全 文 ：２０１６年９月 四川大学学报（自然科学版） Ｓｅｐ．２０１６
第５３卷　第５期 Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｓｉｃｈｕａｎ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（Ｎａｔｕｒａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅ　Ｅｄｉｔｉｏｎ） Ｖｏｌ．５３　Ｎｏ．５
ｄｏｉ：１０３９６９／ｊ．ｉｓｓｎ．０４９０－６７５６．２０１６．０９．０３５
一个麻风树Ｋｕｎｉｔｚ型蛋白酶抑制剂
基因的克隆和鉴定
牛　蓓１，李　锐２，杨　林１，符　佳１，唐　琳３，徐　莺３
（１．成都大学医学院，成都６１０１０６；２．成都大学药学与生物工程学院，成都６１０１０６；
３．四川大学生命科学学院，成都６１００６４）
摘　要：通过ＰＣＲ技术克隆得到一个麻疯树Ｋｕｎｉｔｚ型蛋白酶抑制剂基因（ＪｃＫＴＩ）的开放阅
读框序列（５４０ｂｐ），对应的基因组序列不含内含子．该序列编码一个含有１７９个氨基酸残基的
成熟多肽，其在根和茎中的表达最高，在叶片和种子中较低．原核表达的重组蛋白显示出一定
的抑制牛胰蛋白酶的活性，过表达该基因的转基因烟草蛋白提取物对胰蛋白酶具有一定抑制
作用，同时转基因烟草叶片可使进食后的棉铃虫幼虫生长发育受阻，摄食量减少．上述结果暗
示ＪｃＫＴＩ基因可能在麻疯树根和茎的抗虫应答中扮演着一定的角色．
关键词：ＪｃＫＴＩ基因；胰蛋白酶抑制剂；原核表达；转基因；抗虫
中图分类号：Ｑ９４６　　　文献标识码：Ａ　　　文章编号：０４９０－６７５６（２０１６）０５－１１６９－０８
收稿日期：２０１６－４－１５
基金项目：十二五科技攻关课题２０１１ＢＡＤ２２Ｂ０８
作者简介：牛蓓（１９７４－），女，四川成都人，讲师，研究方向为生物化学与分子生物学．Ｅ－ｍａｉｌ：ｎｉｕｂｅｉｕｃｄ＠１２６．ｃｏｍ．
通讯作者：徐莺．Ｅ－ｍａｉｌ：ｘｕｙｉｎｇ＠ｓｃｕ．ｅｄｕ．ｃｎ
Ｃｌｏｎｉｎｇ　ａｎｄ　ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ　ａ　Ｋｕｎｉｔｚ　ｔｙｐｅ　ｐｒｏｔｅａｓｅ
ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ　ｇｅｎｅ　ＪｃＫＴＩｆｒｏｍＪａｔｒｏｐｈａ　ｃｕｒｃａｓ
ＮＩＵ　Ｂｅｉ１，ＬＩ　Ｒｕｅ２，ＹＡＮＧ　Ｌｉｎ１，ＦＵ　Ｊｉａ１，ＴＡＮＧ　Ｌｉｎ３，ＸＵ　Ｙｉｎｇ３
（１．Ｓｃｈｏｏｌ　ｏｆ　Ｍｅｄｉｃａｌ，Ｃｈｅｎｇｄｕ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｃｈｅｎｇｄｕ　６１０１０５，Ｃｈｉｎａ；
２．Ｃｏｌｅｇｅ　ｏｆ　Ｐｈａｒｍａｃｙ　ａｎｄ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｃｈｅｎｇｄｕ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｃｈｅｎｇｄｕ　６１０１０６，Ｃｈｉｎａ；
３．Ｃｏｌｅｇｅ　ｏｆ　Ｌｉｆｅ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓｉｃｈｕａｎ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｃｈｅｎｇｄｕ　６１００６４，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｔｈｅ　ｏｐｅｎ　ｒｅａｄｉｎｇ　ｆｒａｍｅ（ＯＲＦ）ｆｒａｇｍｅｎｔ（５４０ｂｐ）ｏｆ　ａ　Ｋｕｎｉｔｚ　ｔｙｐｅ　ｐｒｏｔｅａｓｅ　ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ　ｇｅｎｅ　ＪｃＫＴＩ
