全 文 ：收稿日期:2012-10-06; 修订日期:2013-03-11
基金项目:国家自然科学基金资助项目(No． 30900291)
作者简介:明平红(1984-) ，男(汉族) ，湖北黄石人，现为 2010 级湖北中医
药大学检验学院硕士研究生，主要从事分子生物学研究工作．
* 通讯作者简介:宁 勇(1958-) ，男(汉族) ，湖北武汉人，现任湖北中医
药大学教授，博士学位，主要从事血栓与止血研究工作．
乳浆大戟提取物诱导 HeLa细胞凋亡及其机制研究
明平红1，陈红波2，蔡 婷1，黄来强2，周兰贞3，郭采平3，宁 勇1*
(1．湖北中医药大学检验学院，湖北 武汉 430065;
2．清华大学深圳研究生院基因与抗体治疗技术重点实验室，广东 深圳 518055;
3．深圳市卫武光明生物制品有限公司，广东 深圳 518055)
摘要:目的 研究乳浆大戟提取物诱导宫颈癌 HeLa细胞凋亡的作用及其分子机制。方法 采用 MTT法和克隆形成实验
检测乳浆大戟提取物对宫颈癌 HeLa细胞的生长和增殖抑制作用;利用 Annexin V － FITC /PI双染和 DAPI细胞核染色法
检测乳浆大戟提取物诱导细胞凋亡情况;线粒体膜电位检测凋亡细胞的线粒体膜电位变化情况;流式细胞仪和 Western
blot法分别分析细胞周期及细胞周期蛋白变化情况。结果 ①乳浆大戟提取物以时间和剂量依赖的方式显著抑制宫颈癌
HeLa细胞的生长和增殖;②乳浆大戟提取物能使宫颈癌 HeLa细胞线粒体膜电位显著降低，诱导细胞发生凋亡性细胞死
亡;③乳浆大戟提取物能够显著阻滞宫颈癌 HeLa 细胞在 G0 /G1 期，降低 Cyclin D1、Cyclin E 和 CDK4 的表达水平，增加
P21 的表达水平。结论 乳浆大戟提取物通过下调 Cyclin D1、Cyclin E和 CDK4 的表达和上调 P21 的表达，使 HeLa细胞阻
滞在 G0 /G1 期，进而显著抑制宫颈癌 HeLa细胞生长和增殖，诱导细胞依赖线粒体通路的凋亡性死亡。
关键词:乳浆大戟; 宫颈癌; HeLa细胞; 细胞周期; 凋亡
DOI标识:doi:10． 3969 / j． issn． 1008-0805． 2013． 06． 014
中图分类号:R285． 5 文献标识码:A 文章编号:1008-0805(2013)06-1318-03
Study on the mechanism of Euphorbia esula extract induced HeLa cells apoptosis
MING Ping-hong1，CHEN Hong-bo2，CAI Ting1，HUANG Lai-qiang2，ZHOU Lan-zhen3，GUO Cai-ping3，NING Yong1*
(1． Hubei University of Chinese Medicine，Hubei，Wuhan 430065;2． The Shenzhen Key Lab of Gene and Antibody
Therapy，Graduate School at Shenzhen of Tsinghua University，Guangdong Shenzhen 518055;3． Shenzhen Weiwu
Guangming Biological Products CO．，LTD，Guangdong，Shenzhen 518055)
Abstract:Objective To study the impact of Euphorbia esula extract induced HeLa cells of cervical apoptosis and its molecular
mechanism．Methods MTT assay and clonogenic survival assay were used to detect the growth and proliferation of cervical cells;
Annexin V － FITC /PI double staining and DAPI nuclear staining were used to detect the apoptosis which were induced by Euphor-
