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调查研究
生成的羟自由基 , 并能抑制氧自由基发生系统诱导的小鼠肝
匀浆上清液脂质过氧化作用 [ 3] 。此外 , 当归有效成分阿魏酸
能减少超氧自由基和过氧化氢引起的膜脂质过氧化反应 , 降
低丙二醛的生成 , 能明显降低羟自由基及丙二醛的溶血作
用。其机理是阿魏酸钠不仅可直接对抗过氧化氢和羟自由
基 , 使之生成减少 ,而且还能与膜磷脂酰乙醇胺结合 , 使之不
受自由基的侵袭。当归还能防止 D -氨基半乳糖引起的大
鼠肝糖元减少 , 能保护肝细胞 ATP酶 、葡萄糖 -6-磷酸酶 、
5 -核苷酸和琥珀酸脱氢酶的活性 , 有助于提高肝脏对毒物
的生物转化和排泄机能 [ 4] 。
参考文献:
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Protectiveefectsofangelicaontetrachloride-inducedliverinjuryinmice
XUZhong-ping
(BengbuHongyeMeatpackingCo., Ltd., BengbuAnhui233045, China)
Abstract:Objective:Tostudytheprotectiveefectsofangelicadecoctionontetrachloride-inducedliverinjuryinmice.
Methods:50 micewererandomlydividedintocontrolgroup(Ⅰ ), modelgroup(Ⅱ)andhigh, middleandlowdosageofangelica
groups(Ⅲ , Ⅳ , Ⅴ).GroupsⅢ -Ⅴwerehypodermiclyinjectedwithangelicadecoctionat20.0, 10.0 and5.0 g/kgeverydayfor
continuous6 days, respectively, groupⅠ andⅡ weregivenequaldosageofphisiologicalsaline.Afterthelastadministrationfor2
hours, groupsⅡ -Ⅴwereabdominallyinjectedwithtetrachloridesolutionat0.1mL/10gtomakeliverinjurymodel, groupⅠ was
givenequaldosageofparafine.Almicewerekilledafter24 hours.Slicefromleftliversampleswerefixedby10percentformalde-
hydeanddyedbyH.E.Thenthelivertissuestuctureandpathologicalchangewereobserved.Results:LiverinjuryingroupsⅢ -Ⅴ
wasmildcomparedwithmodelgroup.Conclusion:Angelicadecoctioncouldprotectliverfromtetrachloride-inducedinjuryin
mice.
Keywords:angelica;CCl
4
;liverinjury;protection;mice
地锦草总黄酮提取工艺研究
张建超 1 ,陈小军1, 2 ,徐 波 1 ,刘 伟1 ,王 慧 1 ,孙志良1 , 2
(1.湖南农业大学动物医学院基础兽医 , 湖南长沙 410128 ;2.湖南省兽药工程技术研究中心)
摘 要: 运用正交试验优化超声粉碎地锦草细胞的最佳条件 , 采用超声 -加热回流 -大孔树脂吸附的工艺
流程提取分离纯化地锦草总黄酮。结果表明 , 超声波提取地锦草总黄酮的最佳工艺以料液比为 1∶20, 70%的乙