ｗａｓ　ｃｌｏｎｅｄ　ｂｙ　ＰＣＲ　ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　ｆｒｏｍＪａｔｒｏｐｈａ　ｃｕｒｃａｓ．Ｔｈｅ　ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇ　ｇｅｎｏｍｉｃ　ｒｅｇｉｏｎ　ｄｏｅｓ　ｎｏｔ　ｃｏｎｔａｉｎ　ａｎｙ
ｉｎｔｒｏｎｓ．Ｔｈｅ　ＯＲＦ　ｅｎｃｏｄｅｓ　ａ　ｍａｔｕｒｅ　ｐｅｐｔｉｄｅ　ｗｉｔｈ　１７９ａｍｉｎｏ　ａｃｉｄ　ｒｅｓｉｄｕｅｓ．Ｔｈｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　ＪｃＫＴＩｉｓ　ｈｉｇｈｅｒ　ｉｎ
ｒｏｏｔ　ａｎｄ　ｓｔｅｍ　ｂｕｔ　ｌｏｗｅｒ　ｉｎ　ｌｅａｆ　ａｎｄ　ｓｅｅｄ．Ｔｈｅ　ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ　ｉｎ　Ｅ．ｃｏｌｉ　ｓｈｏｗｅｄ　ｂｏｖｉｎｅ　ｔｒｙｐｓｉｎ　ｉｎ－
ｈｉｂｉｔｏｒｙ　ａｃｔｉｖｉｔｙ．Ｔｈｅ　ｃｒｕｄｅ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｅｘｔｒａｃｔｓ　ｆｒｏｍ　ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ　ｔｏｂａｃｃｏ　ｐｌａｎｔｓ　ｏｖｅｒ－ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ　ＪｃＫＴＩ　ｅｘｈｉｂｉｔｅｄ
ｓｔｒｏｎｇｅｒ　ｔｒｙｐｓｉｎ　ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ　ａｃｔｉｖｉｔｙ　ｔｈａｎ　ｔｈｏｓｅ　ｏｆ　ｃｏｎｔｒｏｌ．Ｍｏｒｅｏｖｅｒ　ｔｈｅ　ｌａｒｖａｅ　ｆｅｅｄ　ｗｉｔｈ　ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ　ｔｏｂａｃｃｏ　ｌｅａｖｅｓ
ｓｈｏｗｅｄ　ｒｅｔａｒｄａｔｉｏｎ　ｇｒｏｗｔｈ　ａｎｄ　ｒｅｄｕｃｅｄ　ｆｏｏｄ　ｉｎｔａｋｅ．Ｔｈｅｓｅ　ｒｅｓｕｌｔｓ　ｓｕｇｇｅｓｔｅｄ　ｔｈａｔ　ＪｃＫＴＩｇｅｎｅ　ｍａｙ　ｐｌａｙ　ａ　ｒｏｌｅ　ｉｎ
ｔｈｅ　ｒｏｏｔｓ　ａｎｄ　ｓｔｅｍｓ　ｏｆ　Ｊａｔｒｏｐｈａ　ｃｕｒｃａｓ　ｒｅｓｐｏｎｓｅ　ｔｏ　ｐｅｓｔ　ａｔｔａｃｋ．
Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ：ＪｃＫＴＩ　ｇｅｎｅ；Ｔｒｙｐｓｉｎ　ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ；Ｐｒｏｋａｒｙｏｔｉｃ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ；Ｔｒａｎｓｇｅｎｅ；Ａｎｔｉ－ｐｅｓｔ
１　引　言
病虫害是造成农作物减产的主要原因之一．据
统计，全世界范围内每年因病虫害引发的作物减产
高达３７％［１］．研究表明，植物在遭受害虫袭击时，会
产生能够抑制害虫肠道蛋白酶活性的蛋白质，如蛋
　 四川大学学报（自然科学版） 　 第５３卷
白酶抑制剂、淀粉酶抑制剂、凝集素及病原相关的蛋
白质等［２，３］．因此，Ｂａｔｅ和Ｒｏｔｈｓｔｅｉｎ于１９９８年提出
“模拟生态”策略来应对害虫，即利用含有蛋白酶抑
制剂基因的转基因植物来抑制甚至杀死害虫［４］．
