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赤小豆萌芽最佳抗敏天数
及相关活性物质研究
李 丽，任晗堃，董银卯* ，宋丽雅，张小慧，刘 畅
(北京市植物资源重点实验室，北京工商大学，北京 100048)
收稿日期:2014－06－16
作者简介:李丽(1980－) ，女，博士，讲师，研究方向:化妆品功效添加剂与配方工艺。
* 通讯作者:董银卯(1963－) ，男，博士，教授，研究方向:化妆品科学与技术。
基金项目:北京市优秀人才培养资助 D类(2012D005003000006)。
摘 要:通过透明质酸酶体外抑制实验测定不同萌芽天数(0～6d)赤小豆抗敏活性，同时测定不同萌芽天数(0～6d)赤
小豆中总皂苷、总多酚及总多糖含量，并与透明质酸酶抑制活性进行相关性分析。结果表明:赤小豆萌芽第 4d 抗敏效
果最佳，各成分在萌芽过程中的变化不同，结合萌芽过程中多酚、多糖和皂苷类成分总含量的变化，确定多酚类物质是
赤小豆萌芽中的主要抗敏活性物质。
关键词:赤小豆，萌芽，抗敏，活性成分
Study on the best sprouting day with anti－allergic activity
of red beans and related active substances
LI Li，ＲEN Han－kun，DONG Yin－mao* ，SONG Li－ya，ZHANG Xiao－hui，LIU Chang
(Beijing Key Laboratory of Plant Ｒesources Ｒesearch and Development，
Beijing Technology and Business University，Beijing 100048，China)
Abstract:The anti－ allergic activity of 0～6d of rice bean sprouts was determined by the hyaluronic acid enzyme
inhibition experiment in vitro. The contents of total saponins，total polyphenols，and total polysaccharides in the
sprouting process(0～6d)were also tested.The correlation between the active substances and anti－allergic activity
was analyzed in the same time.The results showed that the 4 th day of the rice bean sprouts had the highest anti－
allergic activity.Different types of components showed different changes in the sprouting process.The results of
correlation analysis showed that polyphenols were the active substances with anti－allergic activity.
Key words:rice bean;sprouts;anti－allergic;active substances
中图分类号:TS201.4 文献标识码:A 文 章 编 号:1002－0306(2015)09－0335－05
doi:10． 13386 / j． issn1002 － 0306． 2015． 09． 064
赤小豆(Vigna umbellata) ，别名红小豆，先载于
《神农本草经》。其与赤豆(P.angularis)的外形和习
性都很相似，不易区分，但赤小豆种子呈圆柱形而稍
扁，两端较平，长 5～8mm，表面暗红色或紫红色，平滑
微有光泽［1］。赤小豆在我国资源分布广泛，主产于我
