全 文 ：收稿日期:2013 － 07 － 01 修回日期:2013 － 09 － 18
基金项目:福建省重大科技平台建设项目(2008N2001) ;国家支撑计划资助项目(2007BAD07B01)．
作者简介:金建涛(1986 －) ，男，硕士研究生．研究方向:果树生物技术．通讯作者赖钟雄(1966 －) ，博士，研究员，博士生导师．研究方向:园
艺植物生物技术与遗传资源． Email:laizx01@ 163． com．
尤溪金柑离体再生体系优化及试管苗保存
金建涛，赖钟雄，刘生财，林玉玲，张梓浩
(福建农林大学园艺植物生物工程研究所，福州 350002)
摘要:以尤溪金柑试管苗为材料，采用双因素试验设计，筛选出适合尤溪金柑试管苗增殖和生根的培养基;采用 L3(3
4)正
交表设计，研究 CaCl2、甘露醇和多效唑对尤溪金柑试管苗保存的影响．结果表明:芽增殖的最优培养基为:MS + 1．2 mg·
L －16-BA + 0．05 mg·L －1NAA，增殖系数最高，达 10．60;生根最优培养基为:MS + 0．3 mg·L －1NAA + 0．2 mg·L －1 IBA，生根
率最高达到了 83．33% ．保存 12 个月时处理 C4(MS + 0．44 g·L －1CaCl2 + 0 g·L
－1甘露醇 + 1．0 mg·L －1多效唑)中尤溪金
柑试管苗的存活率均为最高，达 97．8% ．
关键词:尤溪金柑;离体再生体系;优化;试管苗;离体保存
中图分类号:S666 文献标识码:A 文章编号:1671-5470(2014)03-0256-07
Optimization of plantlet regeneration system and in vitro conservation
of Fortunella crassifolia cv． Youxijingan
JIN Jian-tao，LAI Zhong-xiong，LIU Sheng-cai，LIN Yu-ling，ZHANG Zi-hao
(Institute of Horticultural Biotechnology，Fujian Agriculture and Forestry University，Fuzhou，Fujian 350002，China)
Abstract:In vitro plantlets were used as the materials for the studies of optimization of regeneration system，the media for micro-
propagation，growth and rooting of tube plantlets were optimized in Fortunella crassifolia cv． Youxijingan． The influences of different
concentrations of PP333，CaCl2 and mannitol on the conservation of in vitro plantlets were compared． The results showed that the best
proliferation medium was MS + 1．2 mg·L －16-BA + 0．05 mg·L －1NAA，the proliferation coefficient reached 10．60;the best roo-
ting medium was MS + 0．3 mg·L －1NAA + 0．2 mg·L －1 IBA，the root induction rate reached 83．33%;the best proliferation medi-
um was C4 (MS + 0．44 g·L －1CaCl2 + 0 g·L
－1mannitol + 1．0 mg·L －1 PP333) ，it was suitable for in vitro conservation of For-