Ｋｕｎｉｔｚ型蛋白酶抑制剂（ＫＴＩ）是一类应用较
为广泛的植物防御类蛋白质，其能够特异地作用于
丝氨酸蛋白酶如胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶及弹性蛋
白酶等［５］．有研究证实，当鳞翅目害虫取食转大豆
ＫＴＩ基因的烟草后，会因其肠消化酶活性降低而
导致“消化不良”，取食量下降，幼虫的生长发育延
缓，最终导致危害降低的效果［６］．
ＫＴＩ蛋白已在大豆、蓖麻、杨树等［５，７，８］多种植
物中分离并进行了研究，但在大戟科植物麻疯树
（Ｊａｔｒｏｐｈａ　ｃｕｒｃａｓ　Ｌ．）中未见相关研究的报道．由于
麻疯树具有较强的抗逆抗病性，因此本研究希望通
过克隆麻疯树ＫＴＩ基因，一方面调查其原核重组蛋
白的抑制蛋白酶的活性，另一方面将其在烟草中异
源过表达，检测其抑酶活性和抗虫活性，从而对该基
因在植物抗虫基因工程领域的应用潜力进行评价，
为培育高抗虫作物品种奠定理论和物质基础．
２　材料与方法
２．１　实验材料
２．１．１　植物材料与供试虫源　普通烟草（Ｎｉｃｏｔｉ－
ａｎａ　ｔａｂａｃｕｒｎ）ＮＣ８９，由四川大学生物资源与生态
教育部重点实验室保存．供试虫源棉铃虫（Ｈｅｌｉ－
ｃｏｖｅｒｐａ　ａｒｍｉｇｅｒａ）购于河南济源科云生物有限公
司．
２．１．２　菌株、载体　大肠杆菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）
Ｔｏｐ１０、ＢＬ２１（ＤＥ３）、根癌农杆菌ＧＶ３１０１、原核表
达载体ｐＥＴ３２ａ（＋）均由四川大学生物资源与生
态教育部重点实验室保存．克隆载体ｐＥＡＳＹ－Ｔ购
自北京全式金生物技术有限公司，植物超表达载体
ｐＹＧ８１９８由扬州大学生命科学院高勇老师提供．
２．１．３　各种酶、试剂盒及试剂　酶：ｒＴａｑ酶、
ＰｒｉｍｅＳＴＡＲＴＭ酶、反转录酶 Ｍ－ＭＬＶ、各种ＤＮＡ
限制内切酶均购于 ＴａＫａＲａ公司，胰蛋白酶、
ＢＡＥＥ购于Ａｍｅｒｓｈａｍ．试剂盒：胶回收试剂盒、植
物基因组ＤＮＡ提取试剂盒、植物总ＲＮＡ提取试
剂盒购于北京天根公司，反转录试剂盒购于Ｔａｋａ－
ｒａ公司，荧光定量试剂盒购于ＢｉｏＲａｄ公司，质粒
提取试剂盒购自 Ｏｍｉｇａ公司，蛋白浓度检测试剂
盒购于Ｔｈｅｒｍｏｌ公司，蛋白纯化试剂盒购于海狸
生物科技公司．琼脂糖、琼脂粉、Ｔｒｉｓ、ＳＤＳ、ＩＰＴＧ、
Ｘ－ｇａｌ购于Ｆｌｕｋａ，其它化学药品为进口或国产分
析纯和色谱纯试剂．
２．１．４　引物　均由北京华大基因公司合成（表１）．
２．２　研究方法
２．２．１　麻疯树叶片总ＲＮＡ和基因组ＤＮＡ的提
取　使用北京天根公司植物总ＲＮＡ提取试剂盒
表１　实验所用引物
Ｔａｂｌｅ．１　Ｐｒｉｍｅｒｓ　ｕｓｅｄ　ｉｎ　ｔｈｉｓ　ｓｔｕｄｙ
引物名称 序列
ＪｃＫＴＩ－ＢＦ　 ５′－ＣＧＣＧＧＡＴＣＣＡＴＧＧＣＣＡＴＡＡＣＣＡＣＣＡＴＧ－３′
ＪｃＫＴＩ－ＳＲ　 ５′－ＣＧＡＧＣＴＣＴＴＡＡＧＣＣＣＴＡＣＴＧＡＡＣＡＧＧＡＡＡＧ－３′
ＫＴＩＱ１　 ５′－ＴＣＡＴＴＧＴＧＡＣＡＧＧＡＧＧＡＧＡＡＧＣ－３′
ＫＴＩＱ２　 ５′－ＧＧＡＡＡＧＧＡＴＡＴＧＣＣＡＴＡＧＧＡＡＣ－３′
ＪｃＡｃｔＰ１　 ５′－ＡＧＡＡＡＣＧＧＣＴＡＣＣＡＣＡＴＣ－３′
ＪｃＡｃｔＰ２　 ５′－ＣＣＡＡＧＧＴＣＣＡＡＣＴＡＣＧＡＧ－３′
Ｎｔ１８ＳＦ　 ５′－ＣＣＡＣＡＣＡＧＧＴＧＴＧＡＴＧＧＴＴＧ－３′
Ｎｔ１８ＳＲ　 ５′－ＣＡＣＧＴＣＧＣＡＣＴＴＣＡＴＧＡＴＣＧ－３′
提取麻疯树幼嫩叶片总 ＲＮＡ．叶片基因组 ＤＮＡ
的提取使用北京天根公司植物基因组ＤＮＡ提取
试剂盒．用ＮａｎｏＶｕｅ超微量分光光度计测定核酸
浓度，采用１％的琼脂糖凝胶电泳检测核酸完整
性．
２．２．２　麻疯树ＫＴＩ基因ＯＲＦ片段的获得　用纯