国浙江、江西、湖南、广东、广西等南部各省［2］。自古
以来，因其良好的清热利湿、解表散邪功效，在治疗
水肿、脚气、黄疸、泻痢、便血、痈肿等症时，发挥重要
作用［3］，现代药理学研究表明，其具有增强免疫力、降
血糖、保肝及抗肿瘤的作用［4－9］。
国内外已有研究证明大豆、绿豆、赤豆、荞麦等
多种谷物具有重要的抗敏功效，为抗敏食品的重要
来源。红小豆乙醇提取物乙酸乙酯萃取部位可以完
全抑制 LPS 诱导的 ＲAW 264.7 细胞 NO 产生，iNOS
和 COX－2 表达，TNF－α和 IL－6 的释放，并通过下调
EＲK /p38－和 NF－κB 介导的信号传导途径发挥抗敏
活性，其发挥抗敏活性的主要物质为儿茶素 7－O－β
－D－葡萄糖苷为主的多酚类成分［14］。种子萌芽是天
然的激发过程，随着萌芽过程酶活性提高，活性物质
增加，新陈代谢水平提高，使得包括多酚在内的次级
代谢产物大量生成，从而提高植物本身的药理活性。
赤小豆中主要含有酚类、五环三萜、皂苷、黄酮、
鞣质等活性成分，但目前尚未有研究赤小豆萌芽过
程中抗敏活性变化及相关成分分析的报道，本文通
过透明质酸酶抑制实验筛选赤小豆具有最佳抗敏活
性的萌芽天数，通过对萌芽过程中总皂苷、总多酚及
总多糖含量变化的测定及与抗敏活性的相关性分
析，总结赤小豆萌芽中发挥抗敏活性的主要成分。
1 材料与方法
1.1 材料与仪器
336
表 1 透明质酸酶实验步骤
Table 1 The steps of hyaluronidase experiment
实验步骤 添加试剂 A组 B组 C组 D组
37℃，水浴 20min
0.1mLCaCl2(保护剂) + + + +
0.5mL透明质酸酶(催化) + － + －
37℃，水浴 20min 0.5mL样品(抑制剂) － － + +
37℃，水浴 30min 0.5mL透明质酸钠(底物) + + + +
冰水冷却 8min 0.1mL NaOH(终止反应) + + + +
100℃保温 30min，冰水冷却 8min 0.5mL乙酰丙酮(生色剂) + + + +
常温放置 20min 1.0mL埃尔利希(显色剂) + + + +
点板，200μL，最大吸收波长 555nm进行测定
注:“+”为此项添加，“－”为此项不添加。
赤小豆(种子) 购于北京市永辉超市，原产地
吉林;透明质酸酶 Sigma 公司;透明质酸钠
(Solarbio)及乙酰丙酮、没食子酸、葡萄糖、齐墩果酸、
香草醛、甘草酸二钾对照品 均为国药集团化学试
剂有限公司;浓硫酸、乙醇、甲醇、苯酚、高氯酸、冰醋
酸 北京化工厂;盐酸 北京北化精细化学品有限
责任公司;碳酸钠 西陇化工股份有限公司;Folin－
Ciocalteu试剂 北京索莱宝科技有限公司上述试剂
均为分析纯。
CQ－250 超声波清洗器 上海超声波仪器厂;
JA5003 电子天平 上海精密科学仪器有限公司;酶
标仪 Thermo Science;HH·S21 － 8 电热恒温水浴
锅 北京长安科学仪器厂;SIGMA 4K15 离心机 北
京博劢行仪器有限公司;GX－04 粉碎机 上海高翔
食品机械厂;DS63295，DU34526 移液枪 北京
DＲAGON LAB。
1.2 实验方法
1.2.1 萌芽样品的制备 选籽粒饱满、无虫蛀、无霉
烂、无残破的赤小豆，每 10g 赤小豆种子为 1 个实验
组，进行萌芽，重复 3 次，按照最佳抗敏萌芽工艺萌
芽 0～6d，每天取出 1 个实验组赤小豆芽于干燥箱，
50℃干燥 24h，取出后，粉碎机粉碎，过 80 目筛，装入
塑封袋，4℃保存待用。后续实验均采用该方法进行
萌芽材料制备。
1.2.2 透明质酸酶抑制实验 精密称取赤小豆粉末
1.0g，分别加入 75% 甲醇 10mL，室温下超声提取
30min，功率为 100W。离心后，取上清液用缓冲液稀
释后待下一步实验用。根据 Elson－Morgan 法［10］，对
样品进行抗敏活性的测定，每个样品三组平行，1%
甘草酸二钾作为阳性对照。具体实验步骤如表 1
所示。
透明质酸酶抑制率(%)= (A － B)－(C － D)
(A － B)
× 100
