全 文 ：园艺与种苗，Horticulture & Seed 2013（4）：36-40
金建涛 1，赖钟雄 1*，陈登云 2，卓春宣 3，郑运绪 3，
（1.福建农林大学园艺植物生物工程研究所，福建福州 350002；
2.福建省尤溪县科技局，福建尤溪 365100；
3.福建省尤溪县管前镇农业服务中心，福建尤溪 365116）
摘 要：[目的]为金秋早金柑的品种鉴定提供科学依据。[方法]通过 ISSR分子标记技术对
金秋早金柑母株、嫁接子代及对照等 10份尤溪金柑株系样品基因组 DNA进行分析鉴定。
[结果]从 48条引物中共筛选出 10条能扩增出清晰度高、多态性好条带的引物。10条引物
共扩增出 84个条带，其中多态性条带 38条，多态性百分率为 47.50%。金秋早母株与嫁接
子代植株之间的 DNA扩增图谱几乎没有差异，而母株、嫁接子代与其他尤溪金柑的 DNA
扩增图谱则有明显的不同，说明高接后该品种遗传性状稳定；金秋早与普通尤溪金柑在
DNA水平上存在差异，为不同品种；进一步的 UPGMA聚类分析结果也支持这一观点。[结
论]ISSR分子标记技术可以作为尤溪金柑新品种鉴定手段之一。
关键词：尤溪金柑；金秋早金柑；ISSR；分子鉴定
中图分类号：S432 文献标识码：A 文章编号：2095-0896（2013）04-036-05
JIN Jian -tao et al. ( Institute of Horticultural Biotechnology, Fujian Agriculture and Forestry University,
Fuzhou, Fujian 350002)
Abstract [Objective]The aim was to provide a scientific basis for identification of new cultivar Jinqiuzao of
Fortunella crassifolia. [Method]DNA polymorphism of a new cultivar Jinqiuzao and 9 related lines ( the mother
tree, grafting trees and CK trees) were determined by ISSR molecular markers in Fortunella crassifolia. Ten
primers combinations were selected with the abundant polymorphism from 48 primers. [Result] The results
showed that 84 DNA bands were amplified by 10 ISSR primers, in which 38 bands were polymorphic, and the
polymorphic ratio (PPB) was 47.50%. The polymorphic bands had no significant difference among the mother
tree and grafting trees, but remarkable difference between Jinqiuzao and the other trees, which suggested that
the grafting trees of Jinqiuzao were stable in genetic characteristics, and Jinqiuzao was a new cultivar and
different the common Youxijingan cultivar. This result was supported by the further UPGMA cluster analysis.
[Conclusion] ISSR molecular marker technology could be used as one of the means of identification of new
varieties of Fortunella crassifolia.
Key words Fortunella crassifolia; Jinqiuzao; ISSR; Molecular identification
尤溪金柑（Fortunella crassifolia） 属于芸香科
（Rutaceae）柑桔亚科（Aurantioideae）柑桔族（Citreae）
柑桔亚族（Citrinae）金柑属（Fortunella Swingle）植物，
是具有重要经济价值的热带水果[1]。尤溪金柑营养丰
基金项目：福建省农业科技平台项目（2008N2001）；福建省省长基金项目（szjj07）；尤溪县金柑产业化关键技术研究重大科技专
项（2008）。