化的ＲＮＡ为模板，以ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）１８为反转录引物，
进行反转录，得ｃＤＮＡ．采用根据 ＮＣＢＩ数据库序
列（Ｇｅｎｂａｎｋ　Ｎｏ．：ＸＭ＿０１２２２９２８８．１）设计的特异
性引物ＪｃＫＴＩ－ＢＦ和ＪｃＫＴＩ－ＳＲ（表１）从麻疯树基
因组ＤＮＡ和叶片ｃＤＮＡ扩增麻疯树ＫＴＩ基因的
ＯＲＦ序列．ＰＣＲ反应条件为：９４℃５ｍｉｎ，３０个循
环（９４℃３０ｓ、６０℃３０ｓ、７２℃５０ｓ），７２℃７
ｍｉｎ．测序检测其正确性（北京华大基因公司）．
０７１１
第５期 　　 牛蓓，等：一个麻风树Ｋｕｎｉｔｚ型蛋白酶抑制剂基因的克隆和鉴定 　
２．２．３　ＪｃＫＴＩ基因的生物信息学分析　使用的
生物软件：ＤＮＡＭＡＮ６．０、Ｐｒｉｍｅｒ　Ｐｒｉｍｅｒ５．０、
Ｖｅｃｔｏｒ　ＮＩＴ　７．０．
使用的网上的数据库和在线分析网址如下：
Ｂｌａｓｔ：ｈｔｔｐ：／／ｂｌａｓｔ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／
Ｂｌａｓｔ．ｃｇｉ
ＯＲＦ　ｆｉｎｄｅｒ：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．
ｇｏｖ／ｇｏｒｆ／ｇｏｒｆ．ｈｔｍｌ
Ｃｏｍｐｕｔｅ　ｐＩ／Ｍｗ：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｘｐａｓｙ．ｏｒｇ／
ｔｏｏｌｓ／ｐｉ＿ｔｏｏｌ．ｈｔｍｌ
ＣＤ　Ｓｅａｒｃｈ：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．
ｇｏｖ／Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ／ｃｄｄ／ｗｒｐｓｂ．ｃｇｉ
Ｓｗｉｓｓ－ｍｏｄｅｌ：ｈｔｔｐ：／／ｓｗｉｓｓｍｏｄｅｌ．ｅｘｐａｓｙ．ｏｒｇ／
２．２．４　ＪｃＫＴＩ基因组织特异性表达研究　根据
克隆出的ＪｃＫＴＩ　ｃＤＮＡ全长序列设计ＫＴＩＱ１和
ＫＴＩＱ２作为荧光定量ＰＣＲ引物，选取麻疯树ａｃ－
ｔｉｎ基 因 作 为 内 参 基 因，引 物 为 ＪｃＡｃｔＰ１ 和
ＪｃＡｃｔＰ２（表１）．
ＲＮＡ的提取与荧光定量ＰＣＲ扩增：分别从麻
疯树的幼根、幼叶、叶柄、茎及成熟的种子中提取
ＲＮＡ，所得ＲＮＡ立即反转录ｃＤＮＡ．采用Ｂｉｏ－Ｒａｄ
公司的ＳＹＢＲ?Ｐｒｅｍｉｘ　Ｅｘ　ＴａｑＴＭⅡ，分别以麻疯
树的以上５个部位的ｃＤＮＡ为模板，ＰＣＲ反应在
Ｂｉｏ－Ｒａｄ　ＩＱ５ＰＣＲ仪上进行，反应体系按试剂盒说
明操作．反应程序为９５℃变性１０ｓ后，进入９５℃
１０ｓ，６０℃２０ｓ，７２℃２０ｓ的４０个循环，最后在
７２℃延伸３ｍｉｎ．从５５℃到９５℃进行溶解曲线分
析，去除引物二聚体和其他非特异性扩增．每个样
品均重复三次以避免加样误差，实验数据利用
ｉＱ５－Ｃｙｃｌｅｒ进行分析．分析方法为２－ΔΔＣｔ法［９］．
２．２．５　ＪｃＫＴＩ基因原核表达、纯化、蛋白含量及
活性测定　载体构建：用ＢａｍＨⅠ和ＳａｃⅠ内切酶
将重组ｐＥＡＳＹ－Ｔ－ＪｃＫＴＩ质粒和ｐＥＴ３２载体进行
双酶切，胶回收后，用Ｔ４连接酶在１６℃连接过夜，
转化大肠杆菌ＴＯＰ１０，获得重组表达载体ｐＥＴ３２－
ＪｃＫＴＩ．
原核表达：将构建好的重组质粒ｐＥＴ３２－ＪｃＫ－
ＴＩ转化到原核表达菌株ＢＬ２１（ＤＥ３）．转化子于
ＬＢ培养基中３７℃，２５０ｒｐｍ培养至ＯＤ６００达到０．
６，加入终浓度为１ｍＭ 的ＩＰＴＧ，诱导４ｈ后离心
收集菌体，加入上样缓冲液，振荡悬浮、破碎离心，
取上清进行１２％聚丙烯酰胺凝胶（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）电
