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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2014年第12期
人 体 内 的 乙 醛 脱 氢 酶 主 要 有 乙 醛 脱 氢 酶 1
（aldh1）和乙醛脱氢酶 2（aldh2）两种，乙醛的氧
收稿日期 ： 2014-05-26
基金项目 ：国家自然科学基金项目（81172178）
作者简介 ：黄娟，女，硕士研究生，研究方向 ：微生物发酵及下游产物的分离 ；E-mail ：huangjuan412@foxmail.com
通讯作者 ：吴元欣，男，博士，教授，研究方向 ：微生物发酵及下游产物的分离 ；E-mail ：wyx@mail.wit.edu.cn
人乙醛脱氢酶 2 的原核表达及其活性的鉴定
黄娟 王荷花 张小骥 潘博宇 陈孝平 吴元欣
（武汉工程大学化工与制药学院 绿色化工过程教育部重点实验室，武汉 430073）
摘 要 ： 商品化的乙醛脱氢酶主要从动物细胞、肝细胞线粒体中提取，其来源受到很大的限制，而且价格昂贵。为了解决
乙醛脱氢酶原料有限的问题，利用微生物发酵法获取乙醛脱氢酶。 将人乙醛脱氢酶 2 基因（aldh2）克隆至原核表达载体 pET32a 中，
构建重组载体 pET32a-ALDH2。将构建的重组载体转化大肠杆菌 E.coli BL21（DE3），用异丙基硫代-β-D-半乳糖苷（IPTG）进行诱导，
SDS-PAGE 电泳结果显示目的蛋白得到大量表达 ；且对诱导表达条件进行优化。结果显示，在 37℃，1.0 mmol/L IPTG 诱导表达 6 h
为最优表达条件。由于目的蛋白几乎都是以包涵体形式表达，为了得到有活性的乙醛脱氢酶，对包涵体变性、复性和纯化进行了研究。
试验数据显示，酶的最终得率为 14.49 U/L。并通过用 Bradford 法，测定复性蛋白的浓度约为 77 μg/mL，进行活性检测表明，该复
性蛋白具有乙醛脱氢酶活性，酶活性约为 1.449 U/mL。通过构建重组载体 pET32a-ALDH2 和优化表达条件，aldh2 在原核表达宿主
E.coli BL21（DE3）得到大量表达 ；此外，利用透析复性法得到的复性蛋白酶活性有所提高。
关键词 ： 乙醛脱氢酶 2 克隆 条件优化 酶活鉴定
DOI ：10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2014.12.034
Expression and Activity Assay of Human Aldehyde Dehydrogenase2 in
Escherichia coli
Huang Juan Wang Hehua Zhang Xiaoji Pan Boyu Chen Xiaoping Wu Yuanxin
（School of Chemical Engineering and Pharmacy，Wuhan Institute of Technology，Key Laboratory for Green Chemical Process of Ministry of
Education，Wuhan 430073）
Abstract: The commercial acetaldehyde dehydrogenase is mainly extracted from animal cell and hepatocellular mitochondria. Source
is limited and the cost is high. So the micobiological fermentation was used to obtain large amounts of aldh2, which had been cloned into the
expression vector pET32a with 6His tag that was advantageous to purify the recombinant protein by nickel-chelate chromatography, then the
recombinant was transformed into E.coli BL21（DE3）. After induced by IPTG, the recombinant protein had been expressed and their molecular
masses were determined to be approximately 55 kD by SDS-PAGE. Through the optimization of inducing expression conditions, the results
showed that the condition（37℃, 1.0 mmol/L IPTG, induced for 6 h）is the optimal. Because all target protein were almost expressed in the
form of inclusion body, the bioactive acetaldehyde dehydrogenase was obtained by means of degeneration, purification and renaturation for the
inclusion body, and measured the concentration of the renaturated protein by the Bradford method that was 77 μg/mL. Experimental data showed
that the final yield of enzyme was 14.49 U/L. Activity tests showed that the protein has the acetaldehyde dehydrogenase activity of about 1.449 U/
mL. By constructing a recombinant vector pET32a-ALDH2 and optimizing the expression condition, aldh2 in prokaryotic expression host get a
lot of expression. In addition, the activity of renaturation protein was improved by the dialysis renaturation method.
