全 文 ：微生物学通报 OCT 20, 2012, 39(10): 1418−1427
Microbiology China © 2012 by Institute of Microbiology, CAS
tongbao@im.ac.cn


基金项目：国家自然科学基金项目(No. 30971875); 国家公益性行业(农业)科研专项(No. 201003067)
*通讯作者：Tel: 86-23-65120489; : zkwang646@sina.com
收稿日期：2012-01-28; 接受日期：2012-03-13
研究报告
柑橘黄龙病隐症寄主九里香内生细菌
分离及功能鉴定
殷幼平 1 李佳 1 林亚玉 1 陈世伟 2 王中康 1*
(1. 重庆大学 生命科学学院 重庆市基因功能及调控重点实验室 重庆市杀虫真菌
生物农药工程技术中心 重庆 400030)
(2. 亚洲果业广西利添柑橘生物技术公司 广西 合浦 536128)


摘 要: 【目的】分析黄龙病高发区的九里香植株叶及茎干中内生细菌, 为寻找具有抗柑
橘黄龙病的内生细菌奠定基础。【方法】利用平板培养法及基于 16S rDNA的限制性酶切
长度多态性(Restriction fragment length polymorphism, RFLP)序列分子鉴定法, 对九里香
植物内生细菌进行多样性分析。【结果】在兼性厌氧的生长环境下, 从九里香植株中分离
获得可培养内生细菌 26株, 分属于 9个细菌属的 14个种, 其中肠杆菌属(Enterobacter sp.)
(IF=19.23%)、芽胞杆菌属(Bacillus sp.) (IF=38.46%)为九里香可培养内生细菌的优势菌属。
茎干中内生细菌丰度高于叶中内生菌丰度。建立了九里香内生细菌 16S rDNA文库, 对文
库质量检测显示, 该克隆文库的覆盖度(Coverage C)为 94.97%, 结合 Rarefaction 曲线分
析, 表明所构建的克隆文库是相对充分的。对文库中 179个阳性克隆进行 Hae Ш、MspⅠ、
RsaⅠ3种限制性内切酶分析, 得到 20个不同的操作分类单元(Operational taxonomic units,
OTUs) , 其中沙雷氏菌属(Serratia sp.)为九里香植株中内生细菌的绝对优势菌属。测定了
14 株内生细菌的功能, 其中 9 株菌能产生吲哚-3-乙酸(IAA); 具有抗生素(phlD)合成能力
的内生细菌有 4株; 结合 nifH和 NFb固氮培养基确定有 3株内生细菌具有固氮能力; 1株
内生细菌具有 ACC脱氨酶合成能力; 8株内生细菌具有铁细胞合成能力; 3株内生细菌具
有淀粉水解能力; 2株内生细菌显示强阳性的蛋白酶合成能力, 4株内生细菌具有以上 4种
功能。【结论】九里香植株中内生细菌具有丰富的多样性, 并且可能对九里香植株生长发
育及抗生物和非生物胁迫有着重要的生理功能。
关键词: 九里香, 柑橘黄龙病, 功能性内生细菌, 16S rDNA-RFLP
殷幼平等: 柑橘黄龙病隐症寄主九里香内生细菌分离及功能鉴定 1419

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Isolation and characterization of endophytic bacteria from
huanglongbing’s hidden host plant- Murraya paniculata
YIN You-Ping1 LI Jia1 LIN Ya-Yu1 CHEN Shi-Wei2 WANG Zhong-Kang1*
(1. Life Science College of Chongqing University, Key Laboratory of Genetic Function and Regulation in
Chongqing, Chongqing Engineering Research Center for Fungal Insecticides, Chongqing 400030, China)
(2. Lucky Team Biotech Development (Hepu) Ltd. Co., Hepu, Guangxi 536128, China)
Abstract: [Objective] Our goal is to analyze the bacterial endophytic diversity in Murraya
paniculata, which was huanglongbing’s hidden host plant, and find the endophytic bacteria
that may have potential to suppress the HLB pathogen. [Methods] The endophytic bacteria
were isolated from surface-sterilized M. paniculata midribs of leaves and phloem of stems by
plating and restriction fragment length polymorphism (RFLP). The functions of 14 culturable
bacteria had been tested using different substrates and cultural medium. [Results] By the arti-
ficial anaerobic culture, we obtained 26 strains that were grouped into 9 genus according to
GenBank. Enterobacter sp. (IF=19.23%) and Bacillus sp. (IF=38.46%) were the dominant bac-
terial population in M. paniculata. However, the bacterial colony number of endophytic bacte-
ria in the stems was higher than in the leaves. The endophytic bacteria 16S rDNA library of M.
