全 文 ：蔡定建 ,熊以俊 ,徐 娜 ,等.旱金莲中黄酮类物质的提取和测定 [ J].江苏农业科学 , 2011(1):308-312.
旱金莲中黄酮类物质的提取和测定
蔡定建 1 , 熊以俊 2 , 徐 娜1 , 徐 晶 1 , 梁晓鹏 1 , 刘 慧 1
(1.江西理工大学材料与化学工程学院 ,江西赣州 341000;2.赣州逸豪优美科实业有限公司 , 江西赣州 341000)
摘要:为研究旱金莲中黄酮类物质的提取及测定方法 , 在单因素试验的基础上 , 采用L9(34)正交试验设计进行试
验 ,以芸香苷标准品为对照品 , 采用紫外分光光度法测定旱金莲中总黄酮的含量。根据结果 , 最佳提取工艺条件为硼
砂浓度 0.4%, 料液比 1∶15, 提取 1h,提取温度 70℃, 重复提取 2次。
关键词:旱金莲;黄酮类物质;提取;测定
中图分类号:Q58 文献标志码:A 文章编号:1002-1302(2011)01-0308-05
(上接第 307页)
表 4 最佳工艺的验证
试验 总黄酮提取率(%)
1 4.56
2 4.54
3 4.61
平均 4.57
3 结论
通过单因素试验和正交试验 ,得到了超声 -微波协同萃
取桂花叶总黄酮的最佳工艺条件为:提取功率 200 W,液料比
为 30 mL∶1g,提取时间 12min,乙醇浓度为 60%。在此条件
下桂花叶总黄酮含量可达 4.57%。超声 -微波协同提取桂
花叶中黄酮类化合物具有工艺简单 、快速、高效 ,且对环境无
污染等优点 。
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旱金莲 [ 1] (TropaeolummajusL.)别名金莲花 、旱莲花等 ,
一年生草本植物 ,广泛分布于东北 、华北和内蒙古等地 ,在中
药 、蒙药中有很高的医用价值 。据记载 ,中药旱金莲功能为清
热解毒 ,治上感 、扁桃体炎 、咽炎等;蒙药多配方用 ,治疗创伤 、
目赤 、痈肿。旱金莲果实主要含有黄酮类 、生物碱类 、有机酸
类等化合物 ,还含有色素类 、微量元素 、挥发油等成分 。黄酮
类 [ 2 ]化合物又称生物类黄酮(bioflavonoids),是植物界分布最
为广泛的一大类次生物质 ,近年来对黄酮类化合物的研究逐
渐增多 ,目前已知的黄酮类化合物单体已有 8 000多种 。黄酮
类化合物在生理学 、医学和营养学上都有较高的应用价值 ,具
有广泛的生理和药理活性 ,包括抗病毒 、抗癌 、抗氧化 、抗炎 、
抗衰老等 。目前关于旱金莲黄酮类物质的提取报道还很少 ,
因此我们进行了从旱金莲中提取黄酮类物质的研究 。
收稿日期:2010-03-11
作者简介:蔡定建(1959—),男 ,江西南昌人 ,硕士 ,副教授 ,硕士生导
师 ,主要从事有机化学理论教学和天然产物研究工作。 E-mail:
caidingjian@ 126.com。
1 材料与方法
1.1 主要仪器 、试剂与材料
1.1.1 主要仪器 LAMBDA-35型紫外可见分光光度仪
[珀金埃尔默仪器(上海)有限公司 ] ;FT-IRAVATAR350型
傅立叶变换红外光谱仪(美国热电公司);7200型紫外可见分
光光度计 [尤尼柯(上海)仪器有限公司 ] ;微波合成仪 (环球
分析测试仪器有限公司 );真空干燥箱 (上海跃进医疗器
械厂)。
1.1.2 试剂与材料 乙醇 (50%)、 NaNO2 (50 g/L)、
Al(NO3)3(50g/L)、 NaOH(40 g/L)、 AlCl3 (3%)、 FeCl3
(1%)、PbAc2(1%)、H2 SO4(浓)、NaOH(4%)、石油醚 、硼砂 、
石灰乳 、HCl(2 mol/L)、镁粉 、浓盐酸 、芸香苷对照品 (色谱
纯 ,中国药品生物检定所 )、旱金莲 (摘自江西理工大学花
圃)。试剂均为分析纯 。
