全 文 ：安徽农业大学学报 , 2009, 36(1):54-58
JournalofAnhuiAgriculturalUniversity
山合欢种子胰蛋白酶抑制剂纯化及部分性质研究＊
周嘉裕 1, 2 ,廖　海 1 ,唐　琳 2 ,徐　莺2 ,陈　放 2＊
(1.西南交通大学生命科学与工程学院 ,成都 610031;2.四川大学生命科学学院 , 成都 610064)
摘　要:采用去离子水抽提 、硫酸铵分步盐析 、亲和层析和分子筛层析等方法 , 从山合欢种子中得到一种胰蛋
白酶抑制剂。 SDS-PAGE结果表明 , 该抑制剂由 2条多肽链构成 ,分子量分别为 14.5和 5.5 kDa。 MALDI-TOF测定
该抑制剂的精确分子量为 19 768.23Da。该抑制剂能与胰蛋白酶形成1∶1的复合物 ,并且它们的结合不受SDS的影
响。该抑制剂的肽指纹图谱中有 7个主要的信号簇 。通过串联质谱测定该抑制剂的部分氨基酸序列 , 比对发现与
其他 Kunitz蛋白酶抑制剂有较高的同源性。
关键词:分离纯化;山合欢;性质;胰蛋白酶抑制剂
　　中图分类号:Q78 文献标识码:A 文章编号:1672-352X(2009)01-0054-05
PurificationandcharacterizationofatrypsininhibitorfromAlbizziakalkoraseeds
ZHOUJia-yu1, 2 , LIAOHai1 , TANGLin2 , XUYing2 , CHENFang2
(1.CollegeofLifeScienceandEngineering, SouthwestJiaotongUniversity, Chengdu610031;
2.CollegeofLifeScience, SichuanUniversity, Chengdu610064)
Abstract:AtrypsininhibitorwaspurifiedfromAlbizziakalkoraseedsbydistiledwaterextraction, (NH4)2SO4
precipitation, afinitychromatographyonSepharose4B-trypsinandFPLCgelfiltrationonSuperdexG75.Theinhibi-
torwascomposedoftwopolypeptidechainswithrelativemolecularmassof14.5kDaand5.5kDabySDS-PAGE.
Theaccuratemolecularmassofthisinhibitorwasdeterminedas19 768.23 DabyMALDI-TOF.Theinhibitorhad
onereactivesiteandformedcomplexeswithtrypsinwith1∶1 molarratio.Peptidemassfingerprintoftheinhibitor
showedsevensignalclusters.PartialaminoacidsequenceofthepurifiedproteinfromMS/MSshowedahighdegree
ofhomologywithvariousmembersoftheKunitz-inhibitorfamily.
Keywords:purification;Albiziakalkora;characteristics;trypsininhibitor
　　蛋白酶抑制剂(proteaseinhibitor)普遍存在于
动 、植物以及微生物中 ,尤其是许多植物的贮藏器
官 ,如种子和块茎中 ,主要参与生物体内蛋白酶活性
的调节 ,信号受体的相互作用 ,以及逆境情况(如外
界损伤)下的应答等生理过程 [ 1-2] ,保护植物免受真
菌和昆虫的侵袭 。植物蛋白酶抑制剂是一类重要的
抗虫物质 ,是植物抗虫基因工程的重要目的基因来
源 [ 3-6] ,因此寻找及利用胰蛋白酶抑制剂是极具研究
意义的 。Kunitz蛋白酶抑制剂和 Bowman-Birk蛋白
酶抑制剂是豆科中 2种具有不同结构和特性的胰蛋
白酶抑制剂。 Kunitz蛋白酶抑制剂约含有 180氨基
酸残基 ,分子量在 20 000左右 ,分子中只有 1个可
与酶作用的活性位点。而 Bowman-Birk蛋白酶抑制
剂由 70个左右氨基酸组成 ,分子量在 8 000上下 ,