paniculata was established. Coverage C of the clone library was 94.97% and the rarefaction
curve of the clone library tended to plateau, which indicate that the library are large enough to
reflect the bacterial endophytic diversity of the respective samples. 179 positive clones in 16S
rRNA gene library were chosen and digested by restriction endonuclease Hae Ⅲ, MspⅠ,
RsaⅠrespectively. Twenty OTUs (Operational taxonomic units) were observed based on the
similarity of the RFLP banding profiles. In the observed clones, 63.69% of the clones were
Serratia sp., which means that the Serratia sp. was absolute preponderant endophytic bacteria
in M. paniculata. The functional analysis of the 14 endophytic bacteria showed that 9 isolates
can produce IAA and 3 of them had amylolysis activity. The frequency of endophytic bacteria
which can produce ACC deaminase, siderophore and protein activity was 1, 8 and 2 respec-
tively. Three of bacteria isolates with N-fixation ability were screened by using N-free medium
and nifH gene and 4 of endophytic bacteria cansynthesis antibiotic (phlD). A total of 4 bacte-
rial isolates was provided with four of mentioned traits. [Conclusion] The endophytic bacteria
isolated from M. paniculata have abundant diversity and genetic characterization, and they may
have important functions for the plant development, anti abio-stresses and bio-stresses.
Keywords: Murraya paniculata, Huanglongbing, Functional bacterial strains, 16S rDNA-RFLP