作者简介：金建涛（1986-），男，河南周口人，硕士研究生，研究方向：果树生物技术，E-mail:jinjiantao602@163.com。*通讯作者，
博士，研究员，博士生导师，从事园艺植物生物技术与遗传资源研究，E-mail: laizx01@163.com。
收稿日期：2013-01-25
4期
表1 10份供试种质资源的编号及来源
编号 单株 来源 编号 单株 来源
M 母株 八字桥乌龙岭 CK2 对照 2 洪田村金柑园
1D 嫁接 1代 洪田村金柑园 1H 1号植株 八字桥乌龙岭
2D 嫁接 2代 洪田村金柑园 2H 2号植株 八字桥乌龙岭
3D 嫁接 3代 洪田村金柑园 3H 3号植株 八字桥乌龙岭
CK1 对照 1 洪田村金柑园 4H 4号植株 八字桥乌龙岭
注：M 为 Marker DL 2000；1~10 分别为 M、1D、2D、3D、CK1、CK2、
1H、2H、3H和4H的DNA扩增条带。
图 1 10份供试样品总 DNA琼脂糖凝胶电泳图
富，尤其是维生素C含量比其他柑橘高，广受市场和
消费者欢迎。此外，其还具有理气、化痰、防止感冒、
调节生理功能紊乱等功效[2]。尤溪金柑又名金弹、金
桔、绿桔，是金柑属中果形较大、品质较好、经济价值
较高的一个地方优良品种。该种可能是圆金柑与罗
浮的自然杂交种，或是柑橘属与金柑属杂交后代，再
经过金柑属回交而成[2]。福建省尤溪县八字桥乡等
地种植有 200多万株实生金柑树，2001年获得国家
林业局颁发的全国唯一的“金柑之乡”称号[3]，并已获
国家地理标识认证。尤溪县蕴藏着大量早熟、高产、
品质好、抗逆性强的金柑优良单株[4]，为金柑优良品
种的开发利用提供了丰富的种质资源。尤溪金柑新
品种金秋早即由尤溪县八字桥乡的实生尤溪金柑选
育而来。
ISSR(Inter-simple sequence repeat)是 Zietkiewicz
等[5]于 1994年发展起来的一种微卫星基础上的分子
标记。与 SSR标记相比，ISSR引物可以在不同的物
种间通用；与 RAPD和 RFLP相比，ISSR揭示的多态
性较高，可获得几倍于 RAPD的信息量，精确度几乎
可与 RFLP相媲美，并且检测过程非常方便[6-8]。近年
来，该技术已被广泛应用于新品种鉴定、遗传作图、
基因定位、遗传多样性分析、系统发育、分子标记辅
助育种等方面的研究，并在柑橘栽培种间亲缘关系
鉴定[6]、脐橙[9]、枇杷[10]、菊花[11]、草莓[12]等植物新品种
鉴定和罗汉果[13]、桃[14]、甜橙[15]等植物芽变株系的鉴
定中得到了应用。该研究通过 ISSR分子标记技术对
金秋早金柑母株、嫁接子代及对照等 10份尤溪金柑
单株或株系样品进行分析鉴定，旨在为金秋早金柑
的品种鉴定提供科学依据。
1 材料与方法
1.1 材料
供试样品采自福建省尤溪县八字桥乡，材料编
号及采样地见表 1，母株为金秋早金柑的实生母树；
嫁接 1代、嫁接 2代、嫁接 3代由母树及嫁接上一代
嫁接而来；对照 1、对照 2为普通尤溪金柑嫁接树；
1～4号植株为与母株同时期种植的实生株系。分别
选取 10 份材料的幼嫩、无病虫害叶片，洗净后滤
纸吸干表面水分，液氮处理后，置于-80 ℃冰箱保存
备用。
1.2 方法
1.2.1 总 DNA提取。采用 CTAB法[16]提取供试材料
总 DNA。微量核酸蛋白检测仪检测其 OD值，1％琼
脂糖凝胶电泳检测 DNA完整性。
1.2.2 引物筛选与 PCR扩增。选用嫁接 1代与 2号
植株的总 DNA为模板 DNA, 对 48条购自上海生物
工程技术服务公司的 ISSR引物进行筛选，选出 10条
引物对所有材料进行 PCR扩增。引物筛选及样品扩增
采用 25 μL PCR 反应体系：模板 DNA 1.5 μL（30
ng），引物 1.5 μL(10 mmol/L)，2×Master Mix12.5 μL，
加双蒸水致 25 μL。反应程序为：94℃预变性 5 min；
94 ℃变性 45 s，52 ℃退火 1 min，72 ℃延伸 1.5 min，
循环 40次，72℃延伸 10 min，最后置 4℃保存；1．5％
琼脂糖凝胶电泳检测 PCR产物。
1.2.3 数据分析。根据扩增的琼脂糖凝胶电泳条带
记录，选择清晰、信号强、稳定、可分辨的条带，对于同
一引物的扩增产物，迁移率相同的条带记为 1个位
点，有带记为“1”，无带记为“0”，所得数据输入 Excel
建立原始表征数据矩阵。采用 NTSYS 2.1e软件计算遗
传相似系数和遗传距离，UPGMA法进行聚类分析。
2 结果与分析
2.1 总 DNA提取与检测
经微量核酸蛋白检测仪检测，10个样品的 DNA
OD260/280值均在 1.9~2.0。DNA琼脂糖电泳图谱见图
1。由图 1可以看出，DNA电泳条带清晰、完整,基本
金建涛等 尤溪金柑新品种金秋早的 ISSR鉴定 37
园艺与种苗 2013 年
没有多糖等杂质，符合尤溪金柑 ISSR-PCR要求。