Key words: aldh2 Cloning Condition optimization Activity assay
化主要是依靠二者来完成，而 aldh2 对乙醛的活性
要高出 aldh1 的 50 倍［1］。aldh2 是乙醛脱氢酶的一
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2014年第12期202
种，是人体酒精代谢的关键［2］。它在人体的主要作
用是将人体内的酒精代谢后产生的乙醛脱氢氧化为
无毒的乙酸，乙酸再进入 TCA 循环代谢为二氧化碳
和水。在整个代谢过程中，乙醛脱氢酶是限速酶［3］。
有研究报道，乙醛对人体有致癌作用，它与人类肿
瘤的发生也有关系［4］。饮酒是食道癌的危险因素之
一［5-7］。当人过量饮酒时，酒精的代谢产物乙醛不
能及时被氧化，就会在体内积累，容易诱发肝癌［8］。
由于 aldh2 在代谢乙醛中催化效率最高，所以 aldh2
在乙醛脱氢酶的研究中受到人们更广泛的关注。
目前，商品化的乙醛脱氢酶主要是从动物肝脏、
肝细胞线粒体中提取，资源很有限且价格昂贵，大
规模生产困难。获得乙醛脱氢酶比较传统的方法主
要是从微生物体内提取，Zarnt 教授［9］利用四氢呋
喃甲醇培养基培养 Ralstonia eutropha，并分离纯化
出了乙醛脱氢酶。香港中文大学的 Wing-Ping Fong
和 Ka-Fai Choy 教授［10］提出了一种以草鱼的内脏为
原材料，从其线粒体内分离提取 aldh2 的方法。该
方法对原料进行匀浆混合预处理后依次通过高速离
心分离，超滤浓缩并使用柱层析后得到比活为 4.46
U/mg 的 aldh2。为了解决乙醛脱氢酶资源有限的问
题，许多科研工作者都试图从微生物的发酵来获
取大量的乙醛脱氢酶。黄坤等［11］利用毕氏酵母分
泌表达 aldh2 时，在优化的诱导条件下可制备大量
aldh2，但由于酵母的生长周期比较长，所以得到的
目的蛋白的活性最高只能达到 0.115 U/mL。赵锦等［12］
也曾尝试过在酵母中表达乙醛脱氢酶，经分离纯化
后的乙醛脱氢酶液的酶活为 0.994 U/mL。由于受酵
母本底表达的影响，导致乙醛脱氢酶的表达量很少，
而且表达出来的酶活性较低。
本研究通过更换表达载体和宿主菌来提高乙醛
脱氢酶的表达量，即用原核表达载体 pET32a 在原
核表达宿主 E.coli BL21（DE3）中表达乙醛脱氢酶，
并对表达条件进行优化。由于目标蛋白是以包涵体
的形式表达，为了得到有活性的蛋白，所以对包涵
体变性、复性和纯化，并对复性蛋白的活性进行研究。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 试剂 高保真酶 Pyrobest DNA Polymerase，限
制 性 内 切 酶 Nde I、Pst I、Xho l、Sma I、EcoR V、
EcoR I、T4 DNA Ligase、1 kb 和 500 bp DNA Marker
购 自 TaKaRa 公 司 ；质 粒 小 提 试 剂 盒 购 自 天 根 生
物公司 ；琼脂糖凝胶、低溶点琼脂糖凝胶、IPTG、
TEMED 购自 Sigma 公司 ；蛋白分子量标准、丙烯胺
购自北京普利莱公司 ；巯基乙醇、β-NAD、BSA 购
自 Amresco 公司；Ni-NTA Agarose 购自 Invitrogen 公司。
1.1.2 菌株、质粒和培养基 用于分子克隆的宿主
E.coli DH5α，用于表达的宿主 E.coli BL21（DE3）由
本实验室保存。原核克隆载体 pBluescriptSKII 和原