具有 2个相同或不同的蛋白酶相作用的活性中心。
山合欢 (Albizziakalkora)属豆科含羞草亚科乔木 ,
是重要的药用植物资源 ,具有镇静安神 、抗生育 、活
血消肿 、止痛 、抗肿瘤和增强免疫的功效 [ 7] 。作者
从山合欢种子中分离纯化了 1种胰蛋白酶抑制剂
＊收稿日期:2008-07-03
基金项目:教育部重点科技项目(104151)和西南交通大学科技发展基金项目(20060116)共同资助。
作者简介:周嘉裕(1976-), 女 ,博士。 ＊通讯作者(Correspondingauthor)　E-mail:fangchen807@yahoo.com.cn
(Albizziakalkoratrypsininhibitor, AKTI),并对其部
分性质进行了研究。
1　材料与方法
1.1　材料
成熟山合欢 (Albiziakalkora(Roxb.)Prain)采
自西南交通大学峨眉校区 ,剥离种子备用 。FPLC的
SuperdexG-75为 GE产品 ,标准蛋白质分子量参照
物 、丙稀酰胺 、N′, N′-甲叉双丙稀酰胺为 Fluka公司
产品 ,胰蛋白酶 、甘氨酸 、Tris为 Amersco产品 ,牛血
清白蛋白购自 Promega公司。固相化胰蛋白酶亲和
柱制备参照 HotGene公司提供的操作方法。其余试
剂均为国产分析纯。
1.2　方法
1.2.1　山合欢种子胰蛋白酶抑制剂粗品的制备　
100g山合欢种子研碎后 ,用 1 000mL去离子水 4℃
搅拌抽提 2h,于 6 000 g离心 20 min,沉淀再抽提 1
次 ,合并 2次抽提液 。抽提液用(NH4)2SO4分步盐
析(30% ～ 65%饱和度),再对 0.05 mol·L-1 Tris-
HCl, pH8.0充分透析 ,于 12 000 g离心 20 min,弃
去沉淀 ,得抑制剂粗品 。
1.2.2　山合欢种子胰蛋白酶抑制剂的纯化　将抑
制剂粗品分批上样至经 0.05 mol·L-1 Tris-HCl, pH
8.0预先平衡的胰蛋白酶 -Sepharose亲和层析柱
(1cm×4cm),以 0.05mol·L-1 Tris-HCl, pH8.0缓
冲液平衡(20 mL),再以 0.05 mol·L-1 Tris-HCl, pH
8.0, 0.5 mMNaCl的缓冲液洗涤(5 mL),再换蒸馏
水洗涤(5 mL),最后用 pH2.0的 Glycine-HCl酸化
水洗脱 ,收集洗脱峰并且立即加入 1.5 mol·L-1的
Tris溶液调节 pH至中性 ,流速为 0.5 mL·min-1 ,每
管收集 1.5 mL。合并活性峰 ,对去离子水充分透
析 ,冷冻干燥得蛋白质粉末 。用 1 mL的 0.1
mol·L-1 Tris-HCl, pH8.0缓冲液溶解该蛋白质粉
末 。上样于 FPLC的 SuperdexG-75柱进行分子筛
层析(1.5cm×80cm),柱在上样前先用 2倍柱体积
的 0.1mol·L-1 Tris-HCl, pH8.0缓冲液平衡。用同
一缓冲液洗脱 ,流速为 1 mL·min-1 ,每管收集 1mL,
可以纯化得到 AKTI。
1.2.3　明胶 -SDS-PAGE电泳法　采用 Hanspal等
的方法 [ 8] ,在分离胶中加入 0.2%(W/V)明胶 。样
品处理液配方:6%SDS, 0.3 mol·L-1 Tris-HClpH
8.0, 50%甘油 , 0.05%溴酚蓝。样品与样品处理液
按 2∶1比例混合 , 37℃温浴 1h。电泳完毕后 ,去离子
水冲洗胶板 3次 ,置于 2.5% TritonX-100溶液中复
性 20 ～ 25 min(2次)。去离子水冲洗胶板 ,置于含
50 μg·mL-1胰蛋白酶的 0.1 mol·L-1 Tris-HCl, pH
8.0的酶解缓冲液中 , 37℃水浴保温 30 min,考马斯
亮兰 R-250染色。
1.2.4　蛋白质浓度测定　以牛血清白蛋白为标准 ,
按 Braford的方法测定 [ 9] 。
1.2.5　MALDI-TOF　MALDI-TOF委托北京华大公
司进行测定 ,采用 Bruker公司的 AutoFlex型 MAL-
DI-TOF质谱仪 。混合标准分子量肽包括胰岛素
(5 734 Da),泛素(8 566 Da),细胞色素 C(12 361
Da)和肌红蛋白(16 952Da)。
1.2.6　SDS-PAGE　SDS-PAGE采用 Laemmli的方