bia esula extract;Mitochondrial membrane potential change was investigated with JC － 1 assay;Cell cycle change and cell cycle －
related proteins were respectively analyzed by flow cytometry and Western blot method． Results (1)Euphorbia esula extract can
significantly inhibit the growth and proliferation of HeLa cells of cervial cencer in a time and dose － dependent manner．(2)Eu-
phorbia esula extract significantly reduced the mitochondrial membrane and induced HeLa cells of cervical cencer to die by apopto-
sis．(3)Euphorbia esula extract significantly arrested the cells growth in the G0 /G1 phase，reduced the expression levels of Cyclin
D1，Cyclin E and CDK4 proteins，and increased the expression levels of P21 protein． Conclusion Euphorbia esula extract can in-
duce the cell cycle arrest at G0 /G1 phase by down － regulating the expression levels of Cyclin D1，Cyclin E and CDK4 proteins，
and up － regulating the expression levels of P21 protein． Therefore，Euphorbia esula extract can efficiently inhibit the cell prolifera-
tion and the apoptosis of HeLa cells．
Key words:Euphorbia esula; Cervical cancer; HeLa cell; Cell cycle; Apoptosis
乳浆大戟是一种有毒的大戟科多年生草本植物，高约 15 ～
40cm，有白色乳汁。生于山坡、山沟草地或砂质地上，在我国分
布较广。临床用于治疗四肢浮肿，小便不利，肠炎，疟疾，慢性气
管炎;外用治颈淋巴结结核，疮癣，瘙痒等。乳浆大戟还作为一个
民间医药用于治疗肿胀和疣［1］，但国内外鲜有治疗肿瘤方面的
报道尤其是治疗宫颈癌方面的报道。
宫颈癌是第二常见的妇科恶性肿瘤。在 2002 年全球癌症统
计中，约有 273000 人死于宫颈癌，是全球死亡率的一个主要因
素［2］。HPV感染与宫颈癌密切相关。感染人类乳头状瘤病毒
(HPV)是宫颈癌的主要病因［3］。HPV 含有二百多种病毒［4］，
HPV16 型是最普遍的高危型，占所有宫颈癌的 56%［5］，其次是
HPV18 型。流行病学证据也表明，感染 HPV 高危型是宫颈癌最
重要的危险因素。95%的宫颈癌和上皮内瘤变的组织活检中能
检测到 HPV － DNA［6］。在女性恶性肿瘤中宫颈癌占 15%比例，
其中 83%发生在发展中国家，而在发达国家只有 3． 6%［1］。所以
预防、诊断和治疗宫颈癌成了维护妇女健康的首要问题。
本研究以宫颈癌 HeLa细胞(HPV18 型)为研究对象，探讨乳
浆大戟提取物对宫颈癌细胞的生长抑制作用效果，并对其抗癌机
制进行了初步研究。
1 材料与仪器
1． 1 细胞株 HeLa 细胞株购自购自中国典型培养物保藏中心
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(CCTCC) ，由本实验室保存。
1． 2 试剂 乳浆大戟提取物自己提取，4℃保存备用;线粒体膜电
位检测试剂盒(JC － 1)、β － actin抗体购自碧云天公司;MTT、DA-