核表达载体 pET32a 本实验室保存。带有 aldh2 基因
的克隆载体 pUC57-6His-ALDH2 由本实验室构建保
存。LB 培养基（胰蛋白胨 10 g/L，酵母浸粉 5 g/L，
氯化钠 10 g/L ；固体培养基添加 1.5% 琼脂粉）用于
大肠杆菌的培养。
1.2 方法
1.2.1 原核表达载体的构建
1.2.1.1 重组载体 pBluescriptSKII-aldh2 的构建 以
pUC57-6His-aldh2 为 模 板，P1（5-AAACATATGT-
CAGCCGCCGCCACCCAG-3），P2（5-AAACTCGAG-
TGAGTTCTTCTGAGGCACTTT-3）为引物，PCR 扩增
aldh2 片段，再用低熔点胶回收目的片段［13］。将碱
裂解法［14］提取的质粒 pBluescriptSKII 用限制性内
切酶 EcoR V 作单酶切后，低熔点胶回收。回收后的
目的片段和载体用 T4 连接酶 16℃过夜连接，连接
产物转化 E.coli DH5α 感受态细胞，蓝白斑筛选重组
子［15］。对阳性重组子进行蓝白斑初选后，为了进一
步确认阳性结果，对其中一个菌做酶切鉴定。
1.2.1.2 表 达 载 体 pET32a-aldh2 的 构 建 将 质 粒
pBluescriptSKII-aldh2 和表达载体 pET32a 分别用限
制性内切酶 Nde 1 和 Xho I 双酶切，将切下的 1 500
bp 目的片段和载体 pET32a 片段用低熔点胶回收后，
再用 T4 连接酶 16℃过夜连接，连接产物转化 E.coli
DH5α 感受态细胞，转化的菌种涂于含氨苄青霉素
的平板，过夜培养后，挑取单菌落用 PCR 菌落法［16］
筛选重组子，再进行酶切鉴定及 DNA 测序验证。
1.2.2 原核表达载体 pET32a-aldh2 的诱导表达 将
阳 性 克 隆 接 种 于 LB 液 体 培 养 基（ 含 50 μg/mL 的
AMP），37℃过夜培养，用碱裂解法提取质粒。重组
2014年第12期 203黄娟等：人乙醛脱氢酶 2的原核表达及其活性的鉴定
质粒 pET32a-aldh2 转化 100 μL BL21（DE3）感受态
细胞，构建工程菌。
取 1 mL 过夜培养的工程菌至 100 mL LB 液体
培养基中，37℃ 200 r/min 振荡培养，待 OD600nm=0.5
时，分别加入终浓度为 0.1、0.5 和 1.0 mmol/L IPTG，
30℃和 37℃诱导表达 6 h。将菌液离心，弃上清，
用 PBS 缓冲液重悬菌体，在沸水中煮 10 min。用
SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳检测 aldh2 是否表达。
1.2.3 乙醛脱氢酶活性的研究
1.2.3.1 收集包涵体 取 2 mL 过夜培养的工程菌
接种于 200 mL LB 液体培养基中，37℃ 200 r/min 振
荡培养，待 OD600nm=0.5 时，加入 IPTG 的终浓度为
1 mmol/L，37℃诱导表达 6 h，收集诱导表达的菌
体，离心弃上清，用 PBS 缓冲液洗涤菌体 3 次后，
20 mL PBS 缓冲液重悬细菌，在超声波破碎仪下破
碎 25 min（功率 300 W，工作 2 s，间歇 4 s），然后
于 4℃ 1 200 r/min 下离心 30 min 弃上清，包涵体洗
涤缓冲液洗涤两次后再用蒸馏水洗涤两次，离心，
收集包涵体。
1.2.3.2 包涵体的变性、复性和纯化 将收集的包
涵体溶于 4 mL 包涵体溶解缓冲液（8 mol/L 脲，50