1.2 标准曲线的制作
精确称取芸香苷标准品 100 mg,置于 100 mL容量瓶中 ,
加 50%乙醇溶解 ,摇匀 , 定容至刻度 ,精确量取此标准液
5 mL,置于 50 mL容量瓶中 ,稀释 ,定容为 0.1 mg/mL的黄酮
—308— 江苏农业科学 2011年第 1期
DOI :10.15889/j.issn.1002-1302.2011.01.009
标准品溶液 ,作为储备液备用 。精确量取标准溶液 0、1.0、
2.0、3.0、4.0、5.0、6.0mL分别置于 10 mL比色管中 ,并用体积
分数 50%乙醇稀释至刻度 ,摇匀。配制成芸香苷乙醇系列标
准溶液 。以试剂为空白 ,用 1 cm比色皿在 200 ～ 700nm波长
处进行扫描 ,最大吸收峰位于 360nm波长 ,依次在此波长下测
试 ,以吸光度为纵坐标 ,芸香苷浓度(mg/mL)为横坐标 ,绘制图
1所示标准曲线 ,其回归方程:A=26.214 3C-0.029 1。
表 1 标准曲线制作数据
试验号 芸香苷标准液体积(mL)
芸香苷浓度
(mg/mL) 吸光度
1 0.0 0.00 0.000
2 1.0 0.01 0.196
3 2.0 0.02 0.481
4 3.0 0.03 0.739
5 4.0 0.04 1.063
6 5.0 0.05 1.315
7 6.0 0.06 1.507
用最小二乘法对直线进行回归计算 ,令回归方程为:y=
ax+b
x=∑
7
i=1
xi
7
=0.00+0.01+0.02+0.03+0.04+0.05+0.06
7
=0.03
y=∑
7
i=1
yi
7
=0.000+0.196+0.481+0.739+1.063+1.315+1.507
7
=
0.757 3
a=∑
7
i=1
(xi-x)(yi-y)
∑(xi-x)2 =
∑7
i=1
(xi-0.03)(yi-0.757 3)
∑7
i=1
(xi-0.03)2
=26.214 3
b=y-ax=0.757 3-26.214 3×0.03=-0.029 1
所以线性回归方程为:y=26.214 3x-0.029 1 ,即 A=
26.214 3C-0.029 1 ,
r= ∑
7
i=1
(xi-x)(yi-y)
∑7
i=1
(xi-x)2∑7i=1(yi-y)2
= ∑
7
i=1
(xi-0.03)(yi-0.757 3)
∑7
i=1
(xi-0.03)2∑7i=1(yi-0.757 3)2=0.998 2
1.3 旱金莲中黄酮的单因素提取试验
准确称取 30.00 g洗净 、干燥 、研碎的旱金莲 ,置于干净
的烧杯中 ,不同浓度的硼砂水溶液 。加热至沸腾 ,在搅拌下不
断加石灰乳使 pH值保持在 8 ～ 9 ,反应一定时间后 ,倾出上清
液 ,用 4层纱布过滤;同样操作再提取 2次 。合并滤液后冷
却 ,用 2mol/LHCl调 pH值 ,放置过夜 ,待析出结晶 。将结晶
离心分离 ,用蒸馏水洗涤结晶 2 ～ 3次 。将结晶物转移到表面
皿中 ,于 50℃鼓风干燥 5h,得粗制黄酮(图 2)。按 “1.2”中
的步骤进行 ,于波长 360nm处测定 D值 。参比为空白试剂 ,
在测定某一因素对旱金莲中黄酮提取量的影响时 ,固定其他
因素及其水平 。
1.4 确定旱金莲中黄酮最佳提取工艺条件的正交试验
在单因素试验 [ 3]基础上 ,考虑安全性及经济性 ,选择提
取次数为 2次 ,以硼砂质量分数 、固液比 、提取时间 、提取温度
为影响因素 ,采用正交试验确定各因素不同水平对旱金莲提
取黄酮量的影响 ,选用正交表 [ 4 ] L9 (34 )进行试验方案设计 ,
如表 2。
表 2 正交试验选用的因素与水平
水平 A:硼砂浓度(﹪)
B:料液比
(g∶mL)
C:提取时间
(h)
D:提取温度
(℃)
