全 文 ：收稿日期:2013-11-25 接受日期:2014-04-29
基金项目:湖南省中医药管理局项目(2009033;201232) ;湖南省
大学生创新课题(2013-119)
* 通讯作者 Tel:86-015974203263;E-mail:cxy53@ 126． com;479157643@
qq． com
天然产物研究与开发 Nat Prod Ｒes Dev 2014，26:1081-1085
文章编号:1001-6880(2014)7-1081-05
冠盖藤水提物对大鼠膝骨性关节炎 COX2、NO、iONS
表达及关节组织形态学的影响
叶丽芝1，2，秦莉花3，4，陈晓阳1，2* ，李 晟2，4* ，
黄 宽1，2，吴奇峰5，唐文富5，刘 容5，贺立娟5
1湖南中医药大学药学院;2 中药现代化教育厅重点实验室;3 中药药性与药效国家中医药管理局重点实验室;
4湖南中医药大学护理学院;5 湖南中医药大学中西结合学院，长沙 410208
摘 要:研究冠盖藤水提物对膝骨性关节炎大鼠血液及关节液 COX2、NO、iONS含量的影响。将 SD大鼠分为正
常对照组、模型组、阳性组(硫酸氨基葡萄糖组)、冠盖藤中、高剂量组，制备 4%木瓜蛋白酶溶液与 0． 3 mol /L半
胱氨酸溶液(1∶ 1)的混合液，分别于第 1、3、7 d注入 SD大鼠右膝关节造模，每次 20 μL。冠盖藤中、高剂量组以
4． 62 g生药 /kg、9． 24 g生药 /kg，阳性组以 0． 133 mg /kg硫酸氨基葡萄糖分别灌胃，正常对照组和模型组分别予
以等量蒸馏水;连续给药 4 周后，进行指标测定。与模型组比较，冠盖藤中、高剂量组血液及关节液中 COX2、
iONS、NO含量明显降低，能有效抑制关节软骨组织形态的改变，间接保护软骨细胞和促进受损软骨细胞恢复的
作用。冠盖藤能有效抑制关节液中 COX2、NO、iONS表达，保护软骨细胞和促进受损软骨细胞恢复的作用，是延
缓关节软骨退变的机制之一。
关键词:冠盖藤;骨性关节炎;COX2;NO;iONS;软骨组织形态
中图分类号:Ｒ9 文献标识码:A
Effects of Pileostegia viburnoides Water Extract on the Expression of COX2，
NO，iONS and Joint Histomorphology of Ｒats with Knee Osteoarthritis
YE Li-zhi1，2，QIN Li-hua3，4，CHEN Xiao-yang1，2* ，LI Sheng2，4* ，
HUANG Kuan1，2，WU Qi-feng5，TANG Wen-fu5，LIU Ｒong5，HE Li-juan5
1College of Pharmacy，Hunan University of Chinese Medicine;2Key laboratory of education department on
Chinese medicine modernization;3Key laboratory of State Administration of Traditional Chinese Medicine on
drug properties and effects;4College of Nursing，Hunan University of Chinese Medicine;5College of Integrated
Traditional Chinese and Western Medicine，Changsha 410208，China
Abstract:In this study，the effect of Pileostegia viburnoides water extract on the contents of COX2，NO，iONS in blood
and joint fluid of rats with knee osteoarthritis was studied． The SD rats were randomly divided into 5 groups:normal con-
trol group，model group，GS-positive group (glucosamine sulfate group) ，P． Viburnoides middle dose group and P． viburn-
oides high dose group． The rat model with knee osteoarthritis was built by injecting a mixture of 4% papain solution and