式中:A－对照溶液 OD值(用醋酸缓冲溶液代替
样品溶液) ;B－对照空白溶液 OD 值(用醋酸缓冲溶
液代替样品溶液及酶液) ;C－试样溶液 OD 值;D－试
样空白溶液 OD值(用醋酸缓冲溶液代替酶液)。
1.2.3 总多酚含量测定 参照 Taga等［11］方法进行改
进。
1.2.3.1 对照品与供试品溶液的制备 对照品溶液
精密称取 0.10g 没食子酸，用蒸馏水溶解、定容至
100mL，此溶液质量浓度为 1.0mg /mL。分别吸取上
述溶液 0.0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0mL 至 10mL 容量瓶
中，用蒸馏水定容至刻度，所得没食子酸标准溶液的
质量浓度分别为 0.0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mg /mL。供
试品溶液精密称取萌芽 0～6d 赤小豆粉末各 1.0g 于
试管中，加入 75% 甲醇 10mL，超声提取 30min，以
12000r /min离心 5min，取上清液，待测。
1.2.3.2 标准曲线的绘制 分别取不同浓度 100μL
没食子酸对照品于试管中，加入 100μL 甲醇和 0.3%
盐酸(体积之比为 6 ∶ 4) ，加入 2% 的碳酸钠溶液
2.0mL，混匀。静止 2min加入 50%的 Folin－Ciocalteu
试剂 100μL，暗处理 30min，分别测定在 750nm 下的
吸光度，绘制标准曲线。
1.2.3.3 总多酚含量的测定 取 100μL 样液于试管
中，按上述步骤操作，分别在 750nm波长下测定吸光
度，依据标准曲线计算总多酚含量。
1.2.4 总多糖含量测定 参照孙丽丽［12］等的方法进
行改进。
1.2.4.1 对照品与供试品溶液的制备 对照品溶液
精密称取葡萄糖 100mg，加适量水溶解，转移至
100mL容量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，即得
1.0mg /mL对照品溶液。精密吸取 0.0、0.1、0.2、0.3、
0.4、0.5mL 于试管中，加水稀释至 5.0mL，摇匀，即得
浓度为 0、0.02、0.03、0.04、0.05mg /mL的对照品溶液。
供试品溶液精密称取萌芽 0～6d 赤小豆萌芽粉末各
1.0g 于试管中，加入去离子水 10mL，功率 100W，
45℃超声提取 120min，以 12000r /min 离心 5min，取
上清液，待测。
1.2.4.2 标准曲线的绘制 分别取不同浓度葡萄糖
溶液 0.2mL 放入试管中(另取 0.2mL 去离子水做空
白对照)加入 0.1mL 5%苯酚溶液，震荡混合均匀。
再加入 0.5mL浓硫酸，混匀 5min 后，封管沸水浴 1h。
最后，取出冷却至室温，使用紫外可见分光光度计在
490nm处测吸光值。以吸光度值 A 为纵坐标，相应
葡萄糖溶液浓度为横坐标，绘制标准曲线。
1.2.4.3 总多糖含量的测定 取 0.2mL 样品溶液，按
上述步骤操作，分别在 490nm波长下测定吸光度，依
据标准曲线计算总多糖含量。
1.2.5 总皂苷含量测定 参照闫婕［13］等的方法进行
改进。
337
1.2.5.1 对照品与供试品溶液的制备 对照品溶液
精密称定齐墩果酸对照品 2.0mg，置 10mL量瓶中，加
75%甲醇超声溶解定容，制得每 0.2mg /mL 对照品溶
液，冰箱冷藏待用。供试品溶液精密称取萌芽 0～6d
赤小豆萌芽粉末各 1.0g 于试管中，加入 100%甲醇
10mL，超声提取 30min，以 12000r /min 离心 5min，取
上清液，待测。
1.2.5.2 标准曲线的绘制 精密量取对照品溶液
0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08mL，于具塞试管中，水
浴挥干溶剂，各加入新配制的 0.5%香草醛－冰醋酸
0.2mL，高氯酸 0.8mL，密塞摇匀，于 70℃水浴中加热
15min，取出立即流水冷却 15min，摇匀。在 550nm的