tunella crassifolia cv． Youxijingan plantlets，and the survival rate reached 97．8% without subculture for 12 months．
Key words:Fortunella crassifolia cv． Youxijingan;in vitro regeneration techniques;optimization;plantlets;in vitro conservation
金柑(Fortunella crassifolia)别名金弹，原产于我国，已有 1600 多年的栽培历史［1］，是一种既可观果又
可食用的柑橘类植物，主要分布在我国南方的福建、广西、江西等地［2］．尤溪金柑(Fortunella crassifolia cv．
Youxijingan)主要分布于福建省尤溪县，因其形美色鲜，甜酸可口，皮肉均可食用，具有很高的食用和一定
的药用价值而广受人们欢迎．
柑橘离体再生体系的研究已经有几十年的历史，其离体再生途径主要有 3 种:一是离体器官发生途
径;二是原生质体途径;三是体胚发生途径［3］．离体器官发生途径与另外 2 种再生途径相比具有操作简单、
变异率低等特点，而且还有较高的再生频率，是柑橘茎尖嫁接脱毒［4］和建立遗传转化再生体系的有效方
法［5］．韩牙琴［6］对四季桔再生体系建立的研究表明，附加 1．0 mg·L －16-BA 和 0．05 mg·L －1NAA 的效果
最佳．目前，针对尤溪金柑再生体系建立的研究还比较少，Yang et al［7］利用下胚轴为材料通过愈伤组织成
功诱导出了金弹嫩芽，董艳［8］对影响尤溪金柑再生体系的一些因素进行了探讨，但目前针对尤溪金柑增
殖生根的研究较少．本研究以尤溪金柑试管苗为材料，建立并优化福建尤溪金柑离体再生体系，为尤溪金
柑等柑橘类植物种质资源的离体保存提供理论依据．
柑橘种质资源是生物学研究和育种的物质基础［9］，然而近年来，受人为因素和自然灾害的影响，一些
宝贵的种质资源正在消失，这严重影响了柑橘种类的多样性和种质资源的开发利用，因此，保存柑橘种质
福建农林大学学报(自然科学版) 第 43 卷 第 3 期
Journal of Fujian Agriculture and Forestry University (Natural Science Edition) 2014 年 5 月
DOI:10.13323/j.cnki.j.fafu(nat.sci.).2014.03.012
资源就显得尤为重要．目前，离体保存柑橘种质资源的方法主要分为一般保存、超低温保存和缓慢生长法
离体保存［10 － 13］．缓慢生长法离体保存可延长保存材料继代周期、提高保存遗传稳定性，使植物处于最缓慢
生长的状态，从而实现对种质资源的长期无继代保存，具有其它保存方法不可替代的优越性［14］．韩牙琴［6］
研究表明，多效唑、甘露醇共同作用，可以明显抑制四季桔试管苗的长势，但在多效唑、甘露醇共同作用下，
试管苗的健壮程度和成活率较低．金弹实生试管苗经 ＲAPD-PCＲ扩增结果表明:接近 100%的概率可以确
定子叶最大的胚苗是珠心苗，因此金弹实生试管苗来源于珠心胚，可作为种质资源保存的材料［6］． 目前，
关于尤溪金柑试管苗保存的研究还很少有人进行，本研究在前人研究基础上探讨了 CaCl2、甘露醇和多效
唑(PP333)对尤溪金柑试管苗保存的影响，为提高试管苗的成活率和改善保存效果提供依据．
1 材料与方法
1．1 材料
本研究所用材料为 30 d苗龄的尤溪金柑实生试管苗，实生种子采自福建省尤溪县管前镇八字桥乡洪
田村金柑园．
1．2 方法
1．2．1 6-BA和 NAA对芽增殖的影响 以MS为基本培养基，采用双因素试验设计，将 30 d苗龄且长势一
致的尤溪金柑试管苗茎段分切成段，每段长 1．0 － 1．5 cm，接种于添加不同浓度 6-BA 和 NAA 的 MS 基本
培养基中(表 1) ，同时添加 30 g·L －1白糖，6．0 g·L －1琼脂粉，培养基 pH 值调至 5．8．所接茎段形态学上
端向上，每个培养瓶接 3 个，每种培养基接 10 瓶，重复 3 次．观察幼苗生长和增殖情况，45 d后统计记录增
殖系数．