柑橘黄龙病(Citrus Huanglongbing, HLB)是
世界上一种严重的植物病害, 对柑橘生产造成严
重的危害。目前, 柑橘黄龙病已遍及亚洲、非洲
柑橘产区, 现正在美洲蔓延。该病害是由一种寄
生于韧皮部筛管细胞内的革兰氏阴性细菌所引
起, 属 α-变形菌纲(Alphaproteobacteria)难培养原
核微生物。根据病原 16S rDNA (16S ribosomal
DNAs, 16S rDNA)和 β-操纵子基因的序列特征,
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以及传病媒介和病原性质, 将 HLB 病菌命名为
候选韧皮杆菌属(Candidatus Liberibacter spp.)。在
中国, 目前仅有亚洲种 (Candidatus Liberibacter
asiaticus, Las)分布, 对我国柑橘产业造成极大的
威胁[1−2]。
九里香(Murraya paniculata)是一种观赏和药
用植物广泛在我国南方种植[3], 同柑橘一样, 作
为芸香科属的九里香植物也受柑橘木虱传播的
柑桔黄龙病菌侵染, 但并不产生明显的症状。有
关九里香属植物与柑橘黄龙病的关系研究起源
于我国。李韬[4]、邓崇岭[5]等分别利用 Nest-PCR
和酶切分析技术在危害九里香的柑橘木虱及九
里香中检测到了柑橘黄龙病病原, 说明九里香不
仅是柑橘木虱的寄主, 还是柑橘黄龙病病原的隐
症寄主。2007 年, Zhou 等[6]的实验证明 HLB 病原
可以在九里香体内持续生存 2 个月以上, 且九里
香长期不表现明显的柑橘黄龙病病症, 这期间
HLB 病原可以通过菟丝子从九里香上传播到甜
橙。上个世纪末, 邓秀新等[7]根据九里香抗黄龙
病、耐盐碱、抗柑桔线虫病等特性, 利用细胞融
合技术将九里香的抗黄龙病特性转移至柑桔, 其
杂交体保持了九里香的抗病性和柑桔的优良农
艺性状。Damsteegt 等[8]利用柑橘木虱传播及回接
的方法, 证明九里香属植物的 M. paniculata 与
M. exotica 可以充当柑橘黄龙病菌的短暂寄主, M.
koenigii 却不能。由此可见, 柑橘、木虱及九里香
已构成 HLB 传播的循环途径。
利用寄主抗病性防治病害是一种经济且高效
的方法, 而许多植物的抗病性与植物内生菌有
关。20 世纪 90 年代初已获得植物促生菌诱导系
统抗性的直接病原学证据[9], 但目前有关柑橘内
生菌抗柑橘黄龙病功能的研究未见相关报道。本
研究采用细菌传统培养技术与 16S rDNA 分子鉴
定法, 对九里香(M. paniculata)内生细菌进行多
样性分析及功能鉴定, 期望揭示其内生细菌与黄
龙病的作用关系; 并寻找内生细菌的功能代谢
特征, 为筛选抗黄龙病的相关菌株奠定基础。
1 材料与方法
1.1 供试植物材料
九 里 香 枝 叶 样 品 采 自 广 西 合 浦
(E108°51′N21°27′)柑橘黄龙病疫区周围, 样品采
集后塑料袋密封保存于 4 °C 备用; 所有样品在采
集后在 2−3 d 内处理。
1.2 培养基和试剂
培养基: 含 2.5 mmol/L 色氨酸的 KingB[10];
肉质胨淀粉培养基[11]; 脱脂牛奶培养基[[12]; 阿斯
毕(Ashby)无氮培养基[13−14]; CAS 琼脂培养基[15];
PYG、SMA、SM 培养基[16]。
试剂: 细菌生理生化鉴定管, 杭州天和微生
物试剂有限公司; 细菌 DNA 提取试剂盒、纯化试
剂 盒 , Axygen; Taq Plus 酶 , Sangon; E. coli
TransMAX Competent Cell, TransGen。
1.3 九里香可培养内生细菌的分离纯化与培养
样品的消毒灭菌处理: 自来水冲洗九里香叶
和枝干, 滤纸吸干材料表面的水分。先用 75%的
无水乙醇浸泡 60 s, 随即浸入 2%次氯酸钠分别
处理 30 s (叶)、3 min (枝干), 最后用无菌水冲洗
5−6 次。收集最后一次冲洗液 100 μL 在 1% LB
培养基上涂布, 28 °C 培养过夜, 检验表面消毒是
否完全。
内生菌的分离纯化: 超净工作台中, 叶片取
中脉, 枝条去除表皮取韧皮部, 切成 0.2 cm 长左
右的条段; 各材料(g)与水(mL)比例为 1:2, 加入
无菌水浸泡 2−3 h; 取浸泡液 10 μL, 按 10 倍梯度
稀释至 10−3, 取 100 μL 菌悬液, 分别涂布在 1%
TSA 和 1% LB 半固体培养基上每个梯度均设 3
个重复, 于 28 °C 细菌培养箱中培养 2−6 d。