泳检测．
表达蛋白的纯化：取４ｇ诱导后的ｐＥＴ３２－
ＪｃＫＴＩ菌体，用４０ｍｌ　Ｂｕｆｆｅｒ　Ａ稀释，置于冰水混
合物上，用超声破碎仪裂解细胞（９ｓ超声，６ｓ停
止，共３０ｍｉｎ），然后在２００００ｇ，４ ℃下离心３０
ｍｉｎ．上清即为粗蛋白样品．对携带６×Ｈｉｓ标签的
重组ＪｃＣＰＩ蛋白，用ＢｅａｖｅｒＢｅａｄｓ金属离子螯合
磁珠进行纯化（见ＢｅａｖｅｒＢｅａｄｓ说明书）．
表达蛋白浓度及活力进行鉴定：采用ＢＣＡ法
测定蛋白浓度，使用Ｐｉｅｒｃｅ　Ｍｏｄｉｆｉｅｄ　ＢＣＡ　ｐｒｏｔｅｉｎ
Ａｓｓａｙ　Ｋｉｔ，构建牛血清白蛋白标准品的标准曲线，
并进行微量检测．采用Ｎ－ｂｅｎｚｏｙｌ－Ｌ－ａｒｇｉｎｉｎｅ　ｅｔｈｙｌ
ｅｓｔｅｒ（ＢＡＥＥ）法［１０］，对纯化后的重组蛋白ｐＥＴ３２－
ＪｃＫＴＩ的胰蛋白酶抑制活力进行鉴定．
２．２．６　ｐＹＧ８１９８－ＪｃＫＴＩ 载体的构建 　 采用
ｐＹＧ８１９８载体进行转化烟草实验，其含有２×
ＣａＭＶ３５Ｓ启动子和 ＧＵＳ报告基因．用ＢａｍＨⅠ
和ＳａｃⅠ酶分别对测序正确的重组ｐＥＡＳＹ－Ｔ－
ＪｃＫＴＩ质粒和ｐＹＧ８１９８质粒进行双酶切，Ｔ４连
接酶连接，构建ｐＹＧ８１９８－ＪｃＫＴＩ表达载体，转化
大肠杆菌Ｔｏｐ１０，挑选阳性菌落进行ＰＣＲ和测序，
鉴定其正确性，用于转化农杆菌．
２．２．７　农杆菌介导转化烟草　采用冻融法，将
ｐＹＧ８１９８－ＪｃＫＴＩ载体转入农杆菌ＧＶ３１０１中．通
过叶盘法，将转化成功的转基因农杆菌浸染烟草无
菌苗叶片．将侵染过的叶片放到 ＭＳ基本培养基上
２８℃暗培养２ｄ；最后将共培养的叶片转移到分化
筛选培养基上进行筛选培养［１１，１２］．待不定芽长到
１ｃｍ左右时，切下不定芽并转移到生根培养基［１１］．
生根的烟草长到约５ｃｍ高时，进行转基因检测，在
温室中炼苗１周，移栽到营养土中．
２．２．８　转基因烟草鉴定检测　ＰＣＲ 法和 ＲＴ－
ＰＣＲ检测：提取烟草叶片ＤＮＡ，以此为模板并以
ＪｃＫＴＩ－ＢＦ和ＪｃＫＴＩ－ＳＲ为引物进行ＰＣＲ扩增，同
时以野生型的烟草基因组ＤＮＡ为阴性对照，此法
用于检测目的基因ＪｃＫＴＩ是否整合到烟草基因组
中．提取烟草总ＲＮＡ，做反转录，得ｃＤＮＡ．以野生
型烟草为阴性对照．取２μＬ　ｃＤＮＡ为模板，以引物
ＪｃＫＴＩ－ＢＦ和ＪｃＫＴＩ－ＳＲ进行ＰＣＲ扩增，以检测目
的基因ＪｃＫＴＩ是否转录表达．同时以烟草１８Ｓ作
为分子内标，以引物Ｎｔ１８ＳＦ和Ｎｔ１８ＳＲ进行ＰＣＲ
扩增．ＰＣＲ反应条件为９４℃预变性５ｍｉｎ，９４℃
变性３０ｓ，６０℃退火３０ｓ，７２℃延伸５０ｓ，共３０个
循环，７２℃延伸７ｍｉｎ，用１％琼脂糖凝胶电泳作
分析．
２．２．９　转基因烟草的胰蛋白酶抑制活性检测　采
１７１１
　 四川大学学报（自然科学版） 　 第５３卷
用０．１％明胶酶谱法［１３］对烟草株系（野生型与转
基因株系）的胰蛋白酶抑制剂活性进行０．１％明胶
ＳＤＳ－ＰＡＧＥ电泳检测．
采用 Ｍａｓｏｕｄ，Ｓ．Ａ．等人的方法提取烟草株系
总蛋白［１４］，酶活测定采用ＢＡＥＥ法［１０］．将各株系
（野生型与转基因株系）的蛋白样品（１００μｇ）与牛
胰蛋白酶（２μｇ）充分混合并在室温下孵育３０ｍｉｎ
以使样品蛋白与蛋白酶溶液充分作用，加入３ｍｌ
ＢＡＥＥ溶液，取２５０μｌ于２５３ｎｍ下记录反应管４
ｍｉｎ内吸光度的变化．
２．２．１０　转基因烟草抗虫实验［１４］　选取相同发育
状态的转基因烟草叶片饲喂二龄初棉铃虫．在直径
９ｃｍ的塑料盘注入２％的琼脂，琼脂上铺１层滤
纸以维持昆虫生长所需的湿度，每个塑料盘放入５
头幼虫．饲喂７２ｈ后对烟草和棉铃虫的表型进行
拍照，同时测定棉铃虫的体重．
３　结果与分析
３．１　麻疯树ＪｃＫＴＩ基因ＯＲＦ的克隆及序列分析