醇为提取溶剂 , 60℃超声提取 35min,影响超声提取效果大小的因素依次为提取时间 >溶剂浓度 >料液比 >提取
温度;100 g地锦草干燥全草提取纯化得到黄褐色粉末 3.679 g,经多种化学试剂鉴定 , 均呈明显的黄酮反应。
关键词: 地锦草;超声波提取;总黄酮
中图分类号:S853.74 文献标识码:A 文章编号:1000-6354(2009)04-0017-05
地锦草具有抗菌 、抗病毒 、抗氧化 、护肝 、止血等生物活
性 [ 1] ,临床上主要用于治疗菌痢 、肠炎 、肝炎等疾病 [ 2] , 其主
要有效成分为黄酮类化合物 [ 3] ,本研究采用超声波法和传统
加热回流方法相结合提取地锦草总黄酮 , 并以总黄酮含量为
指标 ,考察提取时间 、乙醇浓度 、料液比 、温度 4个因素对地
锦草总黄酮提取率的影响 , 筛选黄酮提取率高 , 同时又符合
收稿日期:2009-02-26
基金项目:湖南省科学技术厅项目(06FJ3107)
作者简介:张建超(1980-),女 , 在读硕士研究生 ,研究方向:兽医药
理与毒理学研究。 通讯作者:孙志良 , E-mail:sunzhil-
iang1965@yahoo.com.cn
工业生产要求的提取方法 ,建立地锦草总黄酮的含量测定方
法。
1 材料与方法
1.1 主要材料及仪器
地锦草(EuphorbiahumifusaWild.),采自湖南农业大学
中医药园 ,晒干后粉碎过 40目筛 , 备用;JY98 -3D超声波细
胞粉碎机;D-101型大孔吸附树脂(天津市海光化工有限公
司);LAB-lechUV2100紫外 /可见分光光度计;乙醇等试剂
均为分析纯。
1.2 方法
1.2.1 地锦草总黄酮的提取纯化 采用超声 -醇提 -大孔
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调查研究
吸附树脂吸附的方法提取分离纯化地锦草总黄酮。将地锦草
粉末浸于乙醇中, 2 h后, 于超声波细胞粉碎机超声 20min, 加
热回流数小时后 ,过滤浓缩溶剂 , 再过大孔吸附树脂柱 , 过柱
时先用纯水和低浓度溶剂洗脱 , 除去多糖 、叶绿素等杂质 , 再
用高浓度溶剂洗脱被树脂吸附的黄酮 ,浓缩洗脱液 ,冷冻干燥
至粉末。地锦草总黄酮提取纯化工艺见图 1。
图 1 地锦草总黄酮提取纯化工艺
1.2.2 超声波提取正交试验
1.2.2.1 超声波单因素考察 (1)不同提取时间对提取率
的影响:准确称取一定质量的地锦草干燥粉末 4份 , 在料液
比为 1∶10,乙醇浓度为 80%, 温度为 50℃条件下 ,分别以不
同时间(15、25、35、 45 min)超声提取地锦草总黄酮 , 按总黄
酮含量测定方法求得黄酮得率。 (2)不同乙醇浓度对提取率
的影响:准确称取一定质量的地锦草干燥粉末 5份 , 在料液
比为 1∶10,温度为 50 ℃的条件下 , 分别以 50%、 60%、70%、
80%、 90%乙醇超声提取 30 min, 按总黄酮含量测定方法求
得黄酮得率。 (3)不同料液比对提取率的影响:准确称取一
定质量的地锦草干燥粉末 5份 , 在温度为 50℃, 乙醇浓度
80%的条件下 ,分别以 1∶8、1∶10、 1∶15、 1∶20、 1∶25料液比超
声提取地锦草总黄酮 , 按总黄酮含量测定方法求得黄酮得
率。 (4)不同提取温度对提取率的影响:准确称取一定质量
的地锦草干燥粉末 5份 ,在料液比为 1∶10, 乙醇浓度为 80%
的条件下 ,分别以 30、40、50、60、70 ℃超声提取 30 min,按总
黄酮含量测定方法求得黄酮含量。
1.2.2.2 超声提取正交试验 在单因素实验的基础上 , 以
提取时间 、乙醇浓度 、料液比 、提取温度为考察因素 , 以地锦
草总黄酮的提取率为考察指标 , 选用 L9(34)利用正交设计 ,
对地锦草黄酮类化合物的提取工艺进行研究。详见表 1。
表 1 地锦草总黄酮提取因素水平 [ L9(34)]
水平 提取时间(A)/min