根据菌落的颜色及形态, 将不同菌种在平板
上划线纯化, 直到得到该菌株的单菌落。4 °C 冰
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箱保存; 同时用 15%甘油保存菌株, 于−80°C 超
低温冰箱中保存, 备用。
1.4 九里香可培养内生细菌革兰氏染色鉴定
及生理生化鉴定
根据《常见细菌系统鉴定手册》[11]和《伯杰
氏细菌鉴定手册》第 9 版[17], 采用快速革兰氏染
色液试剂盒和生理生化鉴定管对分离得到的菌
株进行形态和生理生化测定。
根据可数性原则, 对培养基表面长出的微生
物菌落进行计数, 统计九里香不同植株部位菌落
的相对丰富度: 内生细菌菌落丰富度(CFU/g 鲜
重)=平板菌落数×稀释倍数×102。
1.5 九里香可培养内生细菌分子种属鉴定
试剂盒提取细菌总 DNA, 利用细菌通用引物
27f/1492r (5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′/
5′-TACGGTTACCTTGTTACGACTT-3′)[18]进行扩
增。PCR 反应体系为 50 μL, 反应条件为: 95 °C
5 min; 95 °C 30 s, 56 °C 30 s, 72 °C 100 s, 共 30 个
循环; 72 °C 7 min。PCR 产物用 1%琼脂糖凝胶电
泳检测, 扩增片段长度约为 1.5 kb。
将经 PCR 扩增出的基因片段用凝胶纯化试
剂盒纯化后与 pMD19-T 载体连接, 转入大肠杆
菌 JM109 感受态细胞中。筛选阳性转化子并送深
圳华大基因测序。测序结果 BLAST 比对, 结合形
态及生理生化特征判定种类。
1.6 九里香内生细菌的 PCR-RFLP分析
1.6.1 九里香内生细菌 16S rDNA扩增及克隆文
库的构建: 取经表面消毒过的九里香叶片中脉和
枝干韧皮部, 液氮研磨成粉, 利用细菌基因组提
取试剂盒提取细菌基因组 DNA。为避免植物叶绿
体 16S rDNA 的影响, 本研究选用细菌通用引物
799f/1492r (5′-AACMGGATTAGATACCCKG-3′/
5′-GGCTACCTTGTTACGACTT-3′)[19] 扩 增 16S
rDNA 的 V5-V9 这 5 个高变区域。PCR 反应体系
为 50 μL, 反应条件为: 94 °C 4 min; 94 °C 30 s,
56 °C 30 s, 72 °C 1 min, 共 30 个循环; 72 °C
10 min。PCR 产物于 1.5%琼脂糖凝胶上进行电泳
检测, 目的片段约为 730 bp。利用凝胶纯化试剂
盒纯化回收目的片段, 与载体 pMD19-T 连接, 转
入 E. coli TransMAX 高效感受态细胞中。随机挑
取克隆子进行 PCR 检测。
1.6.2 九里香内生细菌 RFLP分析: 提取阳性克
隆子质粒, 利用 Hae Ⅲ、MspⅠ、RsaⅠ 3 种限制
性内切酶分别对质粒进行限制性片段长度多态
性分析(RFLP)。37 °C 恒温培养箱中酶切 4 h, 用
2.0%琼脂糖凝胶, 130 V 电压下电泳 40 min, 记录
酶切图谱类型。
1.7 九里香可培养内生细菌功能鉴定
利用 KingB 液体培养基测定吲哚-3-乙酸
(IAA)的合成[10]; 通过对 phlD 基因的扩增测定菌
株合成抗生素的能力[20]; 利用 Ashby 无氮培养基
及 nifH 基因测定菌株的固氮能力[13−14]; 以 1-氨基
环丙烷-1-羧酸(ACC)为氮源, 测定菌株的 ACC-
脱氨酶合成能力[16]; 利用 CAS-agar 培养基测定
菌株的铁载体合成能力[15]; 利用肉质胨淀粉培养
基[11]及脱脂牛奶培养基[12]分别测定菌株的淀粉
水解及蛋白酶合成能力。
1.8 数据分析
1.8.1 16S rDNA 克隆文库的评价 : 利 用
Coverage C 评价克隆文库的覆盖度, 覆盖度以
16S rDNA 克 隆 文 库 中 所 包 含 的 微 生 物 种 类
(Operational Taxonomic Units, OTUs)占样品中全
部微生物种类的比例表示, 其计算公式如下[21]:
C=(1−n1/N)×100%; N 表示克隆文库中克隆子的数
目; n1 表示在克隆文库中该克隆子所代表的 OUT
仅出现过一次的数量。同时采用 Analytic Rare-
faction 1.3 软件进行 Rarefaction Curve 分析, 检测
16S rDNA 克隆文库的完整性。
1.8.2 序列分析与系统进化树的构建: 在 NCBI