0． 3 mol /L cysteine solution (1∶ 1)into the right knee joint of SD rat at the first，3rd and 7th days，20 μL at a time． The
P． viburnoides middle，high dose groups were intragastrically administrated with 4． 62 g /kg and 9． 24 g /kg of P． viburn-
oides water extract． The GS-positive group was intragastrically administrated with 0． 133 mg /kg of glucosamine sulfate．
The normal control and model groups were intragastricaly administrated with the same volume of distilled water． After 4
weeks treatment，the contents of COX2，NO，iONS in the blood and joint fluid in P． viburnoides middle and high dose
groups were decreased significantly compared with that of model group． In addition，the results showed that P． viburnoides
can effectively inhibit the histomorphologic changes of articular cartilage tissue，indirectly protect cartilage cells and stim-
ulate the recovery of damaged cartilage cells． P． viburnoides can effectively inhibit the expression of COX2，NO，iONS in
synovial fluid and it is one of the mechanisms of delaying
the degeneration of articular cartilage．
Key words:Pileostegia viburnoides;osteoarthritis;COX2;
NO;iONS;cartilage histomorphology
DOI:10.16333/j.1001-6880.2014.07.023
膝骨性关节炎(knee osteoarthritis，KOA) ，主要
病变为关节软骨退行性病变和继发性骨质增生，严
重影响患者的活动功能，降低了生活质量。尽管膝
骨性关节炎是一种最普遍的关节疾患，而其治疗方
法却滞后于其他关节炎性疾病。医学研究认为，此
病引起疼痛的原因可能与滑膜炎、骨增生、骨内和关
节内静脉压升高、关节囊牵张、软骨下骨骨折等有
关，但这些原因直接或间接涉及关节内局限性炎症
的基本病理变化。虎耳草科冠盖藤［1］，具祛风除
湿、散瘀止痛、解毒消肿功效，民间常用作关节炎的
治疗，疗效显著。课题组前期对冠盖藤进行生药学
鉴定［2］，并观察冠盖藤水提液对骨关节炎大鼠模型
血常规、白介素、肿瘤坏死因子等含量的影响，初步
证实柔毛冠盖藤的抗炎镇痛效应;本实验旨在进一
步探讨其抑制关节软骨退变的作用机理。
1 材料与仪器
1． 1 动物
清洁级成年 SD大鼠 50 只，2 月龄雌雄各半，体
重 300 ± 20 g，长沙市天勤生物技术有限公司提供，
合格证号:SCXK(湘)2009-0012。
1． 2 药物
冠盖藤在湖南省怀化市沅陵采集，经湖南中医
药大学药学院中药鉴定教研室鉴定为柔毛冠盖藤，
制备成水煎液，称取冠盖藤药材 1500 g，分 3 次提
取，最后浓缩成 1 g生药 /mL的药液，备用。硫酸氨
基葡萄糖胶囊 (爱尔兰罗达药厂，注册证号
H20090797 批号:C11006A)。
1． 3 主要仪器及试剂
酶标仪 (352 型，芬兰 Labsystems Multiskan
MS) ;电子天平(德国 Sartorius 公司产品，型号:
BP211D) ;电热三用水箱(北京市医疗设备厂) ;
TGL-16 高速台式离心机(江苏大地自动化仪器厂) ;
数码显微成像系统(Motic—ba200) ;数码显微镜
(SXJ—2)。木瓜蛋白酶(北京索莱宝科技有限公
司);半胱氨酸(国药集团化学试剂有限公司，批号:F20
111010)。C0X2、iNOS、NO试剂盒(美国 ＲD公司)。
2 实验方法
2． 1 造模、分组及给药
将 SD大鼠以随机数字表法分组，即:正常对照
组、模型组、阳性组、冠盖藤中剂量组(简称 GGT 中
剂量组)、冠盖藤高剂量组(简称 GGT 高剂量组) ，
