全 文 ：第 18卷　第 3 期 　　　　　　　　　　　　　　云南农业大学学报　　　　　　　 Vol.18　No.3
2003年　9月 　　　　　　　　　　Journal of Yunnan Agricultural University　　　　　 Sep.2003
枳 、富民枳与枳橙RAPD分析与分类(亲缘)关系探讨
吴兴恩1 ,范眸天1 ,高　峻1 ,李文祥1 ,龙雯虹1 ,许明辉2
(1.云南农业大学园林园艺学院 , 云南 昆明 650201;
2.云南省农业科学院生物技术研究所 ,云南 昆明 650223)
摘要:对枳 、富民枳与枳橙进行了 RAPD分析。 17个引物对 3个材料 PCR扩增得52 条谱带 , 从相似系数 、多态性
比较和聚类结果看:各材料之间具有不同的遗传距离 ,供试材料聚为 2 个类群(富民枳和枳橙聚为一群 , 枳单独
聚为一类)。从分类(亲缘)关系看:作者认为富民枳与枳橙的亲缘关系更近 , 而与枳的关系较远。
关键词:枳;富民枳;枳橙;RAPD;分类关系
中图分类号:S 666;S 33　　文献标识码:A　　文章编号:1004-390X(2003)03-0277-04
Studies on the RAPD Analysis and Taxonomic
Relationship of Trifoliate Orange ,
Fuming Trifoliate Orange and Citrange
WU Xing-en1 , FAN Mou-tian1 , GAO Jun1 , LI Wen-xiang1 , LONG Wen-hong1 ,XU Ming-hui2
(1.College of Landscape and Horticulture , Y A U , Kunming 650201 , China;
2.Biotechnology Research Institute , Yunnan Academy of Agricultural Sciences , Kunming 650223 , China)
Abstract:RAPD analysis was applied on three species of citrus(Trifoliate orange , Fuming Trifoliate orange
and Citrange).A total of 52 bands were amplified by 17 primers through PCR.The results from the similar
coefficients , polymorphic comparison and clustering analysis showed that there were different genetic dis-
tances between them.Fuming Trifoliate orange and Citrange were clustered in one group and the taxonomic
relationship was closer between them.Whereas Trifoliate orange was in another group and the taxonomic re-
lationship was farther between Fuming Trifoliate orange and Trifoliate orange.
Key words:Trifoliate orange;Fuming Trfoliate orange;Citrange;RAPD;taxonomic relationship
　　枳属(Poncitrus)为我国原产 ,仅枳(P .trifolia-
ta Raf.)一种[ 1] 。1984年丁素琴等人报道发现了一
新种富民枳(P.polyandra S.Q.Ding et al.)并把
其归入枳属当中[ 2] 。郭天池等人认为富民枳是一
个天然枳橙类型[ 3 , 4] 。范眸天等人认为富民枳是
较枳更原始的种类[ 5] 。方德秋等人认为富民枳能
以种的地位存在于枳属中[ 6～ 8] ,并且是联系枳属与
柑桔属的桥梁[ 7 ,8] 。枳橙(P.trifoliata Raf.×Cit-
rus sinensis Osb.)是枳与甜橙的天然杂种[ 9 , 10] 。从
叶类型上看 ,枳 、富民枳都为三出复叶;而枳橙在同
一树具有 3种叶型 ,有 3小叶和两小叶组成的复
叶 ,兼有单身复叶。从落叶性上看 ,枳橙为半落叶
性 ,富民枳为常绿性 ,而枳为落叶性 。从形态上看
也各有相似之处[ 1 ,11] 。
RAPD(Random Amplified Polymorphic DNA , 随
机扩增多态性 DNA)技术在构建遗传连锁图 、基因
收稿日期:2002-10-29
　基金项目:云南省教委应用基础研究基金项目(0012033)
　作者简介:吴兴恩(1971-),男 , 云南宣威市人 ,在读硕士生 , 主要从事园艺植物遗传育种研究工作。
DOI :10.16211/j.issn.1004-390x(n).2003.03.014
定位 ,演化 、分类和鉴定 ,外源染色体鉴定 ,杂交育
种和远缘杂种的早期鉴定 ,系谱鉴定 ,种质资源研
究等得到广泛应用[ 12 ～ 14] 。在柑桔类果树上已用
于柑桔 RAPD技术体系建立与体细胞杂种鉴定[ 15]
及种间杂种植物遗传变异研究[ 16] ,但尚未见用于
分类关系研究的报道 。本研究采用 RAPD技术对
枳 、富民枳 、枳橙进行了分析 ,以期探讨其分类(亲
缘)关系 、位置。
1 　材料与方法
1.1 　材料
供试材料取自云南农业大学园艺系标本圃及
云南省富民县等地的 3个种(杂种), 即:(1)枳
(Poncitrus trifoliata Raf.),(2)富民枳(P.polyan-
dra S.Q.Ding et al.),(3)枳橙(P.trifoliata Raf.