2.2 多态性分析
用所筛选的 10 条引物对 10 个样品的总 DNA
进行 PCR扩增，每个引物扩增的条带数、多态性条
带数及多态性条带百分率见表 2。10条引物的扩增
条带数在 7～13，引物 UBC836、UBC851、UBC818扩
增条带数最少，均为 7条；引物 UBC842扩增条带数
最多，为 13条；共同带的范围为 2～10条，多态性条
带范围为 2～6条。10条引物共扩增到 84条谱带，其
中多态性条带 38个，多态性条带百分率为 45.24%，
每个引物扩增的多态性片段的百分率介于 23.08%～
85.71%，平均每个引物产生的多态性条带数为 3.8
条。金秋早母株嫁接子 1代、嫁接子 2代、嫁接子 3
代植株之间的 DNA扩增图谱几乎没有差异，而母
株、嫁接子代与 2 个对照及母株周边金柑植株的
DNA 扩增图谱则有明显的不同（图 2a），说明高接
后该品种遗传性状稳定。引物 UBC842扩增图谱中
（图2b），母株、嫁接 1代、2代、3代植株之间的DNA
扩增图谱几乎完全一致，这反映了尤溪金柑之间的
共性。
表 2 引物名称、序列及其对 10份材料的扩增条带统计
引物 引物序列
扩增总
条带数
多态性
条带数
多态性百
分比//％
UBC873 GAC AGA CAG ACA GAC A 8 5 62.50
UBC868 GAA GAA GAA GAA GAA
GAA
8 5 62.50
UBC807 AGA GAG AGA GAG AGA GT 9 5 55.56
UBC810 GAG AGA GAG AGA GAG AT 8 2 25.00
UBC836 AGA GAG AGA GAG AGA
GYA
7 5 71.43
UBC880 GGA GAG GAG AGG AGA 9 3 33.33
UBC826 ACA CAC ACA CAC ACA CC 8 5 62.50
UBC851 GTG TGT GTG TGT GTG TYG 7 6 85.71
UBC842 GAG AGA GAG AGA GAG
AYG
13 3 23.08
UBC818 CAC ACA CAC ACA CAC AG 7 4 57.14
总计 84 38 45.24
注：Y = (C , T)。
注：M为MarkerDL2000；1~10分别为M、1D、2D、3D、CK1、CK2、1H、2H、3H和4H的扩增条带。
图 2 引物 UBC873（a）和 UBC842（b）对 10 份材料的 ISSR 扩增图谱
2.3 遗传相似系数及遗传距离分析
10份材料的相似性系数及遗传距离见表 3、4。
由表 3、4可知，10份材料间的相似性系数在 0.650 0～
0.987 5，其中母株（M）与 2号植株（2H）间的相似性
系数最低（0.650 0），即遗传距离最高（0.253 8）；而嫁
接 2 代（2D）与嫁接 3 代(3D)间的相似性系数最高
（0.987 5），即遗传距离最小（0.080 0）。并且母株与嫁
接 1代、嫁接 2代、嫁接 3代间的相似性系数很高，
说明高接后该品种遗传性状稳定；母株及其嫁接子
代与 2个对照及母株周围的 4株实生株系间的相似
性系数较低，这说明金秋早金柑与普通尤溪金柑相
比在 DNA水平上存在差异。
2.4 聚类结果分析
任何 DNA分子标记都会有不同程度的不稳定
性。虽然 ISSR是一种比较稳定的 DNA分子标记技
术，但 ISSR标记技术本身还是存在一定程度的不稳
定性，DNA甲基化也会一定程度影响 ISSR标记。即
使是遗传上很稳定，无性系之间也会有一些 ISSR标
记的差异。为了更科学、更深入地从本质上分析试验
结果，该试验进行了 UPGMA聚类分析，进一步揭示
10个样品之间的亲缘关系和遗传差异。从聚类分析
树状图(图 3)可以看出，当遗传相似性系数为 0.75
38
4期
图 3 10个供试样品的 UPGMA聚类分析结果
时，可将 10份样品聚为 2类。第 1类为母株、嫁接 1
代、嫁接 2代和嫁接 3代；第 2类为对照 1、对照 2、1
号植株、2号植株、3号植株和 4号植株，说明金秋早
金柑母株及其子代间亲缘关系较近。
3 结论与讨论
（1）金秋早金柑是从尤溪金柑实生株系选育而
来的新品种，其具有早熟、可溶性固形物和维生素 C
含量高等特点。尤溪金柑因其营养丰富、维生素 C
含量比其他柑橘高的特点而广受市场和消费者欢
迎，金秋早金柑的选育丰富了尤溪金柑品种类型和
种质资源，为消费者提供了一个优良的品种，有利于
柑橘产业的健康发展。
（2）在果树的无性繁殖过程中，DNA甲基化和
嫁接亲本的影响会使 ISSR标记有一些差异，吴姗等[17]
研究显示，嫁接体果实颜色等非数量性状受层源亲
本影响较大而表现出一致；而其他诸如一些果实质
量、直径、高度、籽粒数等数量性状则更多受到两亲
本间相互作用的影响，而与层源亲本表现出差异。但由
10份材料的遗传相似性系数分析可以看出，金秋早