每组各 10 只。参照文献［3］，制备大鼠膝骨性关节炎
模型:4%木瓜蛋白酶溶液 0． 3 mol /L及半胱氨酸溶
液的 1∶ 1 混合液，混置 0． 5 h 后，各组(除空白对照
组外)均在第 1、3、7 d，水合氯醛腹腔麻醉，于右膝
关节腔内注射混合液 20 μL。5 组大鼠正常饮食，模
型制备成功后，用药各组按 1 mL /100 g 灌胃给予相
应药液(冠盖藤中、高剂量组分别以 4． 62 g 生药 /
kg、9． 24 g生药 /kg，硫酸氨基葡萄糖组以 0． 133 mg /
kg) ，正常对照组、模型组给予等体积的蒸馏水，每
日 1 次。治疗 4 周后处理大鼠，测定相关指标;取材
前禁饮食 24 h。
2． 2 观察指标
2． 2． 1 关节活动度
将大鼠右膝关节伸展，回缩膝关节，用量角器测
量其伸展至回缩的角度。
2． 2． 2 血液
水合氯醛腹腔麻醉，麻醉成功后，腹部正中切
口，仔细分离腹主动脉，常规腹主动脉采血，置于 15
mL离心管中，37 ℃恒温水浴箱放置 30 min，3000
rpm离心 30 min。吸取上层血清，-20 ℃保存备用。
采用 ELISA 法，按说明书操作检测 COX2、NO、iNOS
的含量。
2． 2． 3 关节液
取膝关节髌韧带的外侧，常规备皮消毒。以 5
mL医用无菌注射配用 1 mL 医用无菌注射针头，行
右膝关节腔穿刺术，先注入 0． 9%生理盐水 1． 5 mL
后，反复活动膝关节 20 次，缓慢抽取关节液，并放入
1． 5 mL EP管中，3000 rpm离心 30 min，取上清液于
1． 5 mL EP管，-20 ℃保存、备用。采用 ELISA法，按
说明书操作检测 COX2、NO、iNOS含量。
2． 3 组织病理学检测
取胫骨平台关节软骨，修成约 0． 5 cm × 0． 5 cm
×0． 5 cm，4%多聚甲醛固定。常规系列脱水、脱钙，
石蜡包埋切片，脱蜡入水，PBS 冲洗，HE 染色，充分
冲洗，室温干燥，中性树脂封片，光学显微镜下观察
各组关节软骨形态结构。按照 Mankin 软骨组织形
态学改变的组织学分级标准，0 级:滑膜完整，细胞
排列整齐，无充血水肿，无炎性细胞浸润。关节软骨
完整，无剥离，无坏死;潮线清晰可见。I 级:滑膜血
管充血水肿，表层细胞增生，骨膜增生，骨质疏松，潮
线间断。Ⅱ级:滑膜细胞显著增生，滑膜内血管增
生，肉芽组织形成，关节软骨糜烂，潮线消失。Ⅲ级:
滑膜内肉芽组织纤维化，关节软骨有灶性坏死。评
2801 天然产物研究与开发 Vol. 26
分越高，表明软骨退变越严重。
2． 4 滑膜液炎性细胞计数
取右膝关节滑膜液涂片计数炎性细胞，光镜
(10 × 40 倍)下观察记录。每张涂片随机观察 5 个
视野(HP) ，计算每一视野平均炎性细胞数。计数标
准为“-”细胞数为 0 个 /HP，“+”细胞数为 10 个 /
HP，“+ +”细胞数为 10-20 个 /HP，“+ + +”细胞
数为 20 个 /HP。
2． 5 统计学分析
实验数据均用均数 ± 标准差(x ± s)表示，用
SPSS17． 0 进行统计分析。进行正态性检验;多组计
量资料采用 one-way ANOVA，方差齐时采用 LSD 和
SNK法，方差不齐时采用 Tamhanes T2 或 Dunnetts
T3 法。等级资料采用 Ｒidit 分析，P ＜ 0． 05 有统计
学意义或检验水准 α = 0． 05。
3 实验结果
3． 1 关节活动范围
冠盖藤对大鼠膝关节活动范围有明显改善，结
果如表 1。各剂量组连续给药 4 周后，空白对照组、
阳性组、GGT 中剂量组、GGT 高剂量组与模型组比
较，均有显著差异，P ＜ 0． 01。
表 1 各组关节活动度检测结果(n = 10，x ± s)
Table 1 Testing results of joint range motion (n = 10，x ± s)
组别
Group
剂量
Dose
关节活动度
Joint range motion
正常对照组 Normal － 134． 13 ± 2． 70°
模型组 Model － 50． 74 ± 5． 26°
阳性组 Positive control 0． 133 79． 26 ± 5． 44° ＊＊
中剂量组 GGT Middle dose 4． 62 67． 16 ± 6． 30° ＊＊
高剂量组 GGT High dose 9． 24 76． 64 ± 6． 24° ＊＊
注:与模型组比较，* P ＜ 0． 05;＊＊ P ＜ 0． 01。下同。
Note:Compare with model，* P ＜ 0． 05;＊＊ P ＜ 0． 01． Same as below．
3． 2 血液中 COX2、NO、iNOS含量的变化
模型组血液中 COX2、NO、iNOS 的含量，显著高