×Citrus sinensis Osb.)。
1.2 　引物
选用 OPERON公司生产的 17个引物对所有样
品进行 PCR扩增。分析所用的引物序列见表 1.
表 1 　分析所用引物序列
Tab.1　The primers alignment of analysis
编　号 序列 编号 序列
KIT OPC-06 GAA CGG ACTC KIT OPL-11 ACG ATG AGCC
　C-19 GTT GCC AGCC 　L-12 GGG CGG TACT
　E-20 AAC GGT GACC 　L-15 AAG AGA GGGG
　F-06 GGG AAT TCGG 　M-16 GAT ACC AGCC
　H-05 AGT CGT〗 CCCC 　N-07 CAG CCC AGAG
　H-06 ACG CAT CGCA 　N-15 CAG CGA CTGA
　L-01 GGC ATG ACCT 　S-413 GTC GTT CCTG
　L-05 ACG CAG GCAC 　X-03 TGG CGC AGTG
　L-10 TGG GAG ATGG
1.3 　DNA的提取与扩增
参照 CTAB 法[ 14]加以改进[ 17] ,提取柑桔嫩叶
DNA ,PCR扩增在美国 PE 公司生产的 480 型 DNA
扩增仪上进行 ,扩增反应在 25μL 体系中进行 ,其
中包含 Tris-HCl 10mmol/L ,KCl 50mmol/L ,MgCl2
0.1mmol/L , dNTP 每种 0.1 mmol/L ,BSA 4 mg/mL ,
DNA模板 25 ng ,Taq酶 2.5U ,反应混合液用石蜡油
覆盖。反应程序 94 ℃1min , 36 ℃1 min ,72 ℃2 min
一个循环;进入循环前 94 ℃预变性 3 min ,72 ℃延
伸5 min;PCR产物经1.2%琼脂凝胶(0.5×TBE缓
冲系统)电泳分离 ,在紫外台上观测照相 。
1.4 　谱带分析
供试材料在 RAPD谱带同一位点上存在时记
为1 ,不存在时记为 0.每材料两两之间进行对比 ,
按公式求出相似系数(F),即相似系数=2×两材料
共有带数/两材料总带数之和 。用 Statistic软件进
行聚类分析;用公式多态性 =(总带数 -共有带
数)/总带数 ,计算各类群间 、类群内的多态性 。
2 　结果分析
2.1 　柑桔 DNA扩增结果
图 1 　用引物L-01扩增的RAPD产物图
Fig.1　RAPD pattern amplified by primer L-01
　　注:材料编号名称见材料与方法
选用17个随机引物(10个碱基nt)对 3个样品
进行 PCR扩增 ,共扩增出了 52 条谱带 ,平均每个
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引物产生出 3.06个 RAPD片段;片段长度多集中
在564 ～ 2027 bp之间 ,各引物得到了 3个种(杂种)
的产物图 。如图 1 为 L-01 引物扩增的 RAPD产
物图谱。
图1谱带结果表明:不同引物所扩增的带数有
所差异;在供试 3个材料谱带对比中发现 ,52条谱
带中 15条为枳 、富民枳 、枳橙共有 , 19 条为枳 、富
民枳共有 ,18条为枳 、枳橙共有 ,22条为富民枳 、枳
橙共有。
2.2 　聚类分析
对3个材料的谱带进行每两种之间相似系数
的估算 ,结果见表 2.
表 2 　枳 、富民枳和枳橙之间的相似系数
Tab.2　The similar coefficients of Trifoliate orange ,
Fuming Trifoliate orange and Citrange
材料编号 1 2 3
1 1.000
2 0.635 1.000
3 0.618 0.666 1.000
从结果可看出枳 、富民枳和枳橙间相似系数值
差别不大 ,枳和枳橙的相似系数为 0.618 ,枳和富
民枳的相似系数为 0.635 , 富民枳和枳橙则为
0.666.
