全 文 ：果 树 学 报 2012，29（4）: 690~694
Journal of Fruit Science
应用生物学软件分析四季橘染色体核型和带型
陈春丽，邓于洋，郭文武 *
（华中农业大学园艺植物生物学教育部重点实验室，武汉 430070）
摘 要：【目的】为了改进以往人工方式观测染色体精准度的不足，【方法】采用 MicroMeasure 软件和 Image-Pro Plus
图像分析软件对 4，6-联脒-2-苯基吲哚（DAPI）荧光染色的四季橘（Citrus madurensis Lour. Tseng）体细胞中期染色体
分别进行核型分析和三维重建。 【结果】得到四季橘的核型公式 2n=18=16 m （2SAT） + 2 sm，其核型类型为 1B 型，属
于进化中较原始类型；获得四季橘染色体立体图，并依据每条前中期染色体（从短臂到长臂）DAPI 荧光强度变化，构
建出染色体带型模式图。 【结论】该研究利用染色体图像分析软件对染色体进行识别，获得了较丰富的染色体核型数
据信息，为柑橘细胞遗传学研究提供了新方法。
关键词： 四季橘； 图像分析； DAPI； 核型
中图分类号：S666．2 文献标志码：A 文章编号：1009－9980(2012)04－0690－05
Analyses of Citrus madurensis chromosomal karyotype and banding style
by Biological Image Software
CHEN Chun-li， DENG Yu-yang， GUO Wen-wu*
（Key Laboratory of Horticultural Plant Biology （Ministry of Education）， Huazhong Agricultural University， Wuhan，Hubei 430070 China）
Abstract: 【Objective】This study is to improve the resolution and accuracy of chromosome analysis.
【Method】The mitotic metaphase chromosomes of C. madurensis after 4， 6-Diamidino-2-Phenylindole
（DAPI） staining were analyzed with quantitative karyotype by MicroMeasure software and Image-Pro Plus
software application. 【Result】The results showed that: the karyotype formula of C. madurensis was 2n=18=
16 m （2SAT）+2 sm， which belonged to primitive Stebbins 1B type； On the other hand， by using DAPI
staining， C. madurensis exhibited variation of the fluorescence intensity in prometaphase chromosomes
（from the short arm to the long arm）， and based on this， the quantitative DAPI-banding ideogram was
constructed. 【Conclusion】Chromosome analysis by biological image software showed more detailed kary-
otype data， which is therefore considered to be a new method for citrus cytogenetic research.
Key words: C. madurensis； Image analysis； DAPI； Karyotype
染色体核型分析在基因组分析、种属关系分类[1]，
体细胞染色体结构变异观察 [2]和染色体物理图谱构
建[3-4]等生物技术领域至关重要。
柑橘染色体小（1.5-3.5 μm），大部分属中染色
体或近中染色体 [5-6]，形态相似且难以区分。 采用对
DNA 中 GC 或 AT 有特异亲和力的荧光染料色霉素
A3（chromomycin A3，CMA）或 4，6-联脒-2-苯基吲
哚（6-Diamidino-2-Phenylindole，DAPI）对染色体着
色， 染色体表现出多态性， 可将柑橘染色体分为 4
种、6种或 7种类型[2，7-8]。 以前无论是核型还是带型，
对染色体识别都比较有限，而且基于人工手动的测量
分析，存在较大人为误差，其结果的变异范围较大。
采用专业图像分析软件 MicroMeasure 和 Im-
age-Pro Plus 对四季橘进行核型和带型定性定量分
析，染色体呈现高度多态性，不仅大大提高了测量的
准确性， 而且可以将染色体组中每一单体染色体区
分开。
1 材料和方法
1.1 材料与染色体的制备
收稿日期： 2011－12－19 接受日期: 2012－03－26
基金项目： 国家自然科学基金（31125024）；国家 863 计划课题（2011AA100205）；湖北省自然科学基金（2009CDB071）
作者简介： 陈春丽，女，副教授，研究方向植物分子细胞遗传学。
觹 通讯作者 Author for correspondence． Tel: 027-87281543，E-mail: guoww@mail.hzau.edu.cn
DOI:10.13925/j.cnki.gsxb.2012.04.031
图 1 四季橘染色体核型分析
a. DAPI 染色的四季橘中期染色体，MicroMeasure 软件标记染色体
序号，着丝粒及长短臂；b. 根据 a 图中四季橘染色体的核型配对和染
色体长度的大小排列；c. 依据 b 图的四季橘染色体核型模式图
Fig. 1 Chromosomal karyotype of C. madurensis
a. DAPI stained metaphase C. madurensis somatic chromosomes， for
data collection， chromosomes were numbered arbitrarily from 1 to 18 in
each cell and chromosome length was measured parting to short arm and
long arm per chromosome （shown by white trace lines） using
MicroMeasure； b. Karyogram of C. madurensis according to chromosome
pairing and length size； c. Chromosomal ideogram of C. madurensis
according to b.