数据库中, 搜索与 16S rDNA 序列相似的序列,
进行序列比对。利用 ClustalX 和 MEGA 4.0 软件
估算序列间遗传距离, 采用 N-J (Neighbor-Joining)
1422 微生物学通报 2012, Vol.39, No.10

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法构建系统进化树, 分析所测序列与其相似序列
的遗传进化关系。
2 结果
2.1 九里香可培养内生细菌的分离鉴定
经 48 次分离培养, 共获得 26 株形态不同的
菌株, 经生理生化及 16S rDNA-PCR 鉴定, 分属于
9 个种属(表 1), 其中革兰氏阳性菌(14 株)多于革
兰氏阴性菌(12 株), 菌落丰富度在 1.64×105−
1.76×106 CFU/g 鲜重, 且 1% LB 与 1% TSA 2 种
半固体培养基上, 植株不同部位中的内生细菌数
量有显著差异, 但菌落形态并没有明显的差异
(表 2)。其中肠杆菌(IF=19.23%)、芽胞杆菌属
(IF=38.46%)为九里香内生细菌的优势菌属。
26 株内生细菌属于 5 个不同的类群, 低 G+C
革兰氏阳性菌(Firmicutes)为主要类群, 占内生细
菌总数的 50%, 其次为变形菌门(Proteobacteria),
包括 α、γ 2 个类型, 分别占 7.7%、30.77%; 拟杆
细 菌 (Bacteroidetes) 占 7.7%; 放 线 细 菌
(Actinobacteria)占 3.85% (表 1)。

表 1 九里香内生优势菌群序列比对结果
Table 1 Sequences alinment of 16S rRNA gene in endophytic bacterial from M. paniculata
分类
Group
菌株代码
Strain
code
菌株登录号
Accession
No.
长度
Length
(bp)
分离频率
IF
(%)
比对相关序列
Closest match in NCBI
同源性
Identity
(%)
Bacteroidetes HPMp 02 JN020662 1 349 7.69 Chryseobacterium sp. (EF565935.1) 100
Firmicutes HPMp 03 JN020663 1 371 7.69 Staphylococcus sp. B3RO05 (HQ015739.1) 100
HPMp 04 JN020664 1 522 3.85 Bacillus subtilis strain (FJ876834.1) 97
HPMp 05 JN020666 1 522 3.85 Bacillus sp. TBD1-3 (HQ236073.1) 99
HPMp 06 JN020665 1 419 15.38 Bacillus megaterium strain P41 (HQ423382.1) 97
HPMp 07 JN020667 1 523 7.69 Bacillus cereus B4264 (CP001176.1) 99
HPMp 08 JN020668 1 424 7.69 Bacillus pumilus strain AU MB (HQ122449.1) 100
HPMp 09 JN020669 1 391 3.85 Paenibacillus sp. (HQ222349.1) 100
γ-Proteobacteria HPMp 01 JN020661 1 404 19.23 Enterobacter sp. (GU726864.1) 99
HPMp 11 JN020671 1 259 3.85 Pseudomonas sp. Acj 106 gene (AB480754.1) 100
HPMp 13 JN020673 1 346 7.69 Stenotrophomonas sp. (FM992758.1) 99
α-Proteobacteria HPMp 10 JN020670 1 261 3.85 Brevundimonas sp. NCCP-147 gene (AB549434.1) 99
HPMp 14 JN020674 1 285 3.85 Sphingomonas sp. (DQ207361.1) 99
Actinobacteria HPMp 12 JN020672 1 372 3.85 Curtobacterium sp. Fek209 (EU741030.1) 97
注: HP: 合浦, 广西; Mp: 九里香; 分离频率(IF) =分离菌株数目/菌株总数.