根据ＮＣＢＩ数据库序列（Ｇｅｎｂａｎｋ　Ｎｏ．：ＸＭ＿
０１２２２９２８８．１）设计引物，分别以麻疯树基因组
ＤＮＡ和叶片ｃＤＮＡ为模板进行ＰＣＲ实验，均获得
一条长度为５４０ｂｐ的片段（图１Ａ）．测序数据显示
其与麻疯树基因组数据库中的ＪｃＫＴＩ基因的
ＯＲＦ区域完全相同，表明成功地获得了该基因的
ＯＲＦ片段，并且该片段的基因组序列没有内含子．
Ｃｏｍｐｕｔｅ　ｐＩ／Ｍｗ预测结果表明该开放读码框
对应的蛋白质的理论分子量为１９．９ｋＤａ，等电点
（ｐＩ）为４．５２，属酸性蛋白．ＪｃＫＴＩ蛋白与其它物种
同源蛋白的同源性从高到低依次是大戟科的蓖麻
ＫＴＩ（Ｒｉｃｉｎｕｓ　ｃｏｍｍｕｎｉｓ，ＸＰ＿００２５２５８７３）、杨树
ＫＴＩ（Ｐｏｐｕｌｕｓ　ｎｉｇｒａ，ＡＥＫ２６９３１）、柑 橘 ＫＴＩ
（Ｃｉｔｒｕｓ　ｃｌｅｍｅｎｔｉｎａ，ＥＳＲ６１９３９）、黄瓜ＫＴＩ（Ｃｕｃｕ－
ｍｉｓ　ｓａｔｉｖｕｓ，ＸＰ＿００４１３９１９３）和大豆 ＫＴＩ（Ｇｌｙｃｉｎｅ
ｍａｘ，ＮＰ＿００１２３６２４１），同源性分别为７２ ％、６２
％、５７％、５０％、３５％．虽然同源性序列比对结果
发现ＪｃＫＴＩ蛋白和已有的其他植物的 ＫＴＩ氨基
酸序列同源性最高的是７２％（图１Ｃ），但预测的３Ｄ
结构显示ＪｃＫＴＩ蛋白与同一家族的其他蛋白非常
类似［１５］（图１Ｂ），特别是ＣＤ　Ｓｅａｒｃｈ分析发现该理
论蛋白含有 ＫＴＩ蛋白典型的ｋｕｎｉｔｚ结构域，即
［Ｌ，Ｉ，Ｖ，Ｍ］－Ｘ－Ｄ－｛ＥＫ｝－［ＥＤＮＴＹ］［ＤＧ］－［ＲＫＨ－
ＤＥＮＱ］－Ｘ－［Ｌ，Ｉ，Ｖ，Ｍ］－Ｘ－｛Ｅ｝－｛Ｑ｝－Ｘ（２）－Ｙ－Ｘ－
［Ｌ，Ｉ，Ｖ，Ｍ］［８，１６］（见图１Ｃ黑三角处），并含有反应
环结构（见图１Ｃ横线处），其被认为与抑制活性有
关［１６］．此外，其还含有６个半胱氨酸残基，其中４
个相对保守，参与２对二硫键的形成．据此，推测
ＪｃＫＴＩ蛋白应该属于ＫＴＩ家族成员．
３．２　ＪｃＫＴＩ基因在麻疯树不同组织中表达的荧
光定量分析
采用实时定量ＰＣＲ技术分析了ＪｃＫＴＩ在麻
疯树根、茎、叶、叶柄和种子中的 ｍＲＮＡ表达转录
水平．结果显示，该基因在五个被检测组织中均有
表达．其中，根和茎中的表达量相对较高，叶柄居
中，叶子和种子中表达量较低（图２）．
３．３　ＪｃＫＴＩ基因在大肠杆菌中的表达及活性研究
将克隆得到的ＪｃＫＴＩ　ＯＲＦ片段克隆到原核表
达载体ｐＥＴ３２中，转入Ｅ．ｃｏｌｉ　ＢＬ２１（ＤＥ３）．转化子
经ＩＰＴＧ诱导，成功地表达出一个分子量在３７ｋＤａ
左右的新蛋白（图３Ａ）．该分子量如果扣除载体部分
氨基酸残基和 Ｈｉｓ标签对应的部分（约１７ｋＤａ），则
与融合蛋白的理论分子量大小（１９．９ｋＤａ）接近，说
明重组ＪｃＫＴＩ蛋白获得表达．
采用超声破碎结合ＢｅａｖｅｒＢｅａｄｓ金属离子螯合
磁珠的方法纯化目标蛋白．１００ｍｌ的培养物能够纯
化得到约１８ｍｇ的电泳纯重组蛋白（图３Ａ泳道５）．
使用ＢＡＥＥ法，以牛胰蛋白酶为靶蛋白，检测纯
化后的重组蛋白的胰蛋白酶抑制剂活性［１０］．结果表
明，随着重组蛋白浓度的增加，牛胰蛋白酶活力逐渐
降低，当重组蛋白浓度达到４０μｇ／ｍＬ时，牛胰蛋白
酶活力仅为对照的１０．４６％（图３Ｂ），说明大肠杆菌
中表达的ＪｃＫＴＩ蛋白是个有抑制剂活性的蛋白．
３．４　ＪｃＫＴＩ基因在烟草中的表达及活性研究
为了进一步研究ＪｃＫＴＩ基因的功能，将该基
因置于２×ＣａＭＶ３５Ｓ启动子之后，构建了植物双
元载体ｐＹＧ８１９８－ＪｃＫＴＩ．重组质粒经测序验证
后，用冻融法导入农杆菌ＧＶ３１０１中，并通过叶盘
法转化ＮＣ８９烟草．约２ｗ后在含有潮霉素的培养
基上农杆菌感染处理后的烟草叶片外植体诱导出
抗性愈伤组织，并长出丛生芽．丛生芽在继代培养
２ｗ后长成约１～２ｃｍ的绿色幼苗，最后经生根筛