取四季橘（C. madurensis，2n=18）种子经 2％Na-
ClO表面消毒 10 min，蒸馏水洗净后，去种皮接种于
MT基本培养基， 待根长至 2 cm 时切取根尖 3 mm，
水饱和对二氯苯或 0.02％ 8－羟基喹啉 20 ℃预处理
2～4 h。水洗后 0.075 M/L KCl 前低渗 30 min。新鲜卡
诺氏（Carnoy’s）固定液（无水乙醇∶乙酸，3∶1）室温固
定 12～24 h。 根尖充分水洗后用 2%纤维素酶（Cellu-
lase Onozuka R-10，Yakult）和 2%离析酶（Macerozyme
R-10， Yakult） 1:1混合的酶液，28℃下酶解 3 h。 参
照陈瑞阳等[9]去壁低渗火焰干燥法制备染色体，稍有
修改。吸取 1个酶解后的根尖于干净的载玻片上，滴
半滴固定液，用镊子敲至浆状，再滴 2～3滴固定液使
细胞分散，火烤至着火。 最后 20倍相差显微镜下镜
检染色体制片。镜检后将具有至少 10个分散良好且
背景干净分裂相的制片储存于-20℃下备用。
1.2 荧光染色及观察照相
染色体制片上加 50 μL 5 mg·L-1 DAPI 染色 ，
Olympus BX61 荧光显微镜下 U 激发观察 DAPI 蓝
色荧光信号。 Olympus DP70 彩色 CCD （Charge cou-
pled device）照像。采用显微镜控制软件 BX2-BSW3.3
对所选视野获取 50个不同景深的系列图片，相邻两
焦平面相距 0. 1 μm，汇成序列图。
1.3 图象处理与分析
从 50张分裂相清晰的照片中选取 10 张包含有
全部染色体的照片，用 MicroMeasure 软件分析每条
染色体轨迹，将染色体全长、相对臂长、臂比值自动
导入 Excel， 实验结果作为同源染色体配对的参数。
利用 Image-Pro Plus 5.0 （IPP） 的去模糊功能（No
Neighbors deconvolution）去除图像中阴云干扰，获得
清晰的多重荧光染带图像， 利用光密度测量功能
（Line profile）测量每条染色体从短臂到长臂荧光强
度的变化，进行同源染色体配对和带型分析，利用三
维重建功能（3D reconstruction）构建染色体立体图。
2 结果与分析
2.1 染色体数目
观察统计染色体分散的体细胞分裂相 50 个，可
见 39 个细胞的染色体数目是 18 条 ， 占总数的
78%。其余细胞染色体数目从 16～21条不等，呈不恒
定状态。 据此表明四季橘的染色体数目是 2n=18。
2.2 染色体特征
2.2.1 染色体核型 将四季橘体细胞前中期或中期
染色体采用 MicroMeasure 软件测量染色体的长臂
和短臂（图 1-a），18 条染色体的相对长度、臂比、着
丝粒指数及类型等主要参数统计见表 1。 分析这些
参数对照李懋学等 [10]的植物核型分析标准，获得四
季橘体细胞染色体核型公式为 2n=2x=18=16 m
（2SAT）+2sm。根据染色体臂比和着丝粒指数等参数
将 18条染色体配对成 9 对，依据染色体长度大小依
次排列出四季橘的染色体核型图（图 1-b）。 第 1 对
染色体短臂上带有随体， 第 3对与第 4 对染色体长
度相近，第 5对与第 6对染色体几近等长。且第 3对
为近中部着丝粒染色体， 其余均为中部着丝粒染色
体。 同时依据图 1-b和表 1的数据参数制作出更加
直观的四季橘染色体核型模式图（图 1-c）。 综合以
上数据， 四季橘核型的主要特征为染色体数目 2n=
18， 绝对长度 1.42~4.36 μm， 相对长度 7.40%~
15.09%，肩比（长臂比短臂）1.06~1.87，着丝点类型
m，sm；染色体长度比 3.07，核类型 1B。
2.2.2 染色体立体观察 采用 2种方法对四季橘染
色体进行立体观察。 一种是对单张聚焦清晰的四季
橘染色体直接采用 IPP 软件的去卷积功能进行 2D
重建。 如图 2-a 是四季橘体细胞有丝分裂前中期染
色体的平面图， 采用 IPP 软件去卷积后 2D 重建得
到立体图（图 2-b）。图 2-b与图 2-a 比较，染色体对
比度较好，每条染色体上的荧光条带变得清晰，而且
整条染色体具有立体感， 便于染色体上的 DAPI 荧
光条带观察和计数。另一种方法是针对 50张同一分
裂相不同景深的染色体序列图，采用 IPP软件进行三
维重建后获得四季橘染色体的立体结构 （图 2-c）。
由于这种方法是将同一分裂相在不同景深依次采集
陈春丽等: 应用生物学软件分析四季橘染色体核型和带型