1 0.3 1∶10 0.5 60
2 0.4 1∶15 1.0 70
3 0.5 1∶120 1.5 80
表 3 从旱金莲中提取黄酮类物质的试验所采用的正交表
试验号 因素 A 因素 B 因素C 因素 D
1 1 1 1 1
2 1 2 2 2
3 1 3 3 3
4 2 1 3 2
5 2 2 1 2
6 2 3 2 1
7 3 1 2 3
8 3 2 3 1
9 3 3 1 2
1.5 黄酮的鉴定 [ 5 ]
1.5.1 HCl-镁粉反应 此反应为鉴定黄酮类化合物最常
用的反应 。取自制的黄酮样品少许置于试管中 ,加体积分数
5%的乙醇 2 mL,在水浴中加热溶解 ,滴加 2滴浓盐酸 ,再加
镁粉约 50 mg,即产生剧烈反应。反应过程中溶液颜色逐渐
由黄色变为橙红色 。这些现象表明被测物为黄酮类物质 。
1.5.2 红外光谱图的比较 取精制的黄酮苷和黄酮标准物 ,
溴化钾压片法绘制红外光谱图 。测试条件:扫描范围 4 000 ～
400cm-1 ,分辨率 4 cm-1 ,扫描 32次(图 3、图 4)。
从图 5可知 ,异槲皮素 、芸香苷羟基的数目不同 ,分别为
7个和 4个 ,在 C环上的取代位置及形成苷的位置不同 ,其他
则相同 。羟基的个数不同 ,在红外光谱图中主要表现为峰的
—309—蔡定建等:旱金莲中黄酮类物质的提取和测定
强弱差异 ,苯环上的取代位置不同在 900 ～ 600cm-1有不同形
态 。对照图 3和图 4可知 ,在异槲皮素 3 364.4 cm-1的羟基
伸缩振动吸收峰宽而强 ,表明羟基的数目较大 ,在苯环第 V
区(900 ～ 600 cm-1)的吸收峰中 ,具有明显的对位取代特征 ,
即在 800cm-1附近有 1个强吸收 ,系苯环(黄酮中的 B环)邻
位氢的振动 。而芸香苷具有三取代的特征 ,在 880 cm-1处有
1个中强吸收 ,这是来自 B环 2位置的孤立氢;在 808 cm-1处
的强吸收 ,是来自 B环 5、6位置邻位氢的特征;其他位置的吸
收峰基本一致 ,在 1 656、1 602 cm-1处具有黄酮的特征吸收
峰 。且图 3中 ,羟基波数较低 ,峰型较宽 ,说明旱金莲中提取
的黄酮类物质羟基缔合程度强于芸香苷 。结合图 3的 1 716
cm-1羰基吸收峰的存在 ,说明旱金莲提取物中含有酚酸类物
质 。图谱对照结果表明旱金莲中的提取物为黄酮类化合物。
1.6 旱金莲的总黄酮的测定
1.6.1 试液的制备 准确称取洗净 、干燥、研碎的旱金莲
1.000g于干净的微波管中 , 量取 50 g/L的乙醇 40 mL,分
2次对其进行微波加热提取(80 ℃, 10 min, m∶V=1 ∶20)。
加热时 ,采用微波辐射间断加热的方法 (连续加热则溶液沸
腾加重 ,液体损失大),每次加热 10 s,间断辐射 5次 ,将 2次
提取液合并 ,补足损失的乙醇 ,过滤后得到清澈透明的黄色溶
液 ,将滤液置于 50 mL容量瓶中 ,用 50%的乙醇定容 、摇匀 。
在分液漏斗中用石油醚萃取 ,弃去油脂和色素 ,取非醚层的液
体测试 。
1.6.2 总黄酮含量的测定 [ 6] 分别准备吸取试液 1mL置于
10 mL的比色管中 ,用 50%的乙醇稀释定容 ,在 360 nm波长
处测定吸光度 D值 ,结果见表 4。
表 4 旱金莲中总黄酮测定的吸光度
试验号 1 2 3 4 5 6 平均值
D360 nm 0.218 0.224 0.218 0.220 0.216 0.212 0.218
将结果带入回归方程 ,计算得样品中的总黄酮含量为
5.69 mg/g。
2 结果与分析
2.1 重现性试验
按绘制标准曲线的方法 ,分别准确移取 1.0mL旱金莲提
取液 6份 ,作平行试验 ,结果见表 5。
表 5 旱金莲重现性试验结果
试验号 1 2 3 4 5 6 平均值 标准差 相对标准差(%)