法进行[ 10] 。
1.2.7　胰蛋白酶 -酶蛋白酶抑制剂亲和电泳　胰
蛋白酶 -酶蛋白酶抑制剂亲和电泳采用 Ware等的
方法 [ 11] ,胰蛋白酶抑制剂与胰蛋白酶在室温下反应
30 min,加入 1 /4体积的样品处理液(6%SDS, 0.3
mol·L-1 Tris-HClpH8.0, 50%甘油 , 0.05%溴酚蓝)
混合均匀 。采用 SDS-PAGE检测胰蛋白酶与胰蛋白
酶形成复合物的情况。 SDS-PAGE的分离胶浓度为
12%,浓缩胶浓度为 5%。
1.2.8　肽指纹图谱与串联质谱　首先利用 15%的
SDS-PAGE(含还原剂)对 AKTI纯品进行电泳 ,胶板
经考马斯亮兰 R250染色和 10%乙醇 -10%乙酸脱
色。仔细地将 AKTI的 α条带切下 ,送往北京华大
公司测试肽指纹图谱与串联质谱 。
2　结果与分析
2.1　山合欢胰蛋白酶抑制剂(AKTI)的纯化与纯
度鉴定
山合欢种子粉末经去离子水抽提 、30% ～ 60%
(NH4)2SO4盐析 ,得到抑制剂粗品 。抑制剂粗品经
含明胶的 SDS-PAGE检测 ,发现含有 1种胰蛋白酶
抑制剂 。抑制剂粗品经亲和层析 (Trypsin-Sepha-
rose)分离得到具有强抑制活性的 2号峰(图 1A)。
收集合并 2号峰 ,再经分子筛柱 FPLC(SuperdexG-
75)进一步分离得到具有强抑制活性的 3号峰 (图
1B),用含明胶的 SDS-PAGE检测 3号峰 ,发现胰蛋
白酶抑制剂活性带位置与粗品位置相同(图 2A)。
最后通过未含还原剂的 SDS-PAGE检测 3号峰显示
单一谱带 ,近似分子量为 20 kDa;而通过含有还原
剂的 SDS-PAGE检测显示两条带 ,近似分子量分别
为 14.5 kDa和 5.5kDa(图 2)。该结果表明已纯化
得到了山合欢胰蛋白酶抑制剂 (Albizziakalkora
trypsininhibitor, AKTI),该抑制剂由 2条多肽链构
成 ,分子量较大的命名为 α链 ,分子量较小的命名
5536卷 1期 周嘉裕等　山合欢种子胰蛋白酶抑制剂纯化及部分性质研究
为 β链 ,这和目前已报道的众多豆科含羞草亚科植 物的 Kunitz抑制剂的肽链组成相同 。
(A)Trypsin-Sepharose亲和层析;(B)SuperdexG-75分子筛层析。图 A与 B中箭头所指位置为含有胰蛋白酶抑制剂的活性峰
(A)SeperationofcrudeproteinsofAlbiziakalkoraontrypsin-Sepharosecolumn.(B)Furtherseparationofthepeak2 intheFig.
1AonSuperdexG-75chromatography.Peakscontainingtrypsininhibitoryactivityareindicatedwitharrow
图 1　山合欢胰蛋白酶抑制剂的纯化过程
Figure1　PurificationofAlbiziakalkoratrypsininhibitor
(A)明胶-SDS-PAGE,第 1道:山合欢抑制剂粗品;第 2道:
纯化的 AKTI。 (B)SDS-PAGE, M道:分子量标准;第 1道:
经还原剂处理的 AKTI;第 2道:未经还原剂处理的 AKTI;
第 3道:经还原剂处理的山合欢抑制剂粗品
(A)Gelatin-SDS-PAGE, Lane1:Albiziakalkoracrudeex-
tract;Lane2:purifiedAKTI.(B)SDS-PAGE, M:molecular
weightmarkers;Lane1:reducingAKTI;Lane2:non-reducing
AKTI;Lane3:reducingcrudeextract
图 2　明胶-SDS-PAGE与 SDS-PAGE
Figure2　Gelatin-SDS-PAGEandSDS-PAGEresults
2.2　AKTI的分子量
AKTI的 MALDI-TOF出现了 2个信号峰 ,其中
9 880.71为双电荷峰 , 19 768.23为单电荷峰 ,表明
AKTI的精确分子量为 19 768.23(图 3),这和目前
已报道的众多豆科含羞草亚科植物的 Kunitz抑制
剂的分子量相似 。
图 3　AKTI的 MALDI-TOF
Figure3　MALDI-TOFanalysisofthepurifiedAKTI