a b
c
4 期 691
果 树 学 报 29 卷
图 2 四季橘体细胞染色体立体分析
a. DAPI 染色的四季橘体细胞前中期染色体原始图； b. 将 a 图由 IPP 软件去模糊后的 2D 重建立体对照图； c. 四季橘染色体三维重建立体图
Fig. 2 The chromosomal stereograph of C. madurensis
a. Original image of C. madurensis mitotic prometaphase chromosomes with DAPI staining； b. Two-dimensionally reconstructed image after Neighbors
de-convolution using IPP software； c. Three-dimensionally reconstructed image of C. madurensis metaphase chromosomes
图 3 四季橘前中期第 3 号染色体 DAPI 带型及 DAPI 荧光强度变化曲线
a. DAPI 带型； b. 带型模式图， 明暗区域分别代表 DAPI 荧光强弱区域； c. DAPI 荧光强度变化曲线图， 纵轴和横轴分别表示染色体上 DAP I
荧光强度的灰度水平和相应像素的数值
Fig. 3 DAPI banding pattern and DAPI signal intensity profile along the somatic prometaphase
chromosome 3 of C. madurensis
a. DAPI banded pattern； b.DAPI-banding ideogram on the basis of image analysis， data black and white areas represent the intensely and faintly
stained regions by DAPI， respectively； c. DAPI signal intensity profile， the vertical and horizontal axes represented gray level of DAPI signal intensity and
the number of pixels along the chromosome， respectively
表 1 四季橘染色体参数
Table 1 Chromosome lengths， arm ratio and types of C. madurensis
序号
No.
相对长度 Relative length/% 臂比
Ratio of arms （long arm/short arm）
着丝点指数
Number of fundamental
类型
Type短臂 Short arm 长臂 Long arm 总长 Total
1
2
3
4
5
6
7
8
9
6.64
6.36
4.29
5.50
5.25
4.70
4.00
3.28
3.15
8.45
7.19
8.02
6.60
5.56
5.92
5.37
5.45
4.25
15.09
13.55
12.31
12.10
10.81
10.62
9.37
8.73
7.40
1.27
1.13
1.87
1.20
1.06
1.23
1.34
1.66
1.35
44.00
46.94
34.85
45.45
48.57
44.26
42.69
37.57
42.57
m-sat
m
sm
m
m
m
m
m
m
的序列图用软件合成三维图， 因而可以显示染色体
的真实立体结构。
2.2.3 染色体 DAPI 荧光显带 将获得的四季橘前
中期染色体立体图 （图 2-b） 中 3 号染色体根据其
DAPI 荧光显带带型（图 3-a），利用 IPP 软件定量分
析获得了该染色体从短臂到长臂的 DAPI 荧光波动
图 （图 3-c）。 纵轴表示 DAPI 荧光信号强度的灰度
值，横轴表示荧光在染色体的相应位置。波动的曲线
表示染色体 DAPI 荧光强度的变化。 无论在荧光较
强还是较弱区， 都能精确反映出荧光强度的细微变
化。 另外，曲线在着丝粒附近出现较高波峰，说明该
区域是 DAPI 深染区，与肉眼观察结果相吻合。 将图
3-c 所得的荧光波动图与肉眼观察结果综合， 绘制
出四季橘第 3号染色体带型模式图 （图 3-b）。 第 3
a cb
692