D360nm 0.211 0.215 0.217 0.0.215 0.215 0.218 0.215 2.4×10-3 1.12
平均吸光度 x=0.215
标准偏差 s= ∑
6
i=1(Ai-x)2
6-1 =
∑6i=1(Ai-0.215)2
5
=
2.40×10-3
相对标准偏差 RSD(%)= sx=2.40×10
-3
0.215 =1.12
从上述结果可以看出 ,用紫外分光光度计测旱金莲中黄
酮类化合物的含量 ,标准偏差和相对标准偏差均较小 ,试验结
果重现性较好 。
—310— 江苏农业科学 2011年第 1期
2.2 测定波长的选择
精密量取芸香苷标准液 1.0 mL于 10 mL比色管中 ,用
50 g/L乙醇定容 。按波长扫描的操作方法用紫外可见分光
光度计分别对芸香苷标准溶液及样品溶液进行波长扫描 ,波
长范围为 200 ～ 700nm,扫描结果见图 6。在 360nm处有最
大吸收峰 ,故选择 360nm为测定波长 。
黄酮类化合物具有特定的紫外吸收带 ,其结构中的肉桂
酰环产生的 Ⅰ带在 300 ～ 400 nm内 ,由苯甲酰环产生的Ⅱ带
在 240 ～ 285nm内。从图 6可见 ,对照品芸香苷在这 2个吸
收带都有强吸收 。含黄酮类物质的旱金莲经一定的提取纯化
后 ,可直接于最大吸收波长处测定其吸光度 ,以芸香苷为对照
品对照计算其含量 [ 7 ] 。由于在紫外低波长区容易会有溶剂
干扰 ,可能引起误差 ,故我们选择芸香苷在 Ⅰ带的最大吸收波
长 360nm作为测量波长 。
2.3 最佳提取条件的选择
2.3.1 硼砂浓度对黄酮得率的影响 在提取时间 1 h、料液
比 1 ∶10、提取温度为 70 ℃的条件下 ,分别选用浓度 0.1%、
0.2%、0.3%、0.4%、0.5%、0.6%的硼砂水溶液 ,进行硼砂浓
度对旱金莲中黄酮类物质的得率影响的研究 ,结果见图 7。
由图 7可见 ,硼砂浓度在 0.2% ～ 0.4%之间 ,总黄酮得
率随硼砂浓度的增加而迅速提高 ,在硼砂浓度为 0.4%时达
到最大 ,硼砂浓度超过 0.4%后 ,得率随着浓度的增加反而下
降 。这是由于一些醇溶性杂质 、色素 、亲脂性强的成分溶出量
增加 ,这些成分与黄酮类化合物竞争硼砂水溶液 ,从而导致溶
出黄酮类化合物下降 。因此硼砂浓度选用以 0.4%为宜 。
2.3.2 提取温度对黄酮的影响 在提取时间 1 h、料液比
1 ∶10、硼砂浓度为 0.4%的条件下 ,分别选用提取温度为 40、
50、60、70、80 ℃,进行提取温度对旱金莲中黄酮类物质的得
率影响的研究 ,结果见图 8。可见 ,随温度升高 ,总黄酮得率
增大 ,这可能是由于黄酮类物质在水中的溶解度随温度的升
高而增大 ,同时溶液黏度降低 ,扩散速度加快的结果 。当超过
70 ℃ ,总黄酮得率下降 ,考虑到温度过高 ,杂质的溶出量也
会增加 ,提取液中的活性成分易被破坏 ,且热能消耗大 ,因此
提取温度以 70 ℃为宜 。
2.3.3 提取时间对黄酮得率的影响 在提取时间 1 h、料液
比 1 ∶10、提取温度为 70 ℃、硼砂浓度为 0.4%的条件下 ,分
别选用提取时间为 0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 h,进行提取温度对
旱金莲中黄酮类物质的得率影响的研究 ,结果见图 9。
在提取最初的 2.1 h以内 ,旱金莲总黄酮得率随时间延
长迅速提高 ,超过 1.5 h后 ,总黄酮得率提高缓慢 ,再延长时
间则开始下降 ,除水分的蒸发对黄酮类物质的溶出有一定的
不良影响外 ,还有部分原因可能是由于提取时间过长 ,降低了
某些反应的活化能 ,使原来不能自发进行的反应变得易于发
生 ,从而使黄酮分子之间 、黄酮分子与其他分子之间形成新的