mmol/L Tris，1 mmol/L EDTA，100 mmol/L NaCl，
pH8.0）中，室温振荡 1 h，离心 15 min 收集上清。
对于变性蛋白的复性，采取了透析复性法 ：上清放
入预先处理好的透析袋中，依次将透析袋放入 6、4、
3、2 以及 1 mol/L 尿素复性缓冲液中，分别在 4℃下
透析 3 h。最后在 PBS 缓冲液中过夜透析，收集复
性蛋白。由于表达载体 pET32a 带有 6His 融合标签，
所以本试验用 Ni-NTA 树脂纯化重组蛋白。将透析
复性的蛋白经过预先处理的镍柱，在 4℃下结合 1 h，
再用不同浓度的咪唑洗脱液洗脱柱子，收集洗脱液
（含目的蛋白）做电泳检测。
1.2.3.3 重组蛋白的酶活检测 采用考马斯亮蓝
法（Bradford 法）测定粗酶液中蛋白的含量。由于
NAD+、NADH 分别在 260 nm、340 nm 处有最大的
吸收峰，故酶、辅酶 NAD+ 和底物在一定条件下反应，
通过测定一定时间 340 nm 吸光度的变化值，可以计
算出 NAD+ 转化为 NADH 的量，根据酶活的定义计
算得到该酶的酶活。酶活性测定方法见文献［17］，
测定体系是对 Okibe 反应体系［18］的改进，按表 1 设
计酶活测定体系。
表 1 酶活测定反应体系
组分 加入量（mL）
1 mol/L Tris-HCl（pH9.2） 0.3
20 mmol/L β-NAD 0.3
100 mmol/L aldehyde 0.2
3 mol/L KCl 0.1
1 mol/L mercaptoethanol 0.03
H2O 2.06
enzyme 0.01
最后加入酶液后，立即混匀，迅速倒入比色皿
中，在 340 nm 处测定光吸收变化值（每分钟测定一
个吸光值）。酶活的定义 ：最适条件下，每分钟转
化 1 μmol 底物为 1 个活力（U），可得到反应体系里
ALDH2 的酶活计算公式为 ： Lμmol×cm䞦⍫ ×0.003 L ÷1 cm U △A340/min6.22×10-3 △A340/min
2.07
2 结果
2.1 乙醛脱氢酶2（aldh2）基因的克隆
以 pUC57-6His-aldh2 为模板，上述设计的 P1、
P2 为引物，扩增 aldh2 片段，以 1.0% 琼脂糖凝胶电
泳检测，发现 1 500 bp 处有明显的条带（图 1），与
预期的 aldh2 基因大小一致。
2000
bp
M 1
1500
1000
500
ⴞⲴᶑᑖ
M ：500 bp DNA Marker ；1 ：aldh2 基因片段
图 1 aldh2 基因扩增产物
2.2 pBluescriptSKII-aldh2重组子的筛选及酶切
鉴定
将 扩 增 的 aldh2 片 段 和 经 EcoR V 酶 切 的
pBluescriptSKII 用低熔点胶回收后，16℃过夜连接，
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2014年第12期204
再将连接产物转化 DH5α 感受态细胞后涂布于有
IPTG 和 X-gal 的筛选平板上，过夜培养。挑取白斑
分别做两组酶切，即 Sma I 单酶切，Nde I 和 Xho I
双酶切，鉴定为阳性克隆（图 2）。
菌体，SDS-PAGE 检测分析全菌蛋白的表达，如图 4
所示，几组不同的诱导条件，全菌蛋白中均含有大
约为 55 kD 诱导蛋白，与预期的乙醛脱氢酶的分子
量一致。随着 IPTG 浓度的增加，乙醛脱氢酶的表达
量明显增多，且 37℃表达组明显优于 30℃表达组。
而且试验还从诱导时间进行优化，在 37℃，IPTG 浓
