全 文 ：第 23卷第 5期 西　南　农　业　大　学　学　报 Vol.23 ,No.5
2001年 10月 Journal of Southwest Agricultural University Oct.2001
文章编号:1000-2642(2001)05-0435-03
香橙和枳的三价铁螯合还原酶诱导研究
李　凌 ,范艳华 ,罗小英 ,周泽扬 ,裴　炎
(西南农业大学 生物技术中心 ,重庆 , 400716)
摘要:三价铁螯合还原酶是植物吸收铁过程中非常重要的酶。在田间表现耐缺铁的香橙在缺铁胁迫下 , 三价铁螯合
还原酶活性在胁迫 4周时即达到最强 , 增加约 20 倍;而在田间表现极易缺铁的枳在铁胁迫 4 周时 , 三价铁螯合还原酶
活性仅增加约 3倍。香橙根系在铁胁迫前后分泌质子的能力均显著强于枳。表明三价铁螯合还原酶对香橙忍耐缺铁
起着非常重要的作用 ,并且香橙具有很强的调节微根际环境 pH 的能力。
关　键　词:香橙;枳;三价铁螯合还原酶;缺铁胁迫;H+分泌
中图分类号:S 666.4;Q 945.12　　　　　　文献标识码:A
STUDY ON FERRIC CHELATE REDUCTASE OF
CITRUS JUNOS AND PONCIRUS TRIFOLIATA
LI Ling , FAN Yan-hua , LUO Xiao-ying , ZHOU Ze-yang , PEI Yan
(Biotechnology Research Center , Southwest Agricultural University , Chongqing 400716 , China)
Abstract:It has been hypothesized that under iron stress high ferric chelate reductase(FCR)activity of iron efficient plants in the absorptive root
will be induced and thus result in subsequent Fe2+ transport across the plasmalemma.The activity of FCR was detectable in excised roots and was
stimulated about 20-fold in C.junos and only about 3-fold in P.trifoliate under iron deficiency on the 4 th week.The capacity of root H+ se-
creting in C.junos is more stronger than P .trifoliate under iron stress or no stress.The results showed that FCR play a important role on tolerance
to iron stress in C.junos , and C.juno can adjust soil microenviroment pH of roots.
Key words:C.junos;P.trifoliate;ferric chelate reductase;iron stress;H+ secrete
　　在石灰性土壤上 ,植物的缺铁黄化是一个普遍发
生的问题[ 1 ,2] ,而多年生果树的缺铁黄化在全球不仅
是一个发生范围很广的常见营养障碍 ,而且是一个非
常难矫治的问题[ 3 ,4 ,5] ,其原因是植物只能吸收二价
铁 ,而此类土壤中的铁往往以稳定的三价氧化物形式
存在 ,不能被植物吸收利用。但也有很多植物包括果
树对这种铁胁迫环境表现出较强的忍耐性。研究发
现除禾本科植物外 ,双子叶植物 、单子叶植物 、非禾本
科草本植物的根系在铁胁迫下会诱导产生三价铁还
原能力[ 4～ 6] ,不同的类型之间还原能力不同 ,如香橙
在田间表现就比枳耐缺铁。人们推测在植物根部存
在三价铁螯合还原酶 。1999年英国的 N.J.Robinson
首次从拟南芥中克隆了三价铁螯合还原酶基因家族 ,
从分子水平上确认了三价铁螯合还原酶的存在[ 7 , 8] 。
该试验选用香橙和枳作为试材 ,研究在缺铁胁迫下这
两种材料的三价铁螯合还原酶诱导情况 ,为从香橙中
克隆该酶基因奠定基础。
1　材料与方法
1.1　种子的萌发和幼苗的培养
香橙和枳种子来自西南农大研究院。种子播于
繱收稿日期:2001-08-05基金项目:科技部转基因与产业化专项课题资助(Joo-A-008-07)作者简介:李凌(1964-), 女 ,山东长清人 ,西南农业大学副教授 ,博士生 ,从事植物生理及分子生物学研究。
DOI :10.13718/j.cnki.xdzk.2001.05.016
营养钵 ,置 HPG-280 H 人工培养箱中 , 温度为昼/
夜:16℃/22℃, 相对湿度 60%～ 70%, 光照强度
4000 Lx , 昼/夜时间12 h/12 h。种子萌芽后长至3片
真叶时选取生长一致的幼苗开始水培 。蒸馏水培养
3天后 ,加入半量 Hoagland营养液培养 1周 ,再用全
量Hoagland溶液培养 2周后开始缺铁处理。人工通
气 ,每天 4 h。人工光照 12 h ,光照强度 4000 Lx 。