选培养，得到抗性植株．
分别提取抗性烟草植株和野生型烟草植株的基
因组ＤＮＡ做为模板，用ＪｃＫＴＩ基因特异引物进行
ＰＣＲ扩增反应．结果显示，只有抗性植株的ＤＮＡ能
够扩增出约５４０ｂｐ的特异片段（图４Ａ），初步判定
ＪｃＫＴＩ基因已整合入烟草的基因组ＤＮＡ中．
２７１１
第５期 　　 牛蓓，等：一个麻风树Ｋｕｎｉｔｚ型蛋白酶抑制剂基因的克隆和鉴定 　
图１　ＪｃＫＴＩ基因的克隆及序列分析
Ａ．ｃＤＮＡ和基因组ＤＮＡ扩增图（Ｍ：ＤＮＡ　Ｍａｒｋｅｒ；１，ｃＤＮＡ；２，基因组ＤＮＡ）；Ｂ．ＪｃＫＴＩ蛋白预测的３Ｄ结构
（Ｋｕｎｉｔｚ结构域用正三角表示，ｒｅａｃｔｉｖｅ　ｌｏｏｐ用横线表示）；Ｃ．ＪｃＫＴＩ蛋白与其他植物ＫＴＩｓ的同源比对
Ｆｉｇ．１　Ｃｌｏｎｉｎｇ　ａｎｄ　ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ　ｏｆ　ＪｃＫＴＩ　ｇｅｎｅ
图２　ＪｃＫＴＩ基因组织特异性表达分析
Ｆｉｇ．２　Ｔｉｓｓｕｅ　ｓｐｅｃｉｆｉｃ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　ＪｃＫＴＩ　ｇｅｎｅ
为进一步判断ＪｃＫＴＩ基因是否在转基因烟草
中都已表达，分别以抗性烟草和野生型烟草的叶片
ｃＤＮＡ为模板，以烟草１８ＳｒＲＮＡ 基因为内参基
因，进行半定量ＲＴ－ＰＣＲ 分析．同样发现，所有的
被检测抗性烟草植株均能扩增出５４０ｂｐ的特异性
片段，野生烟草则未能获得扩增产物（图４Ｂ），这表
明整合到转基因烟草基因组中的麻疯树ＫＴＩ基因
已被成功转录．
采用明胶酶谱法对各株系（野生型株系和转基
因株系）提取物的胰蛋白酶抑制剂活性进行定性检
测．如图４Ｃ所示，在变性凝胶图谱中，各转基因株
系对应的蛋白水解条带均明显弱于野生型植株对
应的条带．这不仅表明ＪｃＫＴＩ蛋白在各个转基因
株系中均有表达，同时还具有胰蛋白酶抑制活性．
进一步用ＢＡＥＥ法对各株系（野生型株系和转基
因株系）蛋白提取物的胰蛋白酶抑制剂活性进行定量
检测．结果发现，野生型蛋白样品处理组的胰蛋白酶
活性最高，可达９６％，而转基因植物处理组的蛋白对
胰蛋白酶都具有一定抑制作用，其中Ｓ３株系的抑制
３７１１
　 四川大学学报（自然科学版） 　 第５３卷
活性最高，这与定性实验的数据基本一致（图４Ｄ）．
棉铃虫属于鳞翅目昆虫，其肠消化道主要消化
酶为丝氨酸蛋白酶类，胰蛋白酶抑制剂应该对其消
化酶的活性有抑制作用．为了检测转基因烟草对棉
铃虫是否具有抗性，用转入ＪｃＫＴＩ基因的烟草叶
片饲喂二龄初棉铃虫幼虫，观察其是否可以影响棉
铃虫幼虫的生长．结果显示，取食野生型烟草的棉
铃虫幼虫均可以正常生长到四龄期，并且野生烟草
图３　ＪｃＫＴＩ重组蛋白的诱导表达、纯化与活性检测
Ａ．ＪｃＫＴＩ重组蛋白的ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析与纯化（Ｍ：蛋白质标准分子量；１，诱导空载总蛋白；２，未诱导重组菌总蛋白；
３，诱导重组菌上清；４，诱导重组菌沉淀；５，纯化蛋白）；Ｂ．重组ＪｃＫＴＩ蛋白体外胰蛋白酶抑制活性试验
Ｆｉｇ．３　ＳＤＳ－ＰＡＧＥ　ａｎａｌｙｓｉｓ，ｐｕｒｉｆｉｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｅｎｚｙｍｅ　ａｃｔｉｖｉｔｙ　ｔｅｓｔｉｎｇ　ｏｆ　ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　ＪｃＫＴＩ　ｐｒｏｔｅｉｎ
图４　转ＪｃＫＴＩ烟草植株的ＰＣＲ及抗虫功能鉴定
Ａ．转基因烟草的基因组ＰＣＲ鉴定（Ｍ：ＤＮＡ　ｍａｋｅｒ；ＷＴ：野生型烟草；１－４：４个转基因烟草株系）；Ｂ．转