Note: HP: HePu, GuangXi; Mp: Murraya paniculata; Isolate frequency (IF) = Isolated number of strain / total isolated number of strains.

表 2 九里香内生细菌分布情况
Table 2 Endophytic bacterial population in M. paniculata
1% LB medium 1% TSA medium
寄主
Host Plant
Stem Leaf Stem Leaf
内生细菌菌落丰富度
Bacterial colony number (CFU/g)
1.76×106b 1.96×105a 1.44×106b 1.64×105a
内生细菌种类
Species of entophytic bacteria
7 11 6 11
注: 1% LB: 1%溶菌肉汤培养基; 1% TSA: 1%胰蛋白胨大豆培养基; P<0.05.
Note: 1% LB: 1% Luria bertani; 1% TSA: 1% Tryptic soy agar; P< 0.05.
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2.2 九里香内生细菌的 PCR-RFLP分析
2.2.1 16S rDNA 克隆文库的充分性分析: 随机
挑取克隆子 226 个, PCR 检测有 179 个属阳性克
隆子。利用 Analytic Rarefaction 1.3 软件进行
Rarefaction Curve 分析(图 1), 当克隆子数为 179
个时, 检测到微生物种群数目增加几率已显著降
低; Coverage C 计算得出: 该 16S rDNA 克隆文库
中所包含的微生物种类(OTUs)占样品中全部微
生物种类的 94.97%。说明所构建的克隆文库是
相对充分的, 可以反映样品中微生物的种类和
组成。
2.2.2 16S rDNA克隆文库的 RFLP分析: 提取
179 个阳性克隆的质粒, 分别用 Hae Ⅲ、MspⅠ、
RsaⅠ 3 种限制性内切酶进行 RFLP 分析, 根据图
2 的电泳条带, 分别得到 9 条不同的酶切图谱。
培养内生细菌最优势菌属。
27 条酶切图谱组合, 每一个不同组合称为一
个操作分类单元(OUT)。本研究分析共得 20 个正
确的 OTUs (表 3)。179 个阳性克隆中, 不可培养
菌占 29.67%; U01、U05 所代表的菌属为优势菌
属, 分别占总量的 37.36%和 24.78%, 表明九里香
植株体内存在大量的沙雷氏菌属及难培养菌。
采用 N-J 法对得到的 20 个不同的 OTUs 构建
系统进化树, 进行遗传进化研究。经系统发育分
析知, 20 个 OTUs 可分为 4 个不同的类群。其中
变形菌门(Proteobacteria)为主要类群, 包括 α、β
和 γ 3 个类型, 分别占 3.35%、3.91%和 65.36%。
未知细菌(Uncultured bacteria)占 26.81%, 分属于
各个不同的分类地位(图 3)。
2.3 九里香可培养内生细菌功能鉴定结果
分离自九里香的 14 株内生细菌进行的生理功
能测定结果显示(表 4), 14 株菌株中有 9 株(64.3%)
能产生吲哚-3-乙酸(IAA); 具有抗生素(phlD)合
成能力的内生细菌有 4 株; 结合 nifH 和 NFb 固氮
培养基确定有 3 株内生细菌具有固氮能力; 1 株内
生细菌具有 ACC 脱氨酶合成能力; 8 株内生细菌
具有铁细胞合成能力, 在 CAS 培养基上产生橙色
晕圈; 3 株内生细菌具有淀粉水解能力; 2 株内生
细菌显示强阳性的蛋白酶合成能力。至少具备 4
个功能的菌株为: Bacillus megaterium (HPMp

图 1 九里香16S rDNA克隆文库的Rarefaction 分析
曲线
Fig. 1 Rarefaction curve of endophytic bacterial
16S rDNA clone library of M. paniculata


图 2 九里香 16S rDNA克隆文库的 Hae Ⅲ、MspⅠ、RsaⅠ酶切图谱 (部分)
Fig. 2 Restriction patterns of 16S rDNA clone library with Hae Ⅲ、MspⅠ、RsaⅠ(part of the experiment)
1424 微生物学通报 2012, Vol.39, No.10

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表 3 16S rDNA-RFLP分析鉴定结果
Table 3 Results of RFLP analyses for 16S rDNA in M. paniculata
分类
Groups
分类
单元
OTUs
登录号
Accession
No.