乙醇浓度
(B)/%
料液比
(C)
提取温度
(D)/℃
1 15 60 1∶10 40
2 25 70 1∶15 50
3 35 80 1∶20 60
1.2.2.3 验证试验 利用正交实验得出的地锦草总黄酮的
最优化提取条件 ,进行验证性实验 , 验证方法的可行性和稳
定性。
1.2.3 地锦草总黄酮的纯化 采用大孔吸附树脂过柱的方
法对地锦草总黄酮进行纯化。大孔吸附树脂预处理按文
献 [ 4]进行操作。取离心除杂后的上清液稀释 2 -3倍 , 缓缓
加入已处理好的大孔树脂柱内 , 静置 30 min, 用净水洗脱直
到洗脱液无色 ,然后用 70%乙醇以 0.5BV/h洗脱 , 收集洗脱
液;最后用 95%乙醇洗脱 , 以除去树脂柱中脂溶性杂质 , 回收
树脂(图 1)。
1.2.4 地锦草总黄酮的鉴定 取少量地锦草总黄酮干燥粉
末 ,观察其物理形状 、溶解性 ,然后对其定性鉴定。
1.2.4.1 紫外光谱扫描鉴定 以空白溶剂为对照 , 用 LAB
-techUV2100紫外 /可见分光光度计进行全波长扫描(200
-600 nm), 记录波谱。
1.2.4.2 紫外光下呈色反应 取该样品溶液点在滤纸上 ,
分别在可见光及紫外光下观察颜色。
1.2.4.3 氨熏反应 取样品溶液点在滤纸上 , 将滤纸在氨
水上方熏 0.15 min,立即在紫外光下观察。
1.2.4.4 三氯化铝反应 取样品溶液点在滤纸上, 滴加 1%三
氯化铝乙醇溶液,吹干 ,分别在可见光及紫外光下观察。
1.2.4.5 乙酸镁反应 取样品溶液点在滤纸上 ,滴加 1%乙
酸镁甲醇溶液 ,吹干 , 紫外光下观察。
1.2.4.6 盐酸 -镁粉反应 取 1 mL样品溶液及少量镁粉
于试管中 ,慢慢滴加浓盐酸 , 观察。
1.2.4.7 纸层析 取样品溶液 10 μL点在滤纸上。用正丁
醇∶醋酸∶水(4∶1∶5)为展开剂 ,上行展开 4h, 取出晾干。喷
1 %氯化铝乙醇溶液。吹干后于紫外光下观察。
1.2.4.8 其他成分的检测 采用蒽酮 -硫酸法 、Molish反
应检测多糖;采用碘化铋钾试剂 、硅钨酸试剂 、碘 -碘化钾试
剂检测生物碱;采用三氯化铁试验检测鞣质成分。
2 结果与分析
2.1 提取纯化结果
100 g地锦草干燥粉末经超声 -热回流提取 , 离心除杂 ,
大孔吸附树脂吸附纯化后平均可得黄褐色总黄酮干燥粉末
3.697 g,见图 2。
2.2 超声提取正交实验结果
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图 2 地锦草总黄酮干燥粉末
2.2.1 单因素对超声波提取效果的影响 随着时间的增
加 ,提取黄酮得率也升高 ,但提取时间在 35 min后 , 随着时间
的增加 ,黄酮得率并无明显变化(图 3);高浓度乙醇提取地锦
草总黄酮较低浓度好 , 但在高浓度中 ,随着乙醇浓度的增加,
黄酮得率增幅不明显甚至有降低的趋势(图 4);料液比及温
度对超声提取的影响较小(图 5、 6)。综合考虑提取成本及
黄酮得率 , 超声提取时间控制在 25 -35 min, 乙醇浓度为
70% ～ 80%, 料液比 1∶10-1∶20, 温度控制在 40-60 ℃为最
佳提取条件。
图 3 提取时间对超声提取效果的影响
图 4 乙醇浓度对超声提取效果的影响
图 5 料液比对超声提取效果的影响
图 6 温度对超声提取效果的影响
2.2.2 超声波正交试验与方差分析结果 选择对实验影
响较大的乙醇浓度 、提取时间 、料液比及提取温度 4个因素
水平 ,采用 L9(34)进行正交实验 , 以确定地锦草总黄酮的
超声提取最佳条件 。结果见表 2、 3。表 2结果显示 , 4因
素对地锦草总黄酮提取的影响主次顺序为提取时间 >乙
醇浓度 >料液比 >提取温度 ,最佳优化组合为 A
3
B
2
C
3
D
3
(表
2、3), 即以料液比为 1∶20, 70%的乙醇为提取溶剂 , 60 ℃超
声提取 35 min。