对17个引物的52条谱带进行聚类分析 ,绘制出
系统关系树状图(图 2),可将 3个种(杂种)聚为2个
类群:枳橙 、富民枳为一个类群;枳为一个类群。
图 2 　枳 、富民枳和枳橙的树状图
Fig.2　Tree diagram for Trifoliate orange ,
Fuming trifoliate orange and Citrange
注:材料编号名称见材料与方法
2.3 　类群间多态性比较
多态性顺序为:枳 、富民枳 、枳橙 0.712;枳 、枳
橙 0.654;枳 、富民枳 0.635;枳橙 、富民枳 0.577.
3 　讨论
柑桔类果树植物的分类十分复杂 ,在枳属植物
中富民枳的分类位置是有争议的。丁素琴等[ 2]人
1977年在云南省富民县发现并根据形态特征等把
它定为枳属的一个新种 ,学名为 P.polyandra S.
Q.Ding et al.SWINGLE[ 18]认为枳属以一个孤立状
态存在于柑桔类果树群中 ,但它与柑桔属有着千丝
万缕的联系 ,它与柑桔属之间存在着一些失去的
“环节”[ 7 ,8 , 18] 。郭天池等人[ 3] 及何天富等人[ 4] 则
认为富民枳是一个天然枳橙类型。范眸天等人[ 5]
通过对花粉形态的研究认为富民枳是较枳更为原
始的种类 。方德秋等人通过对同功酶的分析和研
究后认为富民枳能以种的地位存在于枳属中[ 6～ 8] ,
并且能部分证实 SWINGLE的推测 ,是枳属与柑桔
属之间失去的这些“环节”的一个 ,是联系枳属与柑
桔属的桥梁[ 7 ,8] 。本试验对枳 、富民枳 、枳橙进行
RAPD图谱的聚类分析 、相似系数和多态性比较:
从聚类分析结果看富民枳和枳橙聚为一类 ,而枳单
独为一类;枳 、富民枳 、枳橙的的相似系数差别不
大;从多态性看枳和枳橙的相似系数(0.654)大于
枳和富民 枳(0.635), 富民枳和枳橙 的较小
(0.577)。可否认为:富民枳与枳橙的分类(亲缘)
关系较近 ,而它与枳的关系较远 ,即富民枳与枳橙
的亲缘关系比富民枳与枳以及枳与枳橙之间的亲
缘关系更近。对于富民枳是一个天然杂交种 ,还是
独立的一个种 ,还需进一步加以验证。
[ 参　考　文　献]
[ 1] 　曾勉.对柑桔分类的认识体会和整理意见[ J] .中国
果树 , 1960 ,(2):31-32.
[ 2] 　丁素琴 ,张显努 , 暴卓然.中国枳属一新种[ J] .云南
植物研究 , 1984 , 6(3):292-293.
[ 3] 　郭天池 , 陈全有 ,叶荫明.枳 Poncirus trifoliata (L)Raf
的种质资源[ J] .中国南方果树 , 1996 ,(3):8-10.
[ 4] 　何天富.柑桔学[ M] .北京:中国农业出版社 , 1999.
[ 5] 　范眸天 ,梁明清 , 浦卫琼.富民枳与枳花粉形态与分
类位置探讨[ J] .云南农业大学学报 , 1998 , 13(3):298
-300.
[ 6] 　方德秋,章文才 ,肖元顺.柑桔同工酶及其在分类地位中
应用的研究[ J] .植物学报 , 1994 , 26(增刊):124-138.
279第 3期　　　　　　吴兴恩 ,等:枳 、富民枳与枳橙 RAPD分析与分类(亲缘)关系探讨
[ 7] 　方德秋,章文才 ,肖元顺.应用同工酶进行柑桔分类和进
化研究[ J] .植物分类学报, 1993 ,31(4):329-352.
[ 8] 　FANG DEQIU.Intra and Intergeneric Realationships of Pronci-
tus Polyandra-Investigation by leaf Isozymes[ J] .Journal of
Wuhan Botanical Research , 1993 , 11(1):34-40.