4 期
号染色体 DAPI 荧光带型图与带型模式图综合表
明，第 3 号染色体短臂上有 3 条带，即 2 条明带和 1
条暗带；长臂上有 7条带，即 4条明带和 3条暗带。
3 讨 论
3.1 四季橘核型与进化关系
四季橘原产广东， 是广东盆栽观赏柑橘的主栽
品种。在柑橘分类中一般将四季橘归于金柑属，认为
其起源于宽皮橘类与金柑属的天然杂种。 本研究表
明，四季橘的染色体大部分为 m 型，少数为 sm 型，
核型类型为 1B。 根据 Stebbins[11]有关染色体特征与
植物进化趋势关系的理论， 它在进化中属于较原始
类型， 推测其杂交亲本之一的宽皮柑橘可能是较原
始的橘类。
另外， 四季橘体细胞第 1号染色体短臂上随体
明显可见，随体大小稍短于短臂，属于较原始类型 b
型染色体。但染色体中的随体数目表现不恒定。部分
细胞中出现一对，部分细胞中存在 2对，有待进一步
确定。 这可能是由于四季橘为金柑和橘类的杂种[12]，
因而染色体上的随体具有不稳定性。
3.2 染色体核型、带型的生物学软件定量分析
实验中采用的 MicroMeasure 软件为 Colorada
州立大学生命科学院在线免费提供的半自动核型分
析 专 业 软 件 （http://www.biology.colostate.edu/Mi-
croMeasure）。 研究者可以主观的选择各种染色体参
数进行测量，例如长度、臂比、面积、浓度等 [13]。 软件
自动准确地将测量结果输入 Excel 表， 便于研究人
员后期分析。与传统的手工分析方法相比较，该方法
大大降低人为误差，提高工作效率，经济而可靠。
从前人的研究看，根据 CMA/DAPI 带的有无及
其在染色体上的位置（近中端、长臂末端和短臂末
端）， 可将柑橘染色体分为 A、B、C、D、E、F 6 种类
型[2，7-8]。本研究采用 IPP软件中 Line profile功能对染
色体进行荧光定量作图， 使染色体上着色深浅不同
的区域达到精确定量目标，可精确确定带纹的有无、
强弱及其在染色体上的相对位置， 避免了人为的误
差。采用此方法，四季橘染色体组中 9对染色体对应
生成不同曲线，可将每一条准确识别。 另外，IPP 中
去卷积功能，可减少荧光在间带（暗带）区域的阴云
干扰，使条带分界处更清晰。 3 D重建方法构建的立
体图， 可清晰直观地观察到染色体的立体形态。 可
见， 图像分析软件可对细胞遗传学研究提供强大而
有效的技术支持。
可以预见， 生物学软件将越来越多的结合到细
胞遗传学、分子细胞遗传学研究中。如已研制出生物
学软件可将弯曲的染色体拉直 [14]，使核型图更加直
观。 也有学者认为对染色体采用图像分析软件去模
糊处理后能够更精确地分析各种带型在染色体上的
分布区域[15-16]。这种定量分析还可以进一步对每条染
色体上的 DNA含量进行估测[17]。 最近又开发有新的
生物学软件，使染色体结构显示得更加精细，同时提
供更多的形态细节信息[18]。
3.3 DAPI荧光显带
DAPI是一种双链 DNA 特异染料，不与 DNA 单
链或 RNA 结合 [19]，最少与 4 个 AT 对作用，与 DNA
作用的机制有 3种。通过特殊的作用力，一个 DAPI分
子插入 DNA小沟中与 AT富有区中 AT对形成氢键，
发出较强荧光。 另外，DAPI正离子与 DNA磷酸负离
子静电作用，形成非特异性结合，产生较弱荧光 [19]，
因而呈现出 AT 富有区荧光强而 GC 富有区荧光弱
的明暗相间的染色体条带。 基于 DAPI 荧光显带的
着色机理， 本研究利用 DAPI 荧光染料对四季橘染
色体进行染色，显带方法简单易行，得到了较多的荧
光明暗相间的染色体条带， 为进一步利用图像分析
软件对染色体进行定量作图奠定了基础。
同时，本研究采用的 DAPI 荧光显带技术，除常
规的染色体制备外，没有经过任何其他的化学处理。
因此， 制片可以代表染色体的天然构象。 染色体上
DAPI 荧光强度高的代表异染色质富含区域，DAPI
荧光信号弱的区域代表富含常染色质。 由于结构异
染色质在同一变种或生态型中的各个发育期都稳定
一致， 研究异染色质在不同染色体上的不同分布是
识别染色体、 比较物种基因组之间的关系以及起源
进化的有力依据。DAPI荧光带型结合生物学软件分
析异染色质与常染色质在染色体上的分布区域以及
2 者在基因组中所占比例， 已在短柄草基因组测序
研究中得以应用[20]。
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