表 2 地锦草总黄酮超声波正交实验结果
实验号 A B C D 黄酮得率 /%
1 1 1 1 1 1.54
2 1 2 2 2 1.92
3 1 3 3 3 2.01
4 2 1 2 3 2.15
5 2 2 3 1 2.61
6 2 3 1 2 2.26
7 3 1 3 2 2.45
8 3 2 1 3 2.65
9 3 3 2 1 2.28
T1 5.47 6.14 6.45 6.42 19.87(T)
T2 7.02 7.18 6.36 6.63
T3 7.38 6.55 7.05 6.81
X1 1.82 2.05 2.15 2.14
X2 2.34 2.39 2.12 2.21
X3 2.46 2.18 2.35 2.27
R 0.64 0.34 0.23 0.13 最佳组合 A3B2C3D3
表 3 方差分析表
因素 离差平方和 自由度 均差 F值 显著性
A 0.686 6 2 0.343 3 107.281 2 ＊＊＊
B 0.183 0 2 0.091 5 28.593 8 ＊＊＊
C 0.049 7 2 0.024 8 7.750 0 ＊＊
D 0.018 7 2 0.009 4 2.937 5
误差 0.057 2 18 0.003 2
注:F0.1(2 , 9)=3.01, F0.05(2 , 9)=4.26, F0.01(2, 9)=8.02。 若
F>F0.01 , 则因素影响极显著 , 用 “＊＊＊ ”表示;若 F0.01 >F>
F0.05 , 则因素影响显著 ,用 “＊＊”表示。
2.2.3 超声提取法的稳定性实验 以料液比为 1∶20, 70%
的乙醇为提取溶剂 , 60 ℃超声提取 35 min, 提取的黄酮得率
分别为 2.68%、2.71%、2.63%,证明了最佳提取工艺条件的
稳定性。
2.3 地锦草总黄酮鉴定结果
地锦草总黄酮紫外分光光度扫描图谱 全波长扫描
波谱显示地锦草总黄酮在紫外吸收带上有 2个峰 , 1个在
257 nm处 , 1个在 360 nm处 , 与文献报道一致(图 7)。
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图 7 地锦草总黄酮紫外分光光度扫描结果
经多种方法鉴定 , 结果显示样品呈明显的黄酮反应 , 但
由于分离纯化不彻底 , 样品中可能存在少量的多糖 、鞣质等
(表 4)。
表 4 地锦草总黄酮鉴定结果
反应类型 现象 结果
紫外光下呈色反应 可见光下呈灰黄色,紫外光下呈棕色并有荧光斑点 阳性
氨熏反应 黄绿色荧光斑点 可能含黄酮醇类化合物
三氯化铝反应 呈灰黄色 ,在紫外光下呈黄绿色荧光斑点
可能存在黄酮类化
合物
乙酸镁反应 现象不明显 阴性
盐酸 -镁粉反应 可见试管内冒白色烟雾 ,溶液慢慢变为桃红色
可能含有黄酮 , 黄
酮醇 , 二氢黄酮等
黄酮类化合物
纸层析 可见荧光斑点 阳性
蒽酮 -硫酸法 溶液出现轻微的蓝绿色 可能含有少量的多糖
碘化铋钾试剂 现象无明显 阴性
三氯化铁 溶液出现蓝绿色 可能含有少量的鞣质
3 讨论
本实验采用超声波联合传统的加热回流方法提取地锦
草总黄酮 ,结果显示超声波 -加热回流法提取黄酮的提取量
较单一的超声波法或加热回流法有明显提高 , 超声波的空化
作用对细胞膜的破坏有助于黄酮类化合物的释放与溶出 , 超
声波使提取液不断震荡 ,有助于溶质扩散;加热回流数小时 ,
使黄酮类化合物能够有充裕的时间和空间溶出。两种方法
起到了相得益彰的效果 ,使得地锦草总黄酮的提取率大大提
高。超声波提取法具有省时 、节能 、提取率高等优点 , 在中草
药化学成分提取中的应用已经显示出明显的优势 , 这为提取
方法落后 、生产周期长的中药大规模生产提供了更科学的工
艺条件 ,推广应用价值很高。
从本实验超声时间 、乙醇浓度 、料液比及提取温度的单
因素考察结果来看 ,并不是超声时间越长 、乙醇浓度越高 、黄
酮得率就越高 ,分析原因可能是随着超声时间的增加 , 地锦
草中其他成分的含量和种类也会增加 , 另外 , 地锦草中总黄