金柑母株及其子代间的遗传相似性系数均在 0.820 0
以上，嫁接 2代与嫁接 3代间的相似性系数更是高
达 0.987 5，这说明高接后该品种遗传性状稳定，可
以保持金秋早金柑母株的优良性状。
（3）目前，多种方法都可作为柑橘新品种鉴定
的依据[18-20]。传统鉴定果树新品种的方法多是直接观
察测定新品种的外在形态及一些生理指标，如果实
成熟期、单果重、果实形状以及可溶性固形物含量、
维生素 C含量等，这些方法可以从表型及一些生理
指标上看出新品种与其他品种的差别，但是不能证
表3 10个供试样品间遗传相似性系数
编号 M 1D 2D 3D CK1 CK2 1H 2H 3H 4H
M
1D 0.862 5
2D 0.837 5 0.875 0
3D 0.825 0 0.862 5 0.987 5
CK1 0.700 0 0.762 5 0.662 5 0.675 0
CK2 0.675 0 0.762 5 0.737 5 0.725 0 0.775 0
1H 0.712 5 0.750 0 0.750 0 0.737 5 0.812 5 0.762 5
2H 0.650 0 0.737 5 0.687 5 0.700 0 0.800 0 0.850 0 0.787 5
3H 0.675 0 0.787 5 0.787 5 0.800 0 0.750 0 0.825 0 0.762 5 0.775 0
4H 0.750 0 0.787 5 0.787 5 0.775 0 0.775 0 0.850 0 0.787 5 0.775 0 0.875 0
表 4 10个供试样品间遗传距离
编号 M 1D 2D 3D CK1 CK2 1H 2H 3H 4H
M 0.088 6 0.106 0 0.115 3 0.210 1 0.236 3 0.201 8 0.253 8 0.239 2 0.171 7
1D 0.082 7 0.092 1 0.167 5 0.172 2 0.178 5 0.189 8 0.154 0 0.148 4
2D 0.080 0 0.247 5 0.192 4 0.178 5 0.230 6 0.154 0 0.148 4
3D 0.239 5 0.205 0 0.190 3 0.222 6 0.146 0 0.159 5
CK1 0.168 0 0.134 7 0.145 6 0.191 5 0.162 5
CK2 0.180 2 0.111 1 0.136 0 0.108 6
1H 0.157 0 0.183 1 0.154 1
2H 0.174 6 0.165 4
3H 0.090 4
4H
金建涛等 尤溪金柑新品种金秋早的 ISSR鉴定 39
园艺与种苗 2013 年
（上接第 26页）
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明其在分子水平上产生了本质差别。ISSR作为一种
比较稳定的 DNA分子标记技术目前已在新品种鉴
定[9]、航天诱变鉴定[21]、芽变株系鉴定[14]及品种间亲缘
关系鉴定[6]等方面得到了广泛应用，它可从分子水平
上看出不同品种间的差异，可以作为新品种鉴定依
据之一。该研究所筛选的 10条引物共扩增到 84条
谱带，其中多态性条带 38个，多态性条带百分率为
45.24%，说明 ISSR分子标记具有较好的稳定性和准
确性，可以用于柑橘新品种鉴定，这与吴兴恩[22]等在
柑橘上的研究结果一致。UPGMA法聚类结果表明，
当遗传相似性系数为 0.775 0时，母株、嫁接 1代、嫁
接 2代和嫁接 3代可聚为一类，与其他材料区分开
来，说明金秋早金柑母株及其子代间亲缘关系较近。
因此，ISSR分子标记技术可以作为尤溪金柑新品种
鉴定手段之一。
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（责任编辑 张杨林）
要，萌芽期适宜温度为 10~12 ℃，新捎生长适宜温度
28~30℃，开花期 20℃以上，浆果期要求不低于 20℃。
6.2 光照条件
巨峰葡萄也是喜光植物，对光照条件要求较高，
不同发育期需要不同的光照由其在开花期前后光照
充足的情况下，叶片厚而色浓，植株生命活力增强营
养状况改善，生长健壮而充实。
6.3 水分条件
巨峰葡萄对水分的需求也很重要，葡萄生长需
要大量水分，几个关键时期如萌芽后至开花前；坐果
后至果实着色期干旱时要及时浇水。雨天要及时清
理墒沟，排除积水。降水或灌溉有利于植株芽眼萌
发、新捎生长和花原始体的继续分化，而在开花期间
潮湿和阴沉的天气阻碍正常授粉受精，引起子房脱
落，果实成熟期雨水过多或阴雨连绵容易茲生病害，
引起果实开裂腐烂。
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（责任编辑 戚佳妮）
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