度为 1.0 mmol/L，分别对诱导表达 2、4、6 和 8 h 的
蛋白进行电泳检测分析（图 5），随着诱导时间的增
加，蛋白的表达量也随之增加。
2.4.2 重组蛋白的纯化 由于目的蛋白是以包涵体
的形式表达，所以要得到具有生物活性的乙醛脱氢
酶，需要对包涵体进行变性，复性和纯化才能检测
其活性。将收集的包涵体溶于适量包涵体溶解缓冲
液后，离心收集上清液，即得到变性的重组蛋白。
变性的重组蛋白采用透析复性法复性后，收集复性
蛋白。再将复性蛋白经过预先处理的镍柱，4℃下
结合 1 h，分别用 10、20、40、60、80、100 和 200
mmol/L 咪唑洗脱液洗柱，并收集洗脱液。如图 6 所
5000
bp
M 1 2
4000
3000
2000
1000
1
pBluescriptSKII-aldh2
4 479 bp
aldh2
lac
Amp
Xho I 668
Nde I 702
Pst I 2154
Xho I 2207
EcoR I 2219
Pst I 2229 Sma I 2233
A
B
M ：1 kb DNA Marker ；1 ： 重 组 载 体 pBluescriptSKII-aldh2 Sma I 单 酶
切（4 479 bp）；2 ：重 组 载 体 pBluescriptSKII-aldh2 Nde I 和 Xho I 双 酶 切
（2 940 bp+1 505 bp）
图 2 重组载体 pBluescriptSKII-aldh2 构建（A）及酶切
鉴定图（B）
2.3 pET32a-aldh2重组子的筛选及酶切鉴定
将用菌落 PCR 鉴定的阳性重组子 pET32a-aldh2
分别做两组酶切，即 Pst I 单酶切，Nde I 和 Xho I 双
酶切，试验结果与预期一致，鉴定为阳性克隆（图 3）。
将重组子测序，以 T7 Promoter Primer 为引物。对测
序结果进行分析，测得序列与 NCBI 上公布的 aldh2
基因序列一致。测序结果表明，aldh2 基因已成功构
建到 pET32a 载体上。
2.4 重组蛋白的诱导表达及纯化
2.4.1 重组蛋白诱导表达条件的优化 分别从温度
和 IPTG 浓度两个因素来优化表达条件。离心收集
1
pET32a-aldh2
6 874 bp
aldh2
lac
Amp
Pst I 1144
Nde I 5207
Pst I 6659 XhoI 6712
5000
bp
M 1 2
4000
3000
2000
1000
A
B
M ：1kbpDN A marker ；1 ：重组载体 pET32a-aldh2 Pst I 单酶切
（5 515 bp+1 359 bp）；2 ：重组载体 pET32a-aldh2 Nde I 和 Xho I
双酶切（5 369 bp+1 505 bp）
图 3 重组载体 pET32a-aldh2 构建（A）及酶切鉴定图（B）
2014年第12期 205黄娟等：人乙醛脱氢酶 2的原核表达及其活性的鉴定
示，当咪唑的浓度为 60 mmol/L 时，目的蛋白开始
被洗脱，且随着咪唑浓度的增加蛋白被大量洗脱。
将图中 6-9 号的洗脱液合并，得到粗酶液。为除去
粗酶液中的盐离子，将其在 60 mmol/L 咪唑缓冲液
中 4℃过夜透析。
97.2
66.4
kD
IPTG mmol/L 0 0.130ć0.5 1.0
44.3
0 1.0
37ć
0.5 0.1
图 4 不同诱导表达条件的电泳图
97.2
66.4
kD
0 hM 2 h
37ć1.0 mmol/L IPTG
4 h 6 h
44.3
8 h
图 5 不同诱导时间下的蛋白表达量
97.2