PI、AnnexinV － FITC、PI 购自 invitrogen 公司;CyclinD1、CyclinE、
CDK4、P21 抗体购自 Abcalm公司。
1． 3 仪器 BD InfluxTM流式细胞仪、OLMPUS 激光共聚焦显微
镜、BeckMan DU 800 分光光度计、Leica DMI 6000B 荧光显微
镜、Thermo Scientific Variskan Flash读数仪、BeckMan扫描仪。
2 方法
2． 1 乳浆大戟的制备 将乳浆大戟洗净、烘干、粉碎。取干粉
100． 0 g，按一定的料液比加入 95%的乙醇，用连续回流提取法提
取乳浆大戟活性物质。提取液用旋转蒸发仪浓缩，加无菌蒸馏水
定容至 1 g·ml －1，4℃保存备用。
2． 2 细胞培养 将 HeLa细胞培养于含 1%抗生素(100 U /ml 青
霉素、100 μg /ml链霉素)和 10%胎牛血清的 DMEM 培养基，置
于 5%CO2，37℃培养箱中培养，取对数生长期的细胞用于实验。
2． 3 MTT增殖抑制实验 调整对数生长期的 HeLa细胞密度为 1
× 104 /ml 接种在 96 孔板中，乳浆大戟提取物处理，终浓度分别
为:0，1，2，4，8 和 16 μg /ml。每孔重复 3 个，并设置只加培养基
的空白对照，24，48，72 h后每孔加 20 μl 的 MTT(5mg /ml) ，37℃
培养 4 h，弃上清，每孔加 150 μl的 DMSO，振荡 10 min使结晶紫
全部溶解，490 nm 测量 OD 值。计算每孔存活率。存活率(%)
=实验组 OD值 /对照组 OD值 × 100%。实验重复 3 次。
2． 4 细胞克隆形成抑制实验 调整对数生长期 HeLa 细胞的密
度为 0． 5 × 103 /ml，接种在 6 孔板上，补加 2 ml DMEM 培养基。
使乳浆大戟浓度分别为:0，1，24，8 和 16 μg /ml，每个浓度设置 3
个复孔，37℃培养 2 周，然后用 1%的多聚甲醛固定，0． 1%结晶
紫染色 15 min，拍照。实验重复 3 次。
2． 5 线粒体膜电位检测 取对数生长期 HeLa 细胞铺六孔板，乳
浆大戟提取物处理 24 h，终浓度分别为 0 μg /ml，8μg /ml 吸除六
孔板培养液，用 PBS洗涤细胞 2 次，加入 1 ml细胞培养液和 1 ml
JC － 1 染色工作液，充分混匀，细胞培养箱中 37℃孵育 20 min，用
冰的 JC － 1 染色缓冲液(1X)洗涤 2 次，加入 2 ml 细胞培养液，荧
光显微镜或激光共聚焦显微镜下观察。实验重复 3 次。
2． 6 DAPI细胞形态凋亡检测 取对数生长期 HeLa细胞，铺六孔
板，24 h后，用不同浓度(0，2，4，8 和 16 μg /ml)药物处理 24h，吸
弃培养液，用 PBS洗 2 次，4%多聚甲醛固定 15 min，PBS洗 2 次，
0． 1% Tritonx － 100 打孔 5min，PBS洗 2 次，加入 100 μl DAPI染色
工作液，室温放置 10 min，吸除 DAPI 染色液，用 PBS 洗涤 3 次，
荧光显微镜观察细胞核形态。实验重复 3 次。
2． 7 Annexin V － PI细胞凋亡率分析 取对数生长期 HeLa细胞，
铺六孔板，细胞经过不同浓度(0，2，8 和 16 μg /ml)乳浆大戟处理
24 h，胰酶消化后每样本收集 1 × 106 个细胞，缓冲液洗 2 次，加入
195 μl Annexin V － FITC结合液轻轻重悬细胞，加入 5 μl Annexin
V － FITC，轻轻混匀，室温避光孵育 10 min。1 000 r /min 离心 5
min，弃上清，加入 190 μl Annexin V － FITC 结合液轻轻重悬细
胞。加入 10 μl PI染色液，轻轻混匀，避光放置。300 目尼龙网过
滤后随即进行流式细胞仪检测。实验重复 3 次。
2． 8 FCM 法细胞周期分析 取对数生长期 HeLa 细胞，铺六孔
板，细胞经过不同浓度(0，2，8 和 16 μg /ml)处理 24 h后，胰酶消
化细胞，收集对数生长期 1 × 106 个细胞，用 1 ml PBS 重悬，滴加
到 4 ml 预冷 70%乙醇中，4℃固定过夜，离心弃上清，PBS 洗 2