于空白对照组及其他用药组，结果见表 2。血液中
COX2 含量，阳性组显著低于 GGT 中、高剂量组;血
液中 NO 含量，阳性组与 GGT 中、高剂量组无显著
差异，表达水平接近;血液中 iNOS 含量，阳性组明
显低于 GGT中剂量组，与高剂量组无统计学意义表
达水平接近。
表 2 血清中 COX2、NO、iNOS含量的变化(n = 10，x ± s)
Table 2 Contents of COX2，NO，iNOS in serum of different groups (n = 10，x ± s)
组别
Group
剂量
Dose
COX2
(U /L)
NO
(U /L)
iNOS
(pg /mL)
正常对照组 Normal － 77． 97 ± 6． 30 22． 87 ± 2． 62 361． 33 ± 17． 65
模型组 Model － 174． 29 ± 6． 54 50． 83 ± 4． 71 652． 55 ± 16． 57
阳性组 Positive control 0． 133 113． 80 ± 7． 49＊＊ 30． 52 ± 3． 50＊＊ 420． 82 ± 17． 71＊＊
中剂量组 GGT Middle dose 4． 62 137． 48 ± 8． 95＊＊ 33． 87 ± 3． 08＊＊ 455． 11 ± 20． 61＊＊
高剂量组 GGT High dose 9． 24 127． 34 ± 8． 11＊＊ 31． 42 ± 3． 15＊＊ 428． 34 ± 17． 18＊＊
3． 3 关节液 COX2、NO、iNOS含量的变化
模型组关节液中 COX2、NO、iNOS 的含量显著
高于空白对照组及其他用药组，结果见表 3。冠盖
藤各治疗组可降低关节液中 COX2、NO、iNOS 的含
量，尤以高剂量组疗效显著，与对照组接近。
表 3 关节液 COX2、NO、iNOS含量的变化(n = 10，x ± s)
Table 3 Content s of COX2，NO，iNOS in joint fluid of different groups (n = 10，x ± s)
组别
Group
剂量
Dose
COX2
(U /L)
NO
(U /L)
iNOS
(pg /mL)
正常对照组 Normal － 102． 34 ± 5． 72 23． 38 ± 2． 79 407． 55 ± 7． 35
模型组 Model － 192． 09 ± 8． 37 51． 93 ± 4． 35 708． 22 ± 8． 97
阳性组 Positive control 0． 133 116． 74 ± 7． 34＊＊ 28． 49 ± 2． 67＊＊ 473． 26 ± 8． 19＊＊
中剂量组 GGT Middle dose 4． 62 131． 92 ± 5． 05＊＊ 33． 46 ± 4． 14＊＊ 514． 85 ± 6． 87＊＊
高剂量组 GGT High dose 9． 24 122． 83 ± 9． 96＊＊ 31． 98 ± 3． 45＊＊ 504． 23 ± 7． 86＊＊
3801Vol. 26 叶丽芝等:冠盖藤水提物对大鼠膝骨性关节炎 COX2、NO、iONS表达及关节组织形态学的影响
3． 4 关节软骨组织形态学改变
在光镜下观察，结果如图 1。空白对照组，关节
软骨基质染成粉红色，着色均匀，四层结构清晰，软
骨表面光滑，表层细胞呈梭形，近似水平排列，中间
层细胞圆形，散在分布，柱状层细胞排列呈柱状，如
图 1(A) ;模型组，关节软骨表层变薄层、部分区域
图 1 SD大鼠关节软骨病理切片(HE，× 200)
Fig. 1 Articular cartilage pathological section of SD rats
(HE，× 200)
呈绒毛状，软骨细胞数目减少，细胞排列紊乱，软骨
细胞坏死，碎裂，关节软骨潮线不清晰，如图 1(B) ;
阳性组，关节软骨表面较规则，排列较整齐，少量肉
芽组织，毛细血管增生，四层结构存在，关节软骨层
变薄，如图 1(C) ;GGT中剂量组、GGT 高剂量组，关
节软骨层变薄，表浅层软骨细胞消失，各层细胞分布
不均，关节软骨的退变程度介于模型组与阳性组之
间，如图 1(D)、(E)。
3． 5 软骨组织形态学改变的组织学分级
由 Ｒidit分析显示，Ｒ 由大到小排列、病变程度
由重至轻依次为:模型组 ＞ GGT 中剂量组 ＞ GGT
高剂量组 ＞ 阳性组 ＞ 空白对照组(总 Ｒ = 0． 50)。
同时 LSD和 SNK两两间比较，阳性组、GGT 中剂量
组、GGT 高剂量组与模型组比较均为 P ＜ 0． 01。提
示冠盖藤能够抑制滑膜内血管增生及肉芽组织形
成，抑制关节软骨糜烂或坏死，对造模后膝关节内滑
膜及软骨的病理变化有明显的改善作用(表 4)。
表 4 膝骨性关节炎各组 Mankin评分(n = 10)