66.4
kD
1M 2 3 4
44.3
5 7 8 9
M ：蛋白分子量标准 ；1 ：总蛋白 ；2 ：未吸附蛋白 ；3-9 ：咪唑浓度分别为
10、20、40、60、80、100、200 mmol/L
图 6 目标蛋白在不同浓度咪唑洗脱液中的分布
1050
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
O
D
34
0
0.7
0.8
15ᰦ䰤 min 2520 30
图 7 蛋白酶活性测定
OD340 的减少值。根据活力单位 U 的定义（最适条件
下，每分钟转化 1 μmol 底物为 1 个活力单位），计算
A340 的变化约为 0.03 mim
-1，则反应体系里 ALDH2
的酶活为 10 μL 的原酶液里有 0.014 49 U，那么得到
粗酶液的酶活为 1.449 U/mL。最终得到的粗酶液为
2 mL，发酵液的总体积为 200 mL，则酶的最终得率
为 14.49 U/L，即每单位体积发酵液中活得的酶活力。
3 讨论
在大肠杆菌表达系统中，大部分表达载体采用
诱导型启动子控制目的基因的表达。诱导型启动子
能控制基因在特定时期、特定部位表达，这既避免
了目的基因在宿主细胞内高表达对宿主细胞生长的
影响，又可减少菌体蛋白酶对目标产物的降解。本
试验采用 pET32a 表达载体，在 IPTG 诱导下目的
蛋白得到大量表达。此外，表达载体上带有 6 个组
氨酸标签，有利于下游蛋白的纯化。由于目的蛋白
是以包涵体形式表达，试验对包涵体的变性，复性
和纯化做了研究，并对复性蛋白的酶活性进行鉴
定。研究结果有以下两点 ：（1）对于重组蛋白的复
性，尝试了稀释复性法、透析复性法和柱上复性法，
但结果显示透析复性法得到的乙醛脱氢酶活性要高
于其他两种方法。（2）通过酶活性检测，复性后蛋
白的活力为 1.449 U/mL，而赵锦等在酵母中表达乙
醛脱氢酶，经分离纯化后的乙醛脱氢酶液的酶活为
0.994 U/mL。本试验中发酵液总体积为 200 mL，得
到的粗酶液为 2 mL，则酶的最终得率为 14.49 U/L。
其他研究人员利用酵母表达并分离纯化了乙醛脱氢
酶，酶的最终得率仅为 11.35 U/L［19］，并且该酶的
表达量偏低［11］，可能原因是 ：（1）酵母表达的外源
蛋白在内质网中的聚集造成分泌蛋白减少［20］；（2）
2.5 重组蛋白的酶活性检测
试验对透析复性法得到的重组蛋白进行酶活性
测定。在酶活测定体系中，总反应体系为 3 mL，加
入的酶液为 10 μL，每分钟读取 1 次 A340，以 OD340
对反应时间作图（图 7）。
取 反 应 曲 线 的 5-10 min 内， 计 算 每 分 钟 内
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2014年第12期206
酵母发酵过程中培养基 pH 值的变化使得酵母蛋白
酶的活性较强，从而导致了外源蛋白的降解［21，22］。
本试验获得了较高的乙醛脱氢酶的酶活力和表达量，
所以运用基因工程表达乙醛脱氢酶，原核表达系统
要优于酵母表达。但是原核表达乙醛脱氢酶时，虽
然优化了多种表达条件（如温度，IPTG 浓度，培养
时间，振荡速度等），均无法获得可溶性的表达产物
（结果未展示），而采用变性和复性的技术手段不可
避免的导致酶活性的损失和得率的下降。更换表达
载体或者进行融合蛋白的表达，可能是解决原核表
达乙醛脱氢酶形成包涵体的有效途径之一。
参 考 文 献
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（责任编辑 李楠）