表 1 芽增殖试验中的激素种类组合处理
Table 1 Media of different combinations of hormones in the experiment of micro-propagation mg·L －1
激素
培养基编号
A1 A2 A3 A4 A5 A6 A7 A8 A9
6-BA 1．00 1．00 1．00 1．20 1．20 1．20 1．50 1．50 1．50
NAA 0．05 0．08 0．10 0．05 0．08 0．10 0．05 0．08 0．10
1．2．2 NAA和 IBA对试管苗生根的影响 以 MS 为基本培养基，采用双因素试验设计，当增殖培养基中
的嫩芽长致 2 － 3 cm时，从基部切下，选择长势一致的嫩芽接种到添加不同浓度 IBA 和 NAA 的培养基中
(表 2) ，同时添加 30 g·L －1白糖，6．0 g·L －1琼脂粉，培养基 pH值调至 5．8．每瓶接 3 株，每种接 10 瓶，重
复 3 次，50 d后统计记录试管苗生根率．
表 2 试管苗生根试验中的激素种类组合处理
Table 2 Media of different combinations of hormones in the experiment of rooting mg·L －1
激素
培养基编号
B1 B2 B3 B4 B5 B6 B7 B8 B9
IBA 0．15 0．20 0．25 0．15 0．20 0．25 0．15 0．20 0．25
NAA 0．25 0．25 0．25 0．30 0．30 0．30 0．35 0．35 0．35
表 3 正交试验因子水平表
Table 3 Factors and levels of orthogonal experiment
水平
CaCl2
g·L －1
甘露醇
g·L －1
多效唑
mg·L －1
1 0．22 0 0
2 0．44 15 0．5
3 0．88 30 1．0
1．2．3 尤溪金柑试管苗离体保存条件的优化 以
除去 CaCl2 的 MS 为基本培养基，添加不同浓度
CaCl2、甘露醇和多效唑，培养基 pH 值调至 5． 8． 采
用 L3(3
4)正交表设计(表 3) ，将已生根的 30 d 苗龄
试管苗分别转接于以上培养基中，每瓶接 3 株，每种
接 10 瓶，重复 3 次，在 12 个月时观察记录试管苗的
生长状况并统计其成活率．
1．3 培养条件
光照强度 1200 Lx;温度 25 ±2 ℃;光照时间 12 h·d －1;培养容器为直径 6 cm、高 9 cm的圆柱型玻璃瓶．
·752·第 3 期 金建涛等:尤溪金柑离体再生体系优化及试管苗保存
1．4 数据处理与分析
记录统计数据，Excel软件初步处理后，采用 SPSS 19．0 软件进行分析． 增殖系数 =增殖嫩芽数 /接种
的茎段数;生根率 =形成有效根的植株数 /接种的植株总数 × 100% ．
2 结果与分析
2．1 不同浓度 6-BA和 NAA对尤溪金柑芽增殖的影响
采用双因素试验设计，比较不同浓度 6-BA、NAA组合对尤溪金柑芽增殖的影响，A1 － A9 分别为 9 组
处理的编号(表 4)． A4 处理的增殖系数最高，达 10．60，最适合芽增殖，且芽的生长状态良好(图 1A) ;其次
是 A5 处理，虽然也有较高的增殖系数，但生成芽的叶片呈现不健康的黄绿色;增殖系数最低的为 A2 处
理;观察还发现 A7 处理的芽最为健壮(图 1B) ，但其增殖系数较低，并不适合尤溪金柑芽增殖．
表 4 6-BA和 NAA对尤溪金柑芽增殖的影响
Table 4 Effects of 6-BA and NAA on the multiplication of shoots
编号
6-BA
mg·L －1
NAA
mg·L －1
增殖系数
Ⅰ Ⅱ Ⅲ 均值
芽生长状况
A1 1．00 0．05 5．70 5．10 5．20 5．33 叶片细长，较弱
A2 1．00 0．08 4．70 4．80 4．80 4．77 芽叶片较少
A3 1．00 0．10 4．80 5．10 5．10 5．00 轻微玻璃化