克隆
子数
Num-
ber of
clones
所占
比例
Total
clones
%
NCBI 中相似的序列
Closet NCBI match
同源性
Identity
(%)
U01 JN020675 68 37.99 Serratia sp. JG05 (EU798943.1) 99
U05 JN020680 45 25.14 Serratia nematodiphila strain P36 (FJ662869.1) 100
γ-Proteobacteria
65.36%
U12 JN020683 2 1.12 Xanthomonas sp. TE9 (GQ381284.1) 100
(待续)
(续表 3)
U13 JN020684 1 0.56 Stenotrophomonas sp. p22(2011) (HQ652605.1) 99
U15 JN020686 1 0.56 Serratia sp. JG05 (EU798943.1) 99
U04 JN020679 2 1.12 Brevundimonas terrae strain RCPS-6 (HM172503.1) 100
U08 JN020694 2 1.12 Uncultured alpha proteobacterium clone (FJ517741.1) 99
α-Proteobacteria
3.35%
U19 JN020691 2 1.12 Sphingomonas sp. DC2a-27 (AB552856.1) 99
U09 JN020676 1 0.56 Uncultured beta proteobacterium clone D8W_30
(HM057713.1)
99 β-Proteobacteria
3.91%
U10 JN020681 1 0.56 Achromobacter xylosoxidans strain M66 (HQ676601.1) 99
U11 JN020682 3 1.68 Uncultured Achromobacter sp. clone CHINA46
(GU563751.1)
99
U16 JN020688 1 0.56 Achromobacter xylosoxidans strain M66 (HQ676601.1) 100
U17 JN020689 1 0.56 Uncultured beta proteobacterium clone D8W_30
(HM057713.1)
99
U02 JN020677 1 0.56 Uncultured Kordia sp.(FJ387769.1) 99
U03 JN020678 34 19.0 Uncultured bacterium clone FPURT1-H0(GU166632.1) 97
Uncultured
bacteria
26.81%
U06 JN020685 7 3.91 Uncultured bacterium clone CHINA11 (GU563744.1) 98
U07 JN020687 1 0.56 Uncultured bacterium clone C08 (HM060207.1) 99
U14 JN020692 1 0.56 Uncultured bacterium clone JSC7-1 (DQ532202.1) 99
U18 JN020690 3 1.68 Uncultured bacterium clone yf4clone56 (HQ610742.1) 99
U20 JN020693 2 1.12 Uncultured bacterium clone B24 (GQ422766.1) 99

06)、Bacillus pumilus (HPMp 08)、Paenibacillus sp.
(HPMp 09)和 Sphingomonas sp. (HPMp 14)。
3 讨论
本研究中所用的 2 种半固体培养基(1% LB
与 1% TSA)对九里香内生细菌的分离能力没有显
著差异。但植株不同部位的内生细菌菌落丰富度
存在显著差异, 枝干中的菌落丰富度高于叶片
内; 9 个属的可培养内生细菌中的革兰氏阳性菌
与阴性菌数目几乎相同, 根据遗传进化关系, 可
分为 5 个不同的类群, 各类群在九里香植株中的
丰度差异较大, 说明九里香植株中的内生细菌不
仅种类丰富且含量也各不相同。其中包括常见的
内生细菌 , 如 Bacillus sp.、Enterobacter sp.、
Paenibacillus sp.等; 也分离到了 Sphingomonas sp.