波长处测定吸光度。以吸光度值 A 为纵坐标，相应
齐墩果酸含量为横坐标，绘制标准曲线。
1.2.5.3 总皂苷含量测定 精密吸取供试品溶液
0.04mL至具塞试管中，按上述步骤操作，以空白试剂
为对照，在 550nm的波长处测定吸光度，依据标准曲
线计算总皂苷含量。
1.2.6 统计方法 每个实验重复 3 次，结果以 x ± s
表示。数据结果采用 SPSS v17.0 软件进行统计
分析。
2 结果与分析
2.1 具有抗敏活性的最佳天数确定
赤小豆萌芽过程中，碳水化合物、蛋白质、多酚、
有机酸等物质均在发生变化，其功效可能也在发生
变化。通过抗敏功效评价实验，主要考查绿豆萌芽
的抗敏活性及其随萌芽过程的变化规律。实验选择
赤小豆萌芽 0～6d提取物，进行抗敏功效检测。
赤小豆 0～6d 萌芽透明质酸酶抑制率如图 1 所
示。萌芽第 4d 的抑制率最高，为 90.67% ± 4.82%，
并和其它萌芽天数呈极显著差异(p ＜ 0.01)。赤小豆
萌芽过程中，抗敏活性呈先上升后下降的趋势，在第
4d抗敏活性最佳。推测在萌芽初期(第 0d) ，赤小豆
体内的抗敏活性物质尚未被完全激活，随着萌芽过
程的进行，抗敏活性物质种类和含量发生了变化，有
关酶的活性也逐渐增强，在第 4d 达到顶峰，然而随
着萌芽过程的继续进行，在萌芽后期，豆芽整体开始
发蔫，生命机能收到衰减，有关酶的活力逐渐下降，
导致赤小豆萌芽抗敏活性降低。
2.2 不同萌发天数的赤小豆萌芽中总多酚含量测定
总多酚含量的标准曲线方程为:y = 1.211x +
0.012，Ｒ2 = 0.998(y 值为吸光度，x 值为加样浓度) ，
结果的变化趋势如图 2 所示。多酚类物质是赤小豆
萌芽次级代谢产物中重要的组成部分，以酚酸、黄酮
类物质为代表，其显著的抗氧化、抗炎、抗敏功效越
来越受到学者的关注。随着萌芽过程的进行，赤小
豆萌芽中总多酚的含量逐渐增高，在第 6d 达到最
高，为 4.65mgGAE /g，与第 0d 形成极显著差异(p ＜
0.01) ，推测经萌芽作用，赤小豆萌芽体内包括苯丙氨
酸解氨酶(PAL)、黄酮合酶(IFS)在内的酶活性得到
显著提升，从而生成更多的总多酚。从图 2 中可以
看出，萌芽第 3d 至第 4d 过程中，总多酚含量上升了
近 20%，此结果与第 4d 为最佳抗敏活性单天相吻
图 1 不同萌芽天数(0～6d)赤小豆透明质酸酶抑制率(%)
Fig.1 Hyaluronidase inhibition rate of
rice bean sprout extracts in different days
注:采用 Duncan分析，不同字母表示显著差异性
(p ＜ 0.05，n = 3) ;阳性对照为 1%甘草酸二钾。
合，推测赤小豆萌芽抗敏活性的增强与总多酚含量
的增加具有紧密联系。
图 2 赤小豆萌芽总多酚含量
Fig.2 The total polyphenol content of rice bean sprout
注:采用 Duncan分析，不同字母表示
显著差异性(p ＜ 0.05，n = 3)。
2.3 不同萌发天数的赤小豆萌芽中总多糖含量测定
标准曲线方程为:y = 8.395x + 0.110，Ｒ2 = 0.999
(y 值为吸光度，x 值为加样浓度) ，结果变化趋势如
图 3 所示。多糖是赤小豆萌芽过程中重要的基础营
养物质，不仅在能量代谢过程中起到重要作用，其所
特有的药学特性和活力在抗敏、抗辐射、抗氧化防衰
老、提高免疫力等应用中表现出优良的生物治疗作
用。由图 3 可知，多糖含量在萌芽前期(0～4d)呈上
升的趋势，并在第 4d 达到最高，为 84.73mg /g，此结
果与第 4d为最佳抗敏活性单天相吻合，推测赤小豆
萌芽抗敏活性与总多糖含量相关;随着萌芽过程的
进行，在萌芽后期(4～6d)多糖含量逐渐下降，第 6d
多糖含量为 37.44mg /g，仅为第 4d 的 44%。从生命
代谢的角度分析，萌芽初期赤小豆萌发需要多糖等
营养物质的维持，因此在此时期多糖含量呈上升趋
势;当萌芽进入稳定期和衰减期后，多糖逐渐分解为