次，加 10 mg /ml的 RNaseA 2 μl 至 1ml 的 PBS 中使终浓度为 20
μg /ml ，37℃孵育 30 min，离心，PBS 洗 1 次，加 1 μl PI 至 500 μl
的 PBS中，室温避光染色 30min，用 300 目尼龙网过滤，上流式细
胞仪分析。实验重复 3 次。
2． 9 Western blot 蛋白分析 取对数生长期 HeLa 细胞，铺六孔
板，细胞经过不同浓度(0，2，8 和 16 μg /ml)药物处理 24h。
Wesern blot分析，用 1 × SDS裂解细胞提取总蛋白，测定含量，上
等量蛋白样品 SDS － PAGE 电泳，转移到 PVDF 膜，5%脱脂奶粉
室温封闭 2 h，一抗 4℃过夜，TBST洗涤，HRP标记的二抗室温孵
育 1 h，TBST洗涤，ECL试剂作用，X线片曝光、显影。实验重复 3
次。
2． 10 统计学分析 所有数据采用 SPSS16． 0 统计软件分析，采用
t检验，P ＜ 0． 05 认为有统计学差异，P ＜ 0． 01 认为有显著差异。
3 结果
3． 1 乳浆大戟提取物以时间和剂量依赖的方式显著抑制宫颈癌
细胞的生长和增殖 MTT 结果显示 1，2，4，8 和 16 μg /ml 的乳浆
大戟处理组的 HeLa细胞存活率与对照组(0 μg /ml)相比明显降
低，均有显著性差异(P ＜ 0． 01)。同一浓度的乳浆大戟在作用
24，48 和 72 h时，细胞的存活率亦明显降低。乳浆大戟对宫颈癌
Hela细胞的增殖抑制作用呈现时间及剂量依赖关系，即随着剂
量的增大和作用时间的延长乳浆大戟对细胞的生长抑制作用显
著增强(图 1)。在细胞克隆形成实验中 1，2，4，8 和 16μg /ml 的
药物处理组的 HeLa细胞克隆数与对照组(0 μg /ml)相比均明显
减少，4 μg /ml时基本无克隆细胞。同时随着药物浓度的增加细
胞克隆细胞数减少，抑制率明显增加(图 2 所示)。
图 1 MTT检测乳浆大戟提取物
对 HeLa细胞增殖的影响
图 2 细胞克隆形成实验检测乳浆大戟提取物
对 HeLa细胞增殖的影响
3． 2 乳浆大戟提取物能够诱导宫颈癌细胞通过线粒体方式发生
凋亡 线粒体膜电位结果显示，对照组(0 μg /ml)呈红色荧光且
呈完整的颗粒状，表明细胞线粒体膜完整，膜电位处于正常值，而
乳浆大戟提取物处理组(8 μg /ml)细胞呈绿色荧光，表明线粒体
明显受到损伤，颗粒状的线粒体减少，线粒体膜电位降低(图 3 所
示)。
DAPI染色后观察细胞核形态发现，对照组(0 μg /ml)细胞中
细胞核呈圆形、边缘清晰且着色均匀，而乳浆大戟提取物处理组
细胞中，细胞核变得不规则，染色质呈致密浓染，或呈碎块状致密
浓染，表现出典型的凋亡特征。另外还随着乳浆大戟浓度的增加
活细胞数量显著减少(图 4 所示)。
Annexin V － FITC结果显示，对照组(0 μg /ml)的凋亡率为
0． 11% ，而乳浆大戟提取物处理组 2、8 和 16μg /ml 的凋亡率分
别为 8． 33%、40． 77% 和 90． 29%。细胞凋亡率随着乳浆大戟提
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LISHIZHEN MEDICINE AND MATERIA MEDICA RESEARCH 2013 VOL． 24 NO． 6 时珍国医国药 2013 年第 24 卷第 6 期
取物浓度的升高而明显增多(图 5 所示)。DAPI 和 Annexin V －
FITC实验均证实乳浆大戟提取物能够诱导细胞凋亡，线粒体膜
电位实验表明乳浆大戟提取物能够损伤线粒体使其膜电位降低，
因此乳浆大戟提取物很可能通过线粒体方式诱导宫颈癌细胞发
生凋亡。
图 3 线粒体膜电位分析
图 4 荧光显微镜下细胞核形态变化
A:0 μg /ml(对照组) ，凋亡率:0． 11% ;
B:2 μg /ml，凋亡率:8． 33% ;C:8 μg /ml，凋亡率:40． 77%;
D:16 μg /ml，凋亡率:90． 29%
图 5 Annexin V － PI双染检测 Hela细胞凋亡率(%)
3． 3 乳浆大戟提取物显著抑制细胞周期在 G0 /G1 期 FCM法检
测结果表明，0，2，8 和 16 μg /ml的乳浆大戟提取物抑制宫颈癌细