2.3　AKTI的亲和电泳
当胰蛋白酶与 AKTI温浴 30 min后 , 再进行
SDS电泳 ,在 43 kD位置处产生了一条新的电泳条
带 ,恰好为胰蛋白酶(23 kD)与 AKTI(20 kD)的分
子量之和(图 4)。实验结果表明胰蛋白酶与 AKTI
能够按 1∶1的比例形成复合物 , AKTI同一般的
Kunitz抑制剂作用机理相同 ,也属于互补类型。
2.4　AKTI的肽指纹图谱
AKTI的 α链在经过变性 、胰蛋白酶酶解处理
后 ,得到由若干肽段所组成的肽混合物。利用
MALDI-TOF分析这些肽混合物的分子量 ,得到 AK-
TI的肽指纹图谱(图 5)。 AKTI的肽指纹图谱有 7
个主要的信号簇 ,其中 5个信号簇为单信号峰(图
中 的 971.49、 1 197.76、 1 357.83、 1 544.89、
56 安 徽 农 业 大 学 学 报 2009年
2 118.09),另外 2个信号簇为双信号峰 (图中的
1 286.49和 1 323.88)。 1 323.88信号峰在所有信
号簇中的信号最强 ,推测该肽段可能最容易被酶解 。
利用 MASCOT软件 ,将 AKTI肽指纹图谱数据在
NCBI上检索 ,未检索到相关的蛋白酶抑制剂 ,表明
目前尚未有 AKTI肽指纹图谱的报道。
2.5　AKTI的串联质谱结果和 DenovoSequencing
结果
选取 AKTI的 α链肽指纹图谱中的 3个信号峰
(M+H)+m/z1 197.76, 1 286.49, 1 323.88做进一
步的串联质谱分析 ,并利用 DenovoSequencing软件
分析其氨基酸序列。测定结果表明3个片段的序列分
别为 (M+H)+ m/z1 197.76 (KLPTGCDDYK),
1 286.49 (PAYPGLMPGVER),与 1 323.88 (DLPAS-
GWGLPRR)。将3个肽段序列分别在 NCBI上检索 ,
结果发现 3个肽段均与多种 Kunitz蛋白酶抑制剂有
不同程度的同源性 ,其中与银合欢蛋白酶抑制剂
(Leucaenaleucocephalatrypsininhibitor, AAB26177)
同源性最高。利用 DNAMAN软件进行比对 ,发现它
们与多种豆科 Kunitz抑制剂有较多的保守氨基酸
(图 6)。
ACTI:Acaciaconfusatrypsininhibitor(AAB26177);PJTI:Prosopsisjulifloratrypsininhibitor(AAB21123);APTI:
Adenanthherapavoninatrypsininhibitor(1208243A);PTTI:Psophocarpustetraganolobustrypsininhibitor(P10821);BVTI:
Bauhiniavariegatatrypsininhibitor(P83595);LLTI:Leucaenaleucocephalatrypsininhibitor(P83036);ECTI:Erythrinacafra
trypsininhibitor(P09943);ELTI:Erythrinalatissimatrypsininhibitor(P68171)
图 6　山合欢胰蛋白酶抑制剂与其他 Kunitz蛋白酶抑制剂的氨基酸序列比较
Figure6　PartialsequencesofAKTIalignedwithdiferentknownKunitzinhibitors
5736卷 1期 周嘉裕等　山合欢种子胰蛋白酶抑制剂纯化及部分性质研究
3　讨论
目前对豆科植物蛋白酶抑制剂的研究发现 , 3
个亚科植物分别含有不同种类的蛋白酶抑制剂 。云
实亚科植物只含有由 1条肽链构成的 Kunitz抑制
剂 ,含羞草亚科植物只含有由 2条肽链构成的
Kunitz抑制剂 ,而蝶形花亚科植物只含有 Bowman-
Birk抑制剂[ 12] 。本文报道的 AKTI,根据其分子量 ,
肽链组成 ,抑制摩尔比与部分氨基酸序列同源性 ,应
当属于含羞草亚家族 Kunitz抑制剂 。由于豆科的 3
个亚科中 ,蝶形花亚科的进化程度最高 ,云实亚科的
进化程度最低 ,而含羞草亚科介于中间。因此本文
报道的结果对于豆科植物的分类与进化研究也具有
重要意义。
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