Table 4 Mankin scores of rat knee osteoarthritis
组别
Group
Mankin评分 Mankin scores
0 I Ⅱ Ⅲ Ｒ
正常对照组 Normal 10 0 0 0 0． 16
模型组 Model 0 0 3 7 0． 87
阳性组 Positive control 3 5 2 0 0． 42＊＊
中剂量组 GGT Middle dose 1 4 5 0 0． 56＊＊
高剂量组 GGT High dose 2 5 3 0 0． 48＊＊
3． 6 滑膜液炎性细胞计数
由 Ｒidit分析显示，Ｒ 由大到小排列、病变程度
由重至轻依次为:模型组 ＞ GGT 中剂量组 ＞ GGT
高剂量组 ＞阳性组 ＞空白对照组(总 Ｒ = 0． 50) ，同
时 LSD 和 SNK 两两间比较，阳性组、GGT 中剂量
组、GGT高剂量组与模型组比较均为 P ＜ 0． 01，有显
著差异。提示冠盖藤能较好缓解 OA 的炎性症状。
结果如表 5。
表 5 膝骨性关节炎各组滑膜液炎性细胞计数(n = 10)
Table 5 The count of inflammatory cell in joint fluid of rat knee osteoarthritis(n = 10)
组别
Group
炎性细胞计数分级
Counts and sorts of inflammatory cell in joint fluid
- + + + + + + Ｒ
正常对照组 Normal 6 4 0 0 0． 15
模型组 Model 0 0 3 7 0． 82
阳性组 Positive control 0 5 5 0 0． 46＊＊
中剂量组 GGT Middle dose 0 3 5 2 0． 58＊＊
高剂量组 GGT High dose 0 5 4 1 0． 49＊＊
4801 天然产物研究与开发 Vol. 26
4 讨论
骨性关节炎，在病理过程中会出现炎症因子大
量释放，造成滑膜和关节周围组织炎症、软骨破坏及
增生等病变。前列腺素 E2(PGE2)是参与此病理变
化的主要介质，它可激活破骨细胞。破坏骨与软骨，
并激惹血管新生，介导疼痛、炎症和发热等反应。环
氧化酶(COX)在正常组织细胞内的活性极低，只有
受到诱导才能大量产生。金荣忠等［4］的临床研究，
表明 C0X2 在膝关节 OA软骨组织中表达增加。
NO是一种高反应性细胞毒的自由基，受许多
因子调节，但在许多疾病中对组织造成损伤已得到
了证实。它在 OA 的软骨组织中自发地产生，是重
要的信号分子和效应分子，广泛参与 OA 软骨细胞
和软骨基质的代谢过程，与 OA的发病密切相关，其
量与病情的严重度呈正相关。大量统计资料表明，
单味中药、中药有效部位或有效成分具有直接抑制
COX-2 的活性或抑制 COX-2 mＲNA 及蛋白表达等
方面来干扰其功能，达到抗炎效果。孙炜等人［5］实
验证明，iNOS抑制剂能影响关节软骨修复和组织胶
原的表达，可明显增加 I 型胶原表达和软骨厚度。
因此，抑制 iNOS 的表达对于维持软骨表达有积极
意义。由于前期试验，参考《中华本草》冠盖藤生药
材:成人 1 日用量为 50 g，按动物与人体临床用量系
数换算，以人体等效剂量的 1、4、8 倍量作为动物的
低、中、高剂量。研究结果显出冠盖藤毒性低，高、中
剂量组在镇痛、抗炎有较为显著的作用，但低剂量组
效果不明显。因此，本实验主要考察中、高剂量的抗
炎作用。对照药硫酸氨基葡萄糖胶囊作为第 1 个经
临床证明的骨关节炎疾病改善药，除改善关节软骨
组织形态外，也与氨基葡萄糖具有抗氧化作用，从而
减少受 L-1 刺激的酶的表达(如 MMP-3、iNOS、
COX2)
［6］，但抗炎作用方面，就本实验而言，由于实
验时间的局限性，通过短期观察冠盖藤用药组的抗
炎作用优于硫酸氨基葡萄糖用药组。对于后期抗炎
效果的比较还需进一步试验观察。炎症损伤常引起
渗出、增生，在 OA血瘀证的病理改变中有着重要的
意义。炎症可能导致瘀血也可能由瘀血引发炎症。
与血瘀证在病理病机方面存在正密切关系，在之后
的科研工作中可进行进一步的探索。
本实验显示，冠盖藤水提物能消除关节肿胀，明
显改善大鼠关节活动范围;模型组的血液及关节液
中 COX2、NO、iNOS 含量均呈高表达，而 3 个用药组
均可使此值降低，冠盖藤高剂量组疗效接近硫酸氨
基葡萄糖对照组。冠盖藤水提液，能有效抑制关节
组织形态的改变，起到对软骨外结构的调节作用，并
起到间接保护软骨的作用。实验结果提示，抑制
COX2、NO、iONS 表达是冠盖藤水提物控制 OA 炎
症，以缓解疼痛、延缓关节软骨的退变的作用机理之
一。这为临床推广应用提供了理论依据，也为冠盖
藤新药开发提供了实验资料。
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