胞在 G0 /G1 期的比例分别是 47． 20%，50． 15%，71． 49%，
88． 65%，由此可见乳浆大戟提取物能阻滞宫颈癌细胞在 G0 /G1
期，且随着药物浓度的增加阻滞更明显，在高浓度药物作用下还
出现了明显的凋亡峰(图 6 所示)。
A:0 μg /ml;B:2 μg /ml;C:8 μg /ml;D:16 μg /ml
图 6 FCM法分析乳浆大戟提取物对 HeLa细胞周期分布的影响
3． 4 乳浆大戟提取物调节相关细胞周期蛋白的表达 蛋白印迹
检测结果如图 7 所示，随着乳浆大戟提取物浓度的增加，细胞中
Cyclin D1、Cyclin E和 CDK4(周期依赖性激酶)的表达水平显著
降低，同时细胞中周期蛋白依赖性激酶的抑制蛋白 P21 蛋白的含
量明显升高。
图 7 免疫印迹法(western blot)检测乳浆大戟提取物
对细胞周期相关蛋白表达的影响 (β － actin作为内参)
4 讨论
宫颈癌是影响全球女性健康的第二大常见的肿瘤［7］，目前
宫颈癌的发病原因及机制尚未完全阐明，在诊断治疗上除手术治
疗外，其他治疗方法进展缓慢。由于大多数抗肿瘤药物缺乏特异
性，因此对正常机体有相当大的损伤。传统中医药在治疗妇科疾
病方面积累了大量的经验与验方，对减少宫颈癌化疗和放疗的副
作用均有较好的治疗作用［8，9］。中药治疗的优势在于远期疗效
较好，适应证广泛，毒副作用小，中药可以与很多方法联合用于各
期宫颈癌治疗，不但可以减轻其副作用，对宫颈癌的疗效也有明
显的提高。乳浆大戟是一种大戟科植物，过去一直对其利用价值
不高，鲜有治疗宫颈癌方面的报道。因此开发新的有效的化疗药
物具有重要意义。
细胞周期蛋白及细胞周期蛋白依赖激酶对细胞周期的进程
起至关重要的作用。Cyclin D1，Cyclin E 是与许多肿瘤的发生密
切相关的原癌基因，与细胞的 G1 期密切相关。Cyclin D1 表达升
高可激活 CDK4 和 CDK6 并缩短 G1 期，造成细胞周期调节失控
和细胞异常增殖。P21 作为抑癌基因是细胞周期重要调控因子
(依赖周期素的蛋白激酶抑制因子，CKI)中的一员，是与 G1 期相
关的抑癌蛋白。P21 的表达减少或缺失可能使抑制细胞增殖的
作用减弱，或使正常增生的细胞分化不良，导致肿瘤发生的可
能［10］。P21 在 DNA损伤修复中起重要作用，DNA损伤发生在 G1
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期，P21 可通过抑制 CDK 的活性而阻碍细胞进入 S 期。本研究
表明，浆大戟提取物能够显著下调与 G1→S 期转变相关的细胞
周期蛋白 Cyclin D1 和 Cyclin E的表达水平以及 CDK4 的表达水
平，同时上调抑制蛋白 P21 表达水平，进而使细胞周期阻滞于
G0 /G1 期，不能进入 S期，抑制了宫颈癌细胞的恶性增殖。
另外，本研究还发现，浆大戟提取物不但抑制了宫颈癌细胞
的生长和增殖，而且还诱导了宫颈癌细胞发生凋亡性死亡。An-
nexin V － PI细胞凋亡率分析证明随着乳浆大戟提取物浓度的增
加凋亡率增加;DAPI染色亦表明，乳浆大戟提取物作用后，细胞
出现典型的细胞凋亡特征。同时，我们的结果也表明，乳浆大戟
提取物可能是依赖线粒体通路诱导细胞发生凋亡。
总之，本研究发现，乳浆大戟提取物能有效阻滞宫颈癌细胞
在 G0 /G1 期，进而抑制了肿瘤细胞的生长和增殖，以线粒体通路
依赖的方式促进了肿瘤细胞的凋亡。本研究提示乳浆大戟是一
个非常有潜力的宫颈癌治疗药物。
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收稿日期:2012-09-20; 修订日期:2013-04-02
基金项目:国家自然科学基金(No． 81072961)
作者简介:宋继科(1983-) ，男(汉族) ，山东青岛人，现为山东中医药大学博士研究生，硕士学位，主要从事白内障临床与基础研究工作．
* 通讯作者简介:毕宏生(1960-) ，男(汉族) ，山东济南人，现任山东中医药大学附属眼科医院教授，博士研究生导师，硕士学位，主要从事白内障屈光
临床与基础研究工作．
冰片对盐酸青藤碱滴眼液角膜透过性的影响
宋继科1，毕宏生2，3* ，郭俊国3，解孝锋2，刘大美1