酮的含量是有限的 , 超声一定时间后 , 黄酮的提取率已达到
极限 ,不会再有大幅度的提高;虽然高浓度的乙醇有利于黄
酮的溶出 ,但乙醇浓度太高会增加其他醇溶性物质的溶出。
在提取过程中 ,温度过低 , 有效物质不能充分溶出 , 过高则有
可能破坏被提物的结构 ,因此要严格控制提取温度。本实验
从提取时间 、溶剂浓度 、料液比及提取温度对超声波法提取
进行了单因素及正交考察 , 实验结果显示 , 影响超声提取效
果的因素依次是提取时间 >乙醇浓度 >料液比 >提取温度 ,
超声波提取地锦草总黄酮的最佳工艺为:以料液比为 1∶20,
70%的乙醇为提取溶剂 , 60 ℃超声提取 35 min。
大孔吸附树脂在中药化学成分提取分离纯化中起很重
要的作用。大孔吸附树脂可以富集中药制剂中的有效成分 ,
再结合其他方法进行定性鉴别和含量的测定 , 就可以对制剂
的质量进行控制和分析 ,具有分离性好 、专属性和重现性好 、
无杂质干扰 、灵敏度高等优点 [ 7] 。大孔树脂根据其孔径的大
小及极性不同而分为不同的型号 ,正确选择和使用符合规格
要求的大孔吸附树脂是实现分离纯化目的的首要条件 ,另外
树脂的性质 、树脂的预处理 、上柱药液的 pH值 、药液浓度 、溶
剂性质 、上柱药液温度 、洗脱液的选择及解析都能影响树脂
纯化的效果 ,其中上样溶液 pH值对吸附和分离效果至关重
要 ,根据化合物结构特点 , 灵活改变溶液 pH值 , 可使提纯达
到理想的效果 [ 8] 。由于酚羟基团的存在 ,黄酮类化合物都呈
现一定的弱酸性 ,固在上柱前将吸附液调制pH值 3-4;用不
同浓度的乙醇作为洗脱液梯度洗脱被大孔树脂吸附的黄酮 ,
结果发现低浓度的洗脱液和高浓度的洗脱液中所含成分有
较大差别 [ 9-11] ,由此可见 , 选择合适浓度的洗脱剂对黄酮收
率也有较大影响。
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21
调查研究
StudyonextractionprocessoftotalflavonoidsinEuphorbiaehumifusaWild.
ZHANGJian-chao, CHENXiao-jun, XUBo, LIUWei, WANGHui, SUNZhi-liang
(CollegeofVeterinaryMedicine, HunanAgriculturalUniversity, ChangshaHunan, 410128, China)
Abstract:Tooptimizetheultrasonicconditionswithorthogonaltest, thentoextract, separateandpurifythetotalflavonoids
withthemethodofultrasonication-heatingreflux-macroreticularresinadsorbing.Theresultsshowedthattheoptimalultrasonic
conditionswassolid-liquidratioas1∶20, ethanolconcentrationas70%, thetemperatureas60 ℃, extractingtimeas35 min.
Thefactorswhichimpactontheefficiencyofultrasonicextractionwereasfolows:extractingtime>solventconcentration>solid-
liquidratio>temperature.3.679 gbrownpowderwaspurifiedfrom 100 gwholedryEuphorbiaehumifusaWild., identifiedbya
varietyofchemicalreagents, whichshowedclearlyflavonereaction.