A4 1．20 0．05 10．5 10．5 10．80 10．60 芽数多，正常
A5 1．20 0．08 7．00 7．20 7．50 7．23 叶片黄绿色
A6 1．20 0．10 5．80 6．30 5．90 6．00 芽较健壮
A7 1．50 0．05 6．20 6．40 6．50 6．37 芽很健壮
A8 1．50 0．08 6．10 6．50 6．70 6．43 叶片较绿
A9 1．50 0．10 6．80 7．00 6．90 6．90 叶片细长，黄绿
A． A4 处理;B． A7 处理．
图 1 芽增殖过程中芽生长情况
Fig． 1 Proliferation planlets of Fortunella crassifolia in medium
运用 SPSS 19．0 软件对统计数据进行方差分析(表 5)．在 α = 0．01 水平上，6-BA、NAA 和二者综合作
用下，不同浓度的各因素对试管苗增殖系数的影响差异均达到了极显著水平，但其影响程度存在较大差
异，通过 F值可知，影响增殖的主次顺序为 BA ＞ BA × NAA ＞ NAA．方差分析表明，6-BA 是影响本研究尤
溪金柑芽增殖的关键因素，其次是 6-BA和 NAA的综合作用．
表 5 BA和 NAA对增殖系数影响的方差分析
Table 5 Variance analysis of proliferation coefficients affected by BA and NAA
变异来源 离均差平方和 自由度 均方 F P
BA 38．172 2 19．086 402．594 0．000
NAA 11．532 2 5．766 121．625 0．000
BA × NAA 23．477 4 5．869 123．805 0．000
误差 0．853 18 0．047
·852· 福建农林大学学报(自然科学版) 第 43 卷
综上所述，本研究中最适合尤溪金柑芽增殖的为 A4 处理:MS + 1．20 mg·L －16-BA + 0．05 mg·L －1
NAA，30 g·L －1白糖，6．0 g·L －1琼脂粉，pH值调至 5．8．
2．2 不同浓度 NAA、IBA对尤溪金柑生根率的影响
采用双因素试验设计，比较不同浓度 NAA、IBA组合对尤溪金柑芽生根率的影响(表 6)． B5 处理培养
基中尤溪金柑芽的生根率最高，达 83． 33%(图 2A) ，而 B9 处理尤溪金柑生根率最低，仅为 36． 67%(图
2B) ;不同 NAA、IBA组合对尤溪金柑芽的生根率的影响有较大差异，因此选择适宜的浓度组合对提高生
根率有重要作用．
表 6 不同处理对尤溪金柑生根率的影响
Table 6 Effect of hormone concentrations on rooting of Fortunella crassifolia cv． Youxijingan
培养基
编号
NAA
mg·L －1
IBA
mg·L －1
生根率 /%
Ⅰ Ⅱ Ⅲ 均值
B1 0．25 0．15 60．00 63．33 56．66 60．00
B2 0．25 0．20 56．66 73．33 60．00 63．33
B3 0．25 0．25 70．00 70．00 60．00 66．67
B4 0．30 0．15 73．33 60．00 56．66 60．00
B5 0．30 0．20 80．00 90．00 80．00 83．33
B6 0．30 0．25 73．33 76．66 80．00 76．67
B7 0．35 0．15 53．33 60．00 46．66 53．33
B8 0．35 0．20 53．33 50．00 46．66 50．00
B9 0．35 0．25 43．33 26．66 40．00 36．67
A．处理 B5;B．处理 B9．
图 2 尤溪金柑试管苗的生根情况
Fig． 2 Ｒooting of Fortunella crassifolia plantlets in medium
运用 SPSS 19．0 软件对统计数据进行方差分析(表 7)．结果表明，在 α = 0．01 水平上，不同浓度的 IBA