化学键 ,增加分子之间碰撞机会 ,阻止黄酮分子溶出;也可能
是由于蛋白变性而沉淀在颗粒表面 ,导致黄酮类物质的得率
下降;也可能由于旱金莲中总黄酮溶液对光不稳定所致 。因
此提取时间选 1h为宜 。
2.3.4 料液比对黄酮得率的影响 称取旱金莲 10 g若干
份 ,分别加入 50、100、150、200、250 mL0.4%的硼砂水溶液 ,
提取时间 1h,提取温度 70℃,进行料液比对旱金莲中黄酮类
物质的得率影响的研究 ,结果见图 10。
对于一定量的旱金莲物料来说 ,溶剂用量的增加 ,会降低
溶剂中总黄酮的浓度 ,增大了旱金莲与溶剂两相界面的浓度
—311—蔡定建等:旱金莲中黄酮类物质的提取和测定
差 ,从而提高了传质速率 ,在一定时间内总黄酮得率增大 。当
溶剂用量增大到一定程度后 ,旱金莲中的总黄酮已大部分被
提取出来 ,再增加溶剂用量 ,总黄酮得率基本保持不变 。因此
适宜料液比为 1∶15。
2.3.5 旱金莲中黄酮提取液的稳定性 [ 8 ] 将旱金莲提取液
在室内自然光下放置 0、1、2、3、4h,再进行显色 ,测定吸光度 ,
计算黄酮得率 ,结果见图 11。从图 11可以看出 ,提取的总黄
酮溶液对光敏感 ,应尽快处理并避光保存 。
由表 6可看出 ,以提取剂对提取率的影响最大 ,各因子对
提取率影响依次为提取剂 、提取温度 、提取料液比 、提取时间 。
综合正交试验结果 ,确定最佳工艺条件为 A2B2C2D2 ,即提取
剂用 0.4%的硼砂水溶液 ,料液比 1 ∶15,提取时间 1 h,提取
温度 70℃。
表 6 从旱金莲中提取黄酮类物质的正交试验结果
因素
试验号
A:硼砂
浓度
B:料
液比
C:提取
时间
D:提取
温度
黄酮提取量
(mg/g)
1 1 1 1 1 3.154 2
2 1 2 2 2 3.656 4
3 1 3 3 3 3.056 3
4 2 1 2 3 3.432 5
5 2 2 3 1 4.266 7
6 2 3 1 2 4.334 8
7 3 1 3 2 3.396 4
8 3 2 1 3 3.278 3
9 3 3 2 1 3.756 8
k1 3.289 3.328 3.589 3.726
k2 4.011 3.734 3.615 3.796
k3 3.477 3.716 3.573 3.256
R 0.722 0.406 0.042 0.540
较好水平 A2 B2 C2 D2
因素主次顺序 1 3 4 2
2.4 方差分析
由试验数据的方差分析(表 7)可知 ,虽然 4个因素的影
响均未达显著水平 ,但相对而言 ,因素 A影响最大 ,四者的影
表 7 方差分析
变异因素 偏差平方和 自由度 F值
A 0.843 2 2.007
B 0.316 2 0.752
D 0.518 2 1.233
C 0.003(误差) 2 0.007
SSR 1.68 8
注:因素 C影响小 , 故作为方差分析的误差处理;F0.05(2, 2)=
19.00。
响大小为 A>D>B>C,与极差分析结果一致 。
3 结论
通过正交试验设计 ,确定了碱提酸析法提取旱金莲中的
黄酮类物质的最佳工艺条件 ,即提取剂用 0.4%的硼砂水溶
液 ,提取温度为 70℃,料液比 1 ∶15 ,提取时间为 1h。
在 50%的乙醇 、料液比为 1 g∶15 mL、80℃下微波提取
10 min,测得旱金莲中总黄酮化合物的含量为 5.69mg/g。
标准偏差和相对标准偏差均较小 ,试验结果重现性较好 。
方差分析与直观分析结果一致 ,所得数据准确可靠 。此法适
合旱金莲中黄酮类物质的测定 。
本试验只对旱金莲中总黄酮化合物的提取方法和工艺进
行了初步研究 ,有关提取物分离 、纯化等方面有待于进一步深
入研究 。
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