和 Curtobacterium sp. 两个不常见的植物内生细菌。
殷幼平等: 柑橘黄龙病隐症寄主九里香内生细菌分离及功能鉴定 1425

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图 3 基于 16S rDNA序列的九里香内生细菌系统进化树
Fig. 3 Phylogenetic tree of M. paniculata based on the 16S rDNA sequences
Note: Sequences were obtained from GenBank, and the accession numbers are in parentheses. The nodes are supported by 1,000
bootstrap replications. Bootstrap values above 50% and the genetic distance scale are shown.

表 4 九里香内生细菌功能分析
Table 4 The functional analysis of endophytic bacteria isolated from M. paniculata
菌株
Strains
Production
of IAA phlD nifH N-fixation
ACC
deaminase Siderophore
Amylolysis
activity
Protein
activity
HPMp 01 + − − − − + − −
HPMp 02 − + − − − + + −
HPMp 03 + − − − − + − −
HPMp 04 + + − − − + − −
HPMp 05 − + − − − − − −
HPMp 06 + + + − − + − −
HPMp 07 + − − − − + − +
HPMp 08 + − + − − − + +
HPMp 09 + − + + − + + −
HPMp 10 − − − + − + − −
HPMp 11 + − + − − − + −
HPMp 12 − − + − − − − −
HPMp 13 − − + + − − − −
HPMp 14 + − + + + − − −
注: +: 阳性; −: 阴性.
Note: +: Positive; −: Negative.
1426 微生物学通报 2012, Vol.39, No.10

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RFLP 分析中, 20 个 OTUs 中, γ-Proteobacteria
类群的比例为 65.36%, Araújo 等[22]曾提到处于
热带和温带地域的植物内生细菌, 比例最大的
类 群 为 γ-Proteobacteria, Xanthomonas sp. 、
Enterobacter sp.等在这类环境中分布广泛, 本研
究的分析结果与此结论一致。Gyaneshwar 等[23]曾
报道植物体内存在大量的沙雷氏菌属, P. Trivedi
等[20]发现普成沙雷氏菌(Serratia plymutica)具有
明显减少柑橘黄龙病菌的含量的作用。九里香体
内 Serratia sp.为绝对优势菌属, 其是否对柑桔黄
龙病菌有抑制作用还有待进一步研究。
本研究对文库中 179 个克隆进行的测序结果
显示, 随着克隆子数目的增加, Rarefaction 曲线
仍是在缓慢地增加, 说明该克隆文库并不是完整
的, 只是相对充分的。其原因可能由于 PCR 的偏
好性、不同基因 DNA 的拷贝数不同且在克隆过
程中也存偏好性等原因所致[24]。
另外, 对九里香内生细菌的测序分析和系统
进化分析可以看出, 九里香植株内含有大量的未
知细菌, 他们分别隶属于不同分类阶元, 表明九
里香植株中含有大量的尚不被人们所知的细菌,
可能这些不可培养细菌正是柑橘黄龙病菌能在
九里香上生存但不能大量增殖的原因, 值得我们
深入研究。
内生菌生活于植物体内, 与植物协同进化。
目前, 内生细菌对宿主植物的影响, 如促进植物
生长、营养吸收、抑制植物病原菌、抗生素产生
及抗击外界压力等作用, 是植物内生菌研究的热
点。内生细菌的吲哚-3-乙酸(IAA)合成能力、抗
生素合成能力、固氮能力、ACC-脱氨酶合成能力、
铁载体合成能力和淀粉水解及蛋白酶合成能力
是衡量内生细菌对宿主植物作用机制的标准。
P. Trivedi 等[25]已证实柑橘根部中的 Paenibacillus
sp.对柑橘黄龙病菌的生长具有抑制作用。本研究
筛选得到 Bacillus megaterium、Bacillus pumilus、
Paenibacillus sp.和 Sphingomonas sp. 4 株功能性
植物内生细菌, 它们的共同特点是都能产生吲
哚-3-乙酸(IAA), 但其与柑橘黄龙病菌之间的关
系还有待进一步研究。
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