . 华南理工大学学报:自然科学版 , 2002, 30(5):
16-18.
W ang Ju-fang, W u Hu.i P rocursor on the Averm ectins
biosynthe sis [ J] . Jou rna l of South Ch ina University of
Technology:Na tu ra l Science Ed ition, 2002, 30 (5):
16-18.
Optmi ized Conditions for Producing Epothilone v ia
Fermentation of Sorangium cellulosum
Luo Li-xin　Wang Wei　Lu Y i-m ing　Pan Li　Sa Si-lin　Kong Jun-wen
(Co llege o f B io log ica l Science and Enginee ring, Sou th China Univ. of Tech. , Guangzhou 510640, Guangdong, China)
Abstract:This pape r focuses on the production of epo thilone, a kind o f secondary anti-cancerme tabo lite fermented
by Sorangium cellu losum DSM 11999. The results show that, respectively w ith pota to starch and peptone as the car-
bon source and the nitrogen source, and w ith the addition ofM nC l4 , EDTA-Fe-Na, K 2HPO 4 , ZnC l2 , CuSO 4 and
grow th factor a lanine, epo th ilone can be produced v ia the fermen tation o f Sorang ium ce llu losum DSM 11999 in the
late exponential phase at 25℃, w ith a yie ld increased by 22. 5%.
Key words:Sorang ium cellulosum;fe rm enta tion;epothilone;op tim ization
　(上接第 47页)
Agrobacterium tumefaciens-Mediated Genetic Transformation
of Roselle Cell
X ieX iu-zhen　Lin Q iao-hu i　GuoCheng-shuan　Guo Yong
(Co llege of Bio log ica l Sc ience and Eng ineering, South China Univ. o f T ech. , Guang zhou 510640, Guangdong, China)
Abstract:By using Agrobacterium tum efaciens strains LBA4404 and EHA105 as the dono r strains, the co tyledon
and hypoco ty l o f sterile seedling of rose lle as the recipientm aterials, the basic conditions for the gene tic transform a-
tion of Roselle ce ll in v itrow ere investiga ted. Then a h igh-e ffic iency gene tic transforma tion system w as established,
by wh ich tw o transgenic Rose lle ce ll lines tha t stably express the activity o f neomyc in phospho transfe raseⅡwe re ob-
tained. The results of β-g lucu ronidase histochem ical assay and PCR amplification demonstrate tha t the overall trans-
fo rmation rate of the explant reaches 29. 4%, and that, as compared w ith the strain o f EHA105, the strain o f
LBA4404 is more suitable fo r the transform ation of Rose lle explan ts because no ace tosyringone is needed.
Key words:Roselle;Agrobacterium tumefaciens;genetic transfo rmation;β-g lucuronidase;neomycin phospho trans-
feraseⅡ
52 华 南 理 工 大 学 学 报 (自 然 科 学 版) 第 34卷