全 文 ：第 35卷 第 6期 江西师范大学学报(自然科学版) Vol. 35 No.6
2011年 11月 JOURNAL OF JIANGXI NORMAL UNIVERSITY (NATURAL SCIENCE) Nov. 2011

收稿日期: 2011-05-10
基金项目: 国家自然科学基金(30660020)和江西省科技支撑计划[赣财教 2007(173)]资助项目.
作者简介: 涂艺声(1957-), 女, 江西奉新人, 教授, 主要从事植物生物技术与资源保护方面的研究.

文章编号: 1000-5862(2011)06-0579-04
成年态南丰蜜橘离体再生芽培养及芽维持的蛋白谱特征
彭先全1, 涂艺声1*, 丁明华1, 李跃进2, 张志强2
(1. 江西师范大学生命科学学院, 江西 南昌 330022; 2. 南丰县蜜橘良种繁育公司, 江西 南丰 344511)
摘要: 以成年态南丰蜜橘茎段为材料, 在不同激素配比的 MS 培养基中进行再生芽的诱导和继代增殖培养,
确定了最佳的诱导培养基改良 MS+6-BA0.5 mg/L +KT0.5 mg/L + NAA0.1 mg/L, 把诱导培养基中的蔗糖浓
度由 3%提高到 6%可以很好地解决再生芽的叶片发黄、脱落问题 ; 再生芽增殖的最佳培养基为改良
MS+6-BA0.4 mg/L+ZT0.1 mg/L+NAA0.05 mg/L, 增殖系数达 5.40. SDS-PAGE电泳结果表明 33.4 kD相对分子
质量的蛋白谱带出现于再生芽正常分化生长时期, 可能是维持再生芽生长发育的特异蛋白组分.
关键词: 成年茎段; 南丰蜜橘; 再生芽; 离体培养; SDS-PAGE
中图分类号: Q 944 文献标识码: A
柑橘(Citrus)为世界主要果树之一, 中国柑橘种植
面积广, 品种多, 产量高, 具有重要的经济价值[1-2].
南丰蜜橘(Citrus reticulita Blanco)是江西的传统地
方特色品种, 原产于江西省南丰县, 其色泽金黄、皮
薄核少、汁多肉嫩、甜酸适口、风味浓郁、营养丰
富, 是我国优良的宽皮柑橘良种之一[3-4].
柑橘成年态茎段的培养技术体系是柑橘脱毒、
种质资源离体保存及遗传转化等各项研究的基础 .
以成年态茎段离体培养的再生植株可以克服童期长
的问题, 但其培养体系的不成熟, 严重制约了柑橘
生产中相关生物技术的应用[5-7]. 南丰蜜橘离体继代
培育过程中易伴随芽的愈伤化、脱落, 这些形态学
变化必然源于基因表达的产物—— 蛋白质的定性或
定量的变化. 目前, 关于南丰蜜橘此方面的研究报
道甚少. 为此, 本文研究了南丰蜜橘离体再生芽的
培养及不同培养时期离体培养物中可溶性蛋白图谱,
以期解决成年态南丰蜜橘离体再生芽的愈伤问题 ,
同时为进一步研究柑橘离体培养过程中体内的生理
变化机制提供有价值的参考.
1 材料与方法
1.1 材料
本研究选取江西南丰县蜜橘良种繁育公司母本
园的南丰蜜橘“杨小-26”品系, 以成年树的新抽生梢
为试验材料.
1.2 方法
1.2.1 材料的处理 于秋季选取成年树上 10~15 cm
且长势一致的新抽生梢, 流水冲洗 30 min, 去除叶
片, 用 0.1%洗衣粉溶液浸泡 10 min, 毛笔轻刷表面,
自来水清洗干净, 剪成 3 cm左右的小段, 于超净工
作台上先用 70%酒精消毒 30 s, 无菌水冲洗 2 次,
再用 0.1%升汞消毒 10 min[8-9], 无菌水冲洗 5~6 次
后备用.
1.2.2 再生芽诱导培养 将表面消毒后的材料置于
超净工作台无菌条件下剪成约 1 cm长节段的外植体,
接种于改良 MS(1 mg/LVB1、质量分数为 6%的蔗糖)
为基本培养基附加 0.1 mg/L NAA和不同浓度 6-BA、
KT、ZT的诱导培养基中. 接种后置于培养箱中培养,
培养条件为相对湿度 70%、(26±1) ℃、1 500~2 000 lx、
15 h⁄d. 诱导培养期间注意及时排除污染, 同时观察
腋芽诱导情况及腋芽平均高度, 5周后统计腋芽萌发
率. 萌发率=(萌发外植体数/去除污染的接种外植体
数)×100%.
1.2.3 培养基中不同蔗糖浓度对诱导再生芽的效
果 将一批经消毒处理的材料接种于MS+BA0.5 mg/L+
KT0.5 mg/L+NAA0.1 mg/L 附加不同质量浓度的蔗
糖(分别为 3%、4.5%、6%、7.5%、9%)的诱导培养
基中, 如上培养 5 周后, 统计萌发率和每段丛芽萌
发数.
DOI:10.16357/j.cnki.issn1000-5862.2011.06.006
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1.2.4 再生芽继代增殖培养 诱导培养 5 周后, 将
茎段转接于附加不同浓度 BA(0.1、0.2、0.4 mg/L)、
ZT(0.1、0.5、1.0 mg/L)、NAA(0、0.025、0.050 mg/L)
正交设计的改良MS培养基中, 每隔 5周继代 1次,
并在继代培养过程中逐步除去老茎段组织. 继代培
养期间, 每隔5周统计腋芽增殖系数, 观察腋芽和增
殖芽的生长情况.
1.2.5 再生芽可溶性蛋白的提取及电泳 可溶性蛋
白的提取参照谷瑞升[10-11]报道的 Tris-HCl 法, 在培
养的第 13 天准确称取 0.25 g 无芽的“杨小-26”, 第
25天准确称取 0.25 g有芽且生长良好与初显愈伤的
“杨小-26”茎段, 提取其蛋白质, 利用 sds-page 电泳
探索芽维持的特异蛋白 . 电泳按彭先全等 [12]方法 ,
电泳结束后用 0.1%考马斯亮蓝 R-250 染色液(0.1%
考马斯亮蓝 R-250,50%甲醇, 10%冰乙酸)染色, 后用
脱色液(5%甲醇, 7%冰乙酸)脱至条带清晰, 利用标
准蛋白曲线计算特异蛋白的相对分子质量[13].
2 结果与分析
2.1 不同激素组合对成年态南丰蜜橘离体再生芽
诱导分化的影响
将消毒处理后的材料接种于附加以下10种激素
组合的改良MS(1 mg/L VB1、质量分数为 6%的蔗糖)
诱导培养基中培养, 大约 5 d 后, 将开始出现污染,
此时需及时将未污染的材料转出, 直到污染不再出
现为止. 5周后随机各选取 50段未污染外植体, 统计
萌动段数, 计算分化率. 试验结果表明成年态南丰
蜜橘离体再生芽的诱导需 6-BA 和 NAA 的参加, 且
NAA的浓度以 0.1 mg/L、6-BA以 0.5 mg/L为宜, 此
时诱导率大约在 60%以上. 试验中还发现以上培养
基中再加入 0.5 mg/L的KT, 诱导率最高, 达 86%, 且
生长健壮. 因此成年态南丰蜜橘离体再生芽的最佳
诱导培养基为改良 MS+6-BA0.5 mg/L+KT0.5 mg/L +
NAA0.1 mg/L(见表 1和图 1(A)).