基因烟草叶片ＲＴ－ＰＣＲ鉴定 （ＷＴ：野生型烟草；１－４：４个转基因烟草株系）；Ｃ．转基因烟草株系的胰蛋
白酶抑制剂活性检测（明胶酶谱法）；Ｄ．转基因烟草株系的胰蛋白酶抑制剂活性检测（ＢＡＥＥ法）（ＷＴ：野
生型烟草；Ｓ１、Ｓ２、Ｓ３：３个转基因烟草株系；Ｅ．二龄初棉铃幼虫虫体和取食烟草叶片的情况（二龄初棉
铃幼虫取食烟草７２ｈ）；Ｆ．棉铃虫幼虫取食各烟草株系后的体重变化（ＷＴ：野生型烟草；Ｓ１、Ｓ２、Ｓ３：不同
株系的转基因烟草）
Ｆｉｇ．４　ＰＣＲ　ａｓｓａｙ　ａｎｄ　ｉｎｓｅｃｔ－ｒｅｓｉｓｔａｎｔ　ｆｕｎｃｔｉｏｎ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｉｎ　ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ　ｔｏｂａｃｃｏ　ｐｌａｎｔｓ
４７１１
第５期 　　 牛蓓，等：一个麻风树Ｋｕｎｉｔｚ型蛋白酶抑制剂基因的克隆和鉴定 　
叶片大部分已被取食，而取食了转基因烟草的棉铃
虫幼虫的生长则停留在３龄期，转基因烟草叶片仅
有部分被取食（图４Ｅ）．测量实验棉铃虫幼虫的重
量，可以发现取食转基因叶片的棉铃虫幼虫体重明
显低于对照组（图４Ｆ），表明进食含有ＪｃＫＴＩ蛋白
的烟草导致棉铃虫幼虫生长缓慢．
４　讨　论
本研究根据麻疯树基因组序列数据，克隆并鉴
定了一个胰蛋白酶抑制剂基因ＪｃＫＴＩ．生物信息
学分析显示，该基因编码的蛋白具有保守的
Ｋｕｎｉｔｚ功能域［１５，１６］，很可能属于Ｋｕｎｉｔｚ型蛋白酶
抑制剂家族．
无论是原核表达产物还是在转基因烟草中过
表达该基因，都证实了该蛋白具有胰蛋白酶抑制活
性．实验数据显示当原核重组蛋白用量达到１．０８
×１０－６　ｍｏｌ／Ｌ时，可以抑制９０％的牛胰蛋白酶活
性，但低于同为原核表达的大豆胰蛋白酶抑制剂
ＫＴＩ的活性［１７］．对该蛋白进行同源性分析已经发
现，其活性位点的氨基酸残基并非完全保守，而这
些残基又是酶与抑制剂相互作用的主要活性位点，
推测这可能是ＪｃＫＴＩ抑制活性低的原因（图１Ｃ）．
Ｙａｏ　Ｐ　Ｌ等人的研究曾指出，改变活性位点氨基酸
残基可以变换抑制剂的抑制活性［１５］．此外，虎纹捕
鸟蛛粗毒中提取的ＫＴＩ蛋白酶活性位点区一些氨
基酸的差异，导致其抑制活性是牛胰蛋白酶抑制剂
抑制活性的２８．５倍［５，１８］．不过，有分析指出，丝氨
酸蛋白酶抑制剂活性位点的突变频率普遍比较高，
并认为这是受到植物抵御各种不同病虫害侵犯所
产生的选择压力的影响［１９］．因此，推测麻疯树ＪｃＫ－
ＴＩ结构及活性的差异也可能是同样原因所致．
棉铃虫是一种生长周期短的害虫，其对农作物
有一定危害．以棉铃虫二龄幼虫为供试对象的抗虫
实验结果显示取食了转基因烟草的棉铃虫生长发育
缓慢，叶片受损程度较轻（图４Ｅ和图４Ｆ），初步证实
了该蛋白的抗虫功能，但是否具有长效的抗虫性，需
要后续实验进行长期的跟踪研究，并同时结合害虫
的生理生化指标对该基因的抗虫功才能进行确认．
ＪｃＫＴＩ基因在根、茎中表达丰度较高，在叶片
和种子中表达较低（图２），这一结果与大多数豆类
植物的ＫＴＩ作为储藏蛋白，在种子和幼胚中高表
达不同［３，７，２０］，说明ＪｃＫＴＩ蛋白在麻疯树中可能并
不作为种子储藏蛋白发挥功能．已有的研究表明
ＫＴＩ基因是一个基因家族［５，８］，因此在麻疯树的种
子和叶片中发挥抑虫功能的可能是其他的ＫＴＩ基
因家族成员；或者麻疯树种子和叶片中富含的其它
抑虫成分，如佛波酯、生物碱等在发挥作用［２１，２２］．
另一方面麻疯树的根和茎部富含乳汁，有可能更为
害虫所青睐［２３，２４］，ＪｃＫＴＩ基因在这两个部位高表
达，正是应答这些害虫的入侵．
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