(1．山东中医药大学，山东 济南 250014; 2．山东中医药大学附属眼科医院，山东 济南 250002;
3．山东中医药大学眼科研究所，山东 济南 250002)
摘要:目的 考察冰片对盐酸青藤碱滴眼液角膜透过性的影响。方法 兔眼离体角膜透过实验考察冰片对盐酸青藤碱的
透过率的影响，实时微渗析技术考察冰片对盐酸青藤碱的眼部药物动力学影响。结果 盐酸青藤碱累计透过量与冰片浓
度成正比，空白及含 0． 01%，0． 02%，0． 04%冰片的盐酸青藤碱滴眼液表观渗透系数分别为(1． 248 ± 0． 25) ，(1． 624 ±
0． 35) ，(2． 167 ± 0． 33)和(2． 395 ± 0． 41) ;药物动力学参数 AUC(0 － t)分别为(14． 62 ± 2． 32) ，(22． 43 ± 4． 54) ，(30． 03 ±
6． 33) ，(41． 14 ± 6． 02) ，Cmax分别为(0． 088 ± 0． 019) ，(0． 186 ± 0． 021) ，(0． 299 ± 0． 013) ，(0． 378 ± 0． 016) ，与空白盐酸青
藤碱滴眼液对比，差异均具有统计学意义(P ＜ 0． 05)。结论 冰片能够提高盐酸青藤碱角膜透过性，有利于盐酸青藤碱更
好的发挥疗效。
关键词:冰片; 盐酸青藤碱; 离体角膜; 微渗析技术
DOI标识:doi:10． 3969 / j． issn． 1008-0805． 2013． 06． 015
中图分类号:R246． 82 文献标识码:A 文章编号:1008-0805(2013)06-1321-03
Effect of borneol on the absorption of Sinomenine Hydrochloride via Ocular administra-
tion
SONG Ji-ke 1，BI Hong-sheng 2，3* ，GUO Jun-guo 3，XIE Xiao-feng 2，LIU Da-mei 1
(1． Shandong University of Traditional Chinese Medicine，Jinan 250014，China;2． Affiliated Eye Hospital of
Shandong University of TCM，Jinan 250002，China;3． Eye Institute of Shandong University of Traditional Chi-
nese Medicine，Jinan 250002，China)
Abstract:Objective The purpose of this study was to investigate the effects of borneol on the pharmacokinetic and bioavailabili-
ty of SIN in rabbit via ophthalmic administration．Methods In vitro permeability characteristics of SIN across excised rabbit corne-
as was evaluated using modified Franz － type cells． To evaluate the effect of borneol on pharmacokinetic profiles of SIN in vivo，the
microdialysis method was employed． The concentrations of SIN were determined by reversed － phase high － performance liquid
chromatography (HPLC)after ophthalmic administration of SIN alone or in the presence of (0． 01%，0． 02%，and 0． 04%)bor-
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LISHIZHEN MEDICINE AND MATERIA MEDICA RESEARCH 2013 VOL． 24 NO． 6 时珍国医国药 2013 年第 24 卷第 6 期