[ 9] 　俞德浚.中国果树分类学[ M] .北京:农业出版社 ,
1979.
[ 10] 　华南农业大学主编.果树栽培学南方本各论(第二
版)[ M] .北京:农业出版社 , 1993.
[ 11] 　钟瑞芳 , 王仕玉 , 梁明清 , 等.富民枳的生物学特性
及利用价值研究初报[ J] .云南农业大学学报 , 2001 ,
16(3):244-246.
[ 12] 　李发芳 , 罗正荣 ,蔡礼鸿.RAPD 及其在果树中的应
用[ J] .果树科学 , 1998 , 15(3):256-260.
[ 13] 　彭建营 , 束怀瑞 ,孙仲序.中国枣种质资源的 RAPD
分析 [ J] .园艺学报 , 2000 , 27(3):171-176.
[ 14] 　沈德绪 , 王元裕 , 陈力耕 ,等.柑桔遗传育种学[ M] .
北京:中国农业出版社 , 1998.
[ 15] 　史永忠 ,郭文武 , 邓秀新.柑桔 RAPD 体系建立与体
细胞杂种鉴定[ J] .园艺学报 , 1998 , 25(2):105-110.
[ 16] 　史永忠 , 邓秀新.柑桔种间体细胞杂种植株遗传变
异研究[ J] .园艺学报 , 1999 , 26(1):19-22.
[ 17] 　高峻 ,蔡新 , 许明辉.云南茶树 DNA 提取和 RAPD分
子标记初探[ J] .云南农业大学学报 , 2000 , 15(2):
126-128.
[ 18] 　SWINGLE W T , REECE P C.The Botany of Citrus and
itsWild Relative[ A] .In:Recuther W., L.D.Batchor
and H.J.Webber (eds).The Citrus Industry , Ⅰ [ C] .
Berkeley:Calif.Univ.Press.1967 , 190-430.
(上接第 276页)
　　(3)Mushroom cleanness from the peat-based cas-
ing and Terra-Care casing 1 and 3 was not significantly
different.These treatments produced cleaner mushrooms
than Terra-Care casing 2 and 4.
(4)Mushroom yield and cleanness from Terra-Care
casing were not significantly affected by lime source
(chalk or sugar beet lime )or rate [ 10% or 20%(V/
V)] .
(5)The conductivities of Terra-Care 3 and 4 were
higher than that of materials 1 and 2 and this may have
caused the lower yield from these treatments.
In a word , the Terra-Care material 1and 2 can sub-
stitute peat-based casing for mushroom culture casing ,
and mushroom yield and cleanness from Terra-Care cas-
ing were not significantly affected by lime source (chalk
or sugar beet lime )or rate [ 10% or 20%(V/V)]
[ Reference]
[ 1] 　ANON T.Recommendations for peat for horticultural and
landscape use[ M] .BS4156.British Standards Institute ,
London , 1990.
[ 2] 　EDWARDS R L, FLEGG P B.Experiments with artificial
mixtures for casing mushroom beds[ J] .Mushroom Science ,
1953 , 2 , 143-149.
[ 3] 　FLEGG P B , WOOD D A.Growth and fruiting[ A] .In The
Biology and Technology of the Cultivated Mushroom[ C] .
Eds.P.B.Flegg , D.M.Spencer , D.A.Wood.John
Wiley &Sons Ltd., Chichester , UK.1985 , 141-177
[ 4] 　MONTAGNE C , RUDDELL J , FERGUSON H.Water re-
tention of soft siltstone fragments in a Ustic Torriorthent ,
Central Montana[ J] .Soil Sci.Soc.Am.J., 1992 , 56 ,
555-557.
[ 5] 　NONLE R , GAZE RH.Properties of casing peat types and
additives and their influence on mushroom yield and quality
[ J] .Mushroom Sci., 1995 , 14 , 305-312.
[ 6] 　VISSCHER H R.Casing soil[ A] .In The Cultivation of
Mushroom[ C] .Ed.L.J.L.D.van Griensven.Darling-
ton Mushroom Laboratories , Sussex.UK.1988 , 73-89
[ 7] 　WALLER P L , HARRISON A M.Etimation of pore space
and the calculation of air volume in horticultural substrates
[ J] .Acta Horticulturae , 1991 , 294 , 29-39.
280 云南农业大学学报 　　　　　　　　　　　　　　第18卷