和 IBA、NAA组合对尤溪金柑芽生根率的影响无显著性差异，而不同浓度的 NAA 对试管苗增殖系数的影
响差异达极显著水平．通过比较 F值可知，影响生根率的主次顺序为 NAA ＞ IBA ＞ NAA × IBA．方差分析表
明，NAA是影响本研究尤溪金柑芽生根率的关键因素，其次是 IBA．
表 7 IBA和 NAA对生根率影响的方差分析
Table 7 Variance analysis of root induction rate affected by IBA and NAA
变异来源 离均差平方和 自由度 均方 F P
NAA 0．327 2 0．163 15．750 0．000
IBA 0．009 2 0．004 0．429 0．658
NAA × IBA 0．004 4 0．001 0．107 0．979
误差 0．187 18 0．010
综上所述，本研究中最适合尤溪金柑芽生根的培养基为 A4 处理:MS +0．30 mg·L －1NAA +0．20 mg·
L －1 IBA，30 g·L －1白糖，6．0 g·L －1琼脂粉，pH值调至 5．8．
·952·第 3 期 金建涛等:尤溪金柑离体再生体系优化及试管苗保存
2．3 不同浓度 CaCl2、甘露醇和多效唑对尤溪金柑离体保存的影响
采用 L3(3
4)正交表设计，比较不同浓度的 CaCl2、甘露醇和多效唑对尤溪金柑试管苗成活率的影响
(表 8)．保存 12 个月后不同处理间的尤溪金柑试管苗存活率差异较大，C4 处理中试管苗的存活率最高
(97．8%) ，其生长状况见图 3;C3 处理中试管苗的存活率最低(22．2%)．通过极差 Ｒ 值可知，影响尤溪金
柑试管苗存活率因素的主次顺序依次为为:甘露醇 ＞ CaCl2 ＞多效唑，对试管苗成活率影响最大的因素为
甘露醇，其次为 CaCl2，多效唑对试管苗成活率的影响最小．
表 8 不同处理对尤溪金柑种质保存的影响
Table 8 Effect of hormone concentrations on germplasm conservation of Fortunella crassifolia
培养基
编号
CaCl2
g·L －1
甘露醇
g·L －1
多效唑
mg·L －1
12 个月后成活率 /%
Ⅰ Ⅱ Ⅲ 均值
C1 0．22 0 0 80．0 80．0 86．7 82．2
C2 0．22 15 0．5 33．3 33．3 40．0 35．5
C3 0．22 30 1．0 26．6 20．0 20．0 22．2
C4 0．44 0 1．0 100 100 93．3 97．8
C5 0．44 15 0 60．0 60．0 66．7 62．2
C6 0．44 30 0．5 46．7 46．7 46．7 46．7
C7 0．88 0 0．5 86．7 86．7 93．3 88．9
C8 0．88 15 1．0 26．6 20．0 26．6 24．4
C9 0．88 30 0 40．0 40．0 46．7 42．2
K1 139．9 268．9 186．6 Ｒ值排序:甘露醇 ＞ CaCl2 ＞多效唑
K2 206．7 122．1 171．1
K3 155．5 111．1 144．4
k1 46．6 89．6 62．2
k2 68．9 40．7 57．0
k3 51．8 37．0 48．1
Ｒ 22．3 52．6 14．1
A．试管苗;B．根部．
图 3 处理 C4 试管苗和根部的生长状况
Fig． 3 Plantlets and root of Fortunella crassifolia in medium C4
运用 SPSS 19．0 软件对统计数据进行方差分析(表 9)．在 α = 0．01 水平上，不同浓度的多效唑对尤溪
金柑试管苗成活率的影响不存在显著性差异，而不同浓度的 CaCl2 和甘露醇对试管苗成活率的影响差异
达到了极显著水平．通过 F值可知，影响生根率的主次顺序为:甘露醇 ＞ CaCl2 ＞多效唑，方差分析表明，甘
露醇是影响本研究尤溪金柑试管苗成活率的关键因素，其次为 CaCl2，多效唑对试管苗成活率的影响最
小，这与极差分析结果是一致的
综上所述，本研究中最适合尤溪金柑试管苗保存的培养基为 C4 处理:MS(无 CaCl2)+ 0． 44 g·L