次生代谢产物，其含量也逐渐降低。
2.4 不同萌发天数的赤小豆萌芽中总皂苷含量测定
标准曲线方程为:y = 51.98x－0.114，Ｒ2 = 0.999(y
值为吸光度，x值为加样浓度) ，结果变化趋势如图 4
所示。赤小豆萌芽过程中皂苷类物质的含量变化总
体变化不大，在第 3d 含量最高，为 5.60 ± 0.42mg /g，
仅比萌芽初期(第 0d 为 4.79 ± 0.04)提高了 17%。
338
从定量结果分析，萌芽过程对赤小豆中总皂苷的含
量影响不大，但不排除皂苷的种类发生了变化，可以
在后期的研究中深入考察。
图 3 赤小豆萌芽总多糖含量
Fig.3 Total polysaccharide content of rice bean sprout
注:采用 Duncan分析，不同字母表示
显著差异性(p ＜ 0.05，n = 3)。
图 4 赤小豆萌芽总皂苷含量
Fig.4 Total saponin content of rice bean sprout
注:采用 Duncan分析，不同字母表示
显著差异性(p ＜ 0.05，n = 3)。
2.5 各成分含量与抗敏活性的相关性分析
通过 SPSS 17.0 Spearman相关性分析，考察萌芽
过程中各活性物质总含量的变化与抗敏活性变化之
间的相关性，如图 5 所示，多酚类物质总含量与赤小
豆萌芽抗敏活性的相关性最高。
赤小豆萌芽中总多酚含量随萌芽过程的进行逐
渐增多，总多糖的含量呈先降低后升高再降低的趋
势，总皂苷含量随萌芽过程变化不明显，综上，结合
透明质酸酶体外抑制率的变化趋势，采用 SPSS 17.0
Spearman进行相关性分析，得出结论，三种活性物总
含量的变化与抗敏活性并未呈显著相关性，但总多
酚的相关度达到 0.750，与赤小豆萌芽抗敏活性的相
关性最高。
3 结果与讨论
以赤小豆萌芽为考查对象，利用抗敏活性评价
实验、分析化学方法等手段，总结了赤小豆萌芽过程
中抗敏活性的变化，研究了赤小豆萌芽活性物质随
萌芽过程的变化规律。研究结果表明:以 0～6d 为萌
芽周期，采用体外透明质酸酶抑制实验评价萌芽提
取物抗敏活性，结果表明 4d 萌芽提取物抗敏活性较
高。萌芽过程是提高赤小豆多酚类物质代谢水平的
有效途径，并发现萌芽 6d 时总多酚含量相比于 0d
提高了 145%。赤小豆萌芽多糖含量呈先升高后降
图 5 相关性分析标准曲线
Fig.5 Standard curve of correlation analysis
注:通过 SPSS 17.0 Spearman相关性分析。
低的趋势，总皂苷含量随萌芽进程变化不大。今后
可深入研究萌芽过程中活性物质单体的种类和含量
变化规律，通过代谢组学的方法分析赤小豆萌芽中
起抗敏功效的关键物质。
本文首次对赤小豆萌芽的抗敏活性进行研究，结
果证明萌芽作用对于植物药理活性的积极影响，并且
多酚类成分为赤小豆中发挥抗敏功效的主要活性物
质，本文研究结果为赤小豆萌芽作为功能食品及功能
化妆品植物原料应用提供理论基础和科学依据。
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342
图 4 苦丁茶叶制虫茶粗多酚(CPKMI)
对 HepG2 人肝癌细胞的 E2F1 和 p73 基因表达的影响
Fig.4 Effect of crude polyphenols of Insect tea made by
Kuding tea leaves(CPKMI)on the gene expressions of E2F1
and p73 in HepG2 human hepatoma cells
caspase－3、caspase－9、p53、p21、E2F1、p73 的表达，下
调 HIAP－1、HIAP－2 的表达。表明 CPKMI 可以从多
种基因途径诱导 HepG2 人肝癌细胞凋亡。本研究表
明，CPKMI有望作为一种抗癌功能性食品的原料，其
体内的抗癌活性有待进一步研究。
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