1.2　根三价铁螯合还原酶活性的测定
测定液的成分为:0.1 mM Fe(Ⅲ)EDTA ,0.3 mM
BPDS ,0.5 mM CaSO4 , 5 mM Mes(pH 5.5),每只 10 ml
离心管中测定液 4 ml。将水培的不同时期的新根剪
下 ,长度约 2 cm ,投入盛有测定液的离心管中 ,立即
将离心管置摇床上 , 25℃, 100 rpm/min , 黑暗中 3 h。
然后用 Shimadz分光光度计测定 530 nm处的 OD值 ,
以不加根为对照 。根据郎伯比尔定律求出酶活力[ 4] 。
C [ nmol/g(FW)·min] =OD/g·ε·t·b ·v
OD:吸光度;ε:BPDS的摩尔吸光系数;t :反应
时间;b:吸收池的宽度;v:反应液的体积;g:根的鲜
重。
1.3　根质子分泌的琼脂包埋测定
1 %琼脂 ,13.6 mg CaSO4 , 6 mg 溴甲酚紫 ,加热
溶解 ,调 pH 至6.2(暗红色)。冷至 50℃时 ,将根平贴
在培养皿底部 ,将琼脂倒在平皿上 ,室温暗处放置 30
min-3 h[ 6] , 观察记录指示剂的颜色变化。
2　结果与分析
2.1　不同缺铁处理对酶活力的影响特点
在培养液中分别施加 80 μM Fe(Ⅲ)EDTA 和 80
μM Fe(Ⅱ)EDTA ,以不加铁为对照
图 1　不同处理下香橙和枳的离体根三价铁还原酶活性
◆香橙　　□枳
1:CK ,加入 80μM Fe(Ⅱ)EDTA;2:加入 80μM Fe(Ⅲ)EDTA;3:完全
缺铁处理。
从图 1中可见 ,香橙在缺铁胁迫 4 周时 ,在三价
铁的环境下 ,还原酶活性被诱导增强约 10倍 ,在完全
缺铁胁迫下 ,还原酶活性被诱导增强约 20 倍。而枳
在有三价铁存在的情况下 ,还原酶活性被诱导增加不
足 1倍 ,在完全缺铁环境下 ,还原酶活性被诱导增强
也仅约 3倍 ,远远低于香橙。推测在有三价铁存在的
情况下 ,香橙的还原酶活性被诱导增强 ,三价铁可以
被还原成二价铁以供香橙吸收利用 ,被还原出的一定
量的二价铁可以缓解环境中铁的缺乏 ,还原酶的活性
便不再升高。在完全缺铁的环境下 ,还原酶活性增
强 ,但由于一直没有铁源供应 ,植物一直受到缺铁信
号的诱导 ,酶活性保持增加 ,直到饱和为止。估计香
橙在缺铁胁迫下三价铁还原酶活性增强到正常条件
下的 20倍左右即达到饱和 ,而枳只增加约 3倍便达
到饱和 。
2.2　酶活力的时间变化曲线
缺铁处理从 2001-3-12开始 ,酶活力测定也从
3月 12日开始 。每周测定一次。测定结果见图 2:
图 2　香橙和枳的三价铁还原酶活性的时间变化柱形图
◆香橙　　□枳
1:12/ 3;2:30/ 3;3:6/ 4;4:10/ 4;5:16/ 4。
从图 2可见 ,香橙根系三价铁还原酶活性在缺铁
4周时便达到最强 ,约为对照的 20倍 ,此后便一直维
持一个较高的水平。而枳的根系酶活性水平在缺铁
4周时仅为对照的3倍左右 ,此后亦一直没有较大的
增加。这个结果可以部分解释两种砧木耐缺铁能力
的差异 。亦即在缺铁胁迫下 ,香橙根系的三价铁还原
酶活性被诱导强烈增加 ,可以将根际土壤环境中的不
溶性三价铁还原成可供植物吸收利用的二价铁形式 ,
从而使香橙可以耐受缺铁环境 。枳在缺铁胁迫下 ,根
系的三价铁还原酶活性增加很小 ,无法使根际土壤中
大量的不溶性三价铁被还原成可供植物吸收利用的
二价铁形式 ,从而表现出对缺铁环境极为敏感 ,很易
出现缺铁黄化现象。
2.3　根系的质子分泌特点
在缺铁胁迫前 ,香橙幼根在 30 min内即可将根
际 3 mm ～ 5 mm范围的 pH从 6.2左右(暗红色)降为
5.2左右(黄色)。枳仅在根尖及以下约 1 mm ～ 2 mm
范围内有非常微弱的黄色 。胁迫4周和 8周时 ,香橙
的根的分泌能力依然非常明显 ,但仅限于新根 ,老根
已无此能力 ,枳依然在新根尖附近仅见微弱的黄色 。
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香橙在胁迫前后的根系质子分泌显著强于枳 ,而且香
橙的质子分泌能力在胁迫前后一直很强 ,似乎没有太
大的变化 。
机理Ⅱ的植物在缺铁胁迫下根系的三价铁还原
活性增强 ,但研究发现 ,环境 pH 升高后 ,这种三价铁
还原活性会降低 。这也证明植物根对三价铁的还原
是一种典型的酶促反应[ 9～ 12] 。香橙不仅具有很强的
三价铁螯合还原酶活性 ,而且具有很强的根系质子分
泌能力 ,这种很强的质子分泌能力表明香橙具有很强
的调节控制微根际环境 pH 的能力 ,从而保证在胁迫
下被诱导增强的三价铁螯合还原酶活性不致因微根
际环境的高 pH而失活 。
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(上接第 434页)
率高于金花梨。
3.4　POD 和 PPO 同工酶酶带多少与褐变的关系不
同品种表现不一致 。苍溪梨茎尖和芽在褐变较低的
月份 POD , PPO同工酶只有稳定的 4带(P 3 ～ P 6 和
PP 3 ～ PP 6), 褐变率高的月份有新带出现;金花梨茎
尖和芽组培褐变率与其同工酶酶带多少无明显的相
关性 , 其原因还有待进一步探明 。
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