－1
CaCl2 + 0 g·L
－1甘露醇 + 1．0 mg·L －1多效唑，30 g·L －1白糖，6．0 g·L －1琼脂粉，pH值调至 5．8．
·062· 福建农林大学学报(自然科学版) 第 43 卷
表 9 CaCl2、甘露醇和多效唑对种质保存(12 个月)影响的方差分析
Table 9 Variance analysis of growth and conservation (12 months)affected by CaCl2，mannitol and PP333
变异来源 离均差平方和 自由度 均方 F P
CaCl2 2318．685 2 1159．343 19．755 0．000
甘露醇 15315．525 2 7657．763 130．487 0．000
多效唑 338．881 2 169．440 2．887 0．079
误差 117．371 20 58．686
3 讨论
3．1 植物激素配比在尤溪金柑再生体系建立中的重要性
再生体系建立是柑橘类植物试管苗保存过程中的重要环节，在试管苗保存体系建立、种质资源数量扩
增、试管苗种质资源继代保存等方面起着重要作用［7］． 在离体条件下，柑橘的不定芽、腋芽发生和生根受
外植体和培养基内各种生长调节物质组合的影响较大［15］．王彩霞［16］研究表明，当 6-BA 浓度为 2．0 mg·
L －1，IBA浓度为 0．1 mg·L －1时，墨西哥来檬、甜橙和香橼诱导出的平均腋芽数均大于 4．6 个．张娟［17］研
究表明，MS培养基中添加 1．5 mg·L －1 6-BA + 0．05 mg·L －1 NAA 时，雪柑芽苗的增殖系数最高．由此可
见:不同的柑橘品种最适增殖培养基中生长调节物质的组合和浓度不同．不同柑橘的基因型对激素的敏感
程度也不同［18，19］．本研究采用横切尤溪金柑茎段的方法，不经愈伤组织阶段直接形成腋芽，可提高种质保
存过程中材料的遗传稳定性［20］，茎段在 6-BA、NAA等激素的刺激下增殖系数达到 10．60．在植物种质资源
长期保存过程中，提高保存材料的遗传稳定性是一个重要课题，因此本研究采用腋芽增殖，避免由愈伤组
织分化成苗的步骤，更有利于尤溪金柑种质资源原有性状的保持．
3．2 不同浓度 CaCl2、多效唑组合对试管苗存活率的影响
Ca2 +不仅是植物生长发育所需的大量元素，而且还作为第二信使调节植物的生长发育和抗逆等生理
反应［21］，对采后保鲜也有一定作用［22］．欧阳建树［23］研究表明，随着柑橘试管苗保存时间的增加，保存 1 年
时，Ca2 +分主要在液泡中积累，而如果细胞内 Ca2 +浓度达到 10 －4 mol·L －1时就会加速膜脂受损，产生钙
中毒，导致细胞死亡［24］．张建霞等［25］研究表明，钙能促进试管苗的生长，抑制顶端自枯现象．这与本研究
观察结果相似，但高浓度钙不利于柑橘试管苗的中长期无继代保存，因为随着保存时间的增加，Ca2 +会在
细胞内积累，当达到一定临界值时就会对细胞产生毒害．
韩牙琴［6］研究表明，甘露醇对四季桔试管苗的长期保存效果较差．本研究也发现，随着甘露醇浓度的
升高，尤溪金柑试管苗存活率呈下降趋势，不添加甘露醇处理的尤溪金柑试管苗存活率最高．这可能由于
甘露醇化学性状较为稳定，在培养基中较难被植物吸收利用，其主要作用是调节培养基的渗透压，抑制培
养物对水份的利用，从而起到延缓试管苗生长的作用．多效唑属于植物生长延缓剂，对植物的营养生长有
很强的抑制作用，可以提高试管苗的成活率［26］．野葛试管苗在添加 5．0 mg·L －1多效唑的培养基中保存半
年后，成活率可达 80%，恢复培养后其生长情况与正常继代苗无显著差异［27］．本研究发现添加 0．5 或 1．0
mg·L －1多效唑，可以显著提高尤溪金柑试管苗中长期保存的成活率，这可能因为在多效唑的作用下，试
管苗的营养生长受到限制，减少了对培养基营养的消耗，从而能够在不继代的情况下保存更长时间．
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(责任编辑:吴显达)
·262· 福建农林大学学报(自然科学版) 第 43 卷