Keywords:EuphorbiaehumifusaWild.;ultrasonic;totalflavonoids
临 ·床 ·集 ·锦
鹌鹑念珠菌病的诊治
2008年 9月 , 泗阳县高渡镇某村饲养鹌鹑 500只 , 52日
龄时发现 102只鹌鹑出现口疮 ,气喘 , 死亡 20只。 诊断为鹌
鹑念珠菌病 ,立即采取有效的治疗措施 , 疗效显著。诊治情
况如下。
1 临床症状
病鹌鹑精神不振 ,缩颈闭眼 , 呆立不愿活动 ,羽毛蓬垢 ,
厌食 ,嗉囊胀大 , 泻黄绿色或墨绿色粪 , 口咽黏膜充血 , 分泌
物增加 ,黏膜上有乳酪样 、豆渣样白色物覆盖 , 易剥落 、口臭。
大多病鹌鹑气喘 ,呼吸啰音 , 甩头。
2 病理剖检
口腔黏膜上形成一个大的或许多小的隆起软斑 , 表面覆
有黄白色假膜渗出物;嗉囊黏膜增厚 ,黏膜上有白色 、圆形 、
隆起的溃疡 ,表面易剥落;食道出现溃疡状斑;有的腺胃肿
胀 、黏膜出血 , 覆盖卡他性或坏死性渗出物。
3 实验室诊断
3.1 取嗉囊和腺胃黏膜进行触片染色镜检 , 见革兰氏阳性 、
边缘暗褐 、中间透明 、形似树枝状的菌体。
3.2 用无菌接种针从腺胃黏膜挑取病料在沙保劳氏琼脂培
养基上划线培养 , 37 ℃培养 24-48 h,形成白色 、奶油状 、明
显凸起的菌落。幼龄培养物由卵圆形出芽的酵母细胞组成 ,
老龄培养物显示菌丝有隔离。
4 治疗
4.1 隔离病鹌鹑 , 用 0.1%硫酸酮溶液喷洒圈舍 、圈笼。保
持圈舍卫生 ,通风干燥 , 饮用清洁水。
4.2 及时清除病鹌鹑口中的覆盖物 ,用碘酊涂布。灌服喉
支宁 , 3粒 /只 , 1次 /天 ,连用 2天。
4.3 用制霉菌素拌料 , 20 mg/只· 天 , 并用 0.1%硫酸铜溶
液饮水 ,连用 5天。
4.4 饲料中拌喂高效多维素 , 连喂 7天 , 7天后鹌鹑病情好
转 ,食欲 、饮水恢复正常。
(江苏省泗阳县畜牧兽医站 223700 张亚东)
幼驹破伤风治验
幼驹破伤风是由断脐消毒不严而引起感染 ,其治疗比较
棘手。笔者自 1992年应用鸡蛋斑蝥汤(《中兽医医药杂志》
1990年第 2期 ,刘雨民先生方)结合艾灸和西药治疗幼驹破
伤风 3例 , 均治愈。现简述如下。
1 治疗
1.1 方药及制法
斑蝥 1.5 g(完整无蛀者为佳),鸡蛋 1枚。先将蛋壳一
端打开指头大小的孔 , 去净蛋清 , 再将去头脚的斑蝥填入蛋
内 , 充分摇动 ,使斑蝥粘上蛋黄 , 将蛋置文火上烤 ,边烤边翻
动 , 至蛋壳呈黄色为度 ,剥去蛋壳 , 见蛋黄裹着斑蝥呈海绵状
者为佳。灌服 , 1剂 /天。
1.2 艾灸
穴位:百会 ,锁口 , 开关 ,风门。
2 病例
2007年 5月 12日 , 偏城大庄村李全根饲养一骡驹 ,
因后躯僵硬 , 卧地不起来诊 。主诉:该驹产后已 14天 , 前
2天发现走路时全身强直 , 卧地不能自起 , 转弯困难 。检
查:口色赤红 , 两耳耸立 , 易惊恐 , 瞬膜外露 , 鼻孔开张呈喇
叭状 , 牙关紧闭 ,呼吸急促 , 体温 37.6 ℃, 脉搏 89次 /分钟 ,
触诊臀部 、颈部肌肉硬如石板 , 脐部有脓性分泌物 , 吮乳减
少。结合病史确诊为破伤风。治疗:脐部进行外科处理 , 脐
周围分点注射青霉素 320单位 , 隔日 1次 , 连用 2次。肌肉
注射精制破伤风抗毒素 15 000单位 , 1次 /天 , 连用 3天。 灌
服上方中药 , 1剂 /天 ,连服 2剂 , 同时结合艾灸。 4天后能自
行站立 , 肌肉僵硬缓解 ,乳增加。 10天后追访痊愈。
3 体会
3.1 加强护理 , 保暖避光。早发现早治疗。
3.2 斑蝥有毒 , 刺激性强 , 用量不宜大 ,灌服前先灌面糊。
3.3 必须做好创口处理 ,从根源上控制细菌繁殖。
3.4 该中药方优效实 ,再结合西药提高疗效 , 加快康复。
(宁夏西吉县偏城畜牧兽医工作站 756200 冯汉洲)