表 1 不同激素组合对成年态南丰蜜橘离体再生芽的分化效果
序号 激素配方/(mg⋅L−1) 外植体段数/块 腋芽萌动段数/块 分化率/%
1 6-BA2+NAA0.1 50 0 0d
2 6-BA1+NAA0.1 50 0 0d
3 6-BA0.5+NAA0.1 50 32 64b
4 6-BA0.25+NAA0.1 50 34 68b
5 6-BA0.5+ZT2+ NAA0.1 50 0 0d
6 6-BA0.5+ZT1+ NAA0.1 50 2 4d
7 6-BA0.5+ZT0.5+ NAA0.1 50 10 20c
8 6-BA0.5+KT1+ NAA0.1 50 11 22c
9 6-BA0.5+KT0.5+ NAA0.1 50 43 86a
10 6-BA0.5+KT0.1+ NAA0.1 50 38 76b
注: a、b、c表示邓肯氏新复极差法检验在 0.05水平上差异有统计学意义.

2.2 培养基不同蔗糖用量对再生芽诱导的影响
在南丰蜜橘茎段接到上述激素配比的 MS(蔗糖
质量分数为 3%)诱导培养基中, 大约2周后开始有腋
芽的萌发, 而到 25 d 左右, 腋芽会逐渐出现叶片发
黄并掉落, 甚至死亡的现象. 尝试转到新的培养基,
以及调节培养基的矿质元素和激素浓度均无效果 .
然而提高蔗糖浓度, 很好地解决了上述问题. 结果
表明, 南丰蜜橘茎段诱导培养中对蔗糖的消耗比较
多, 提高蔗糖浓度对再生芽的生长非常重要, 但蔗
糖浓度过高, 由于渗透压过大, 会出现丛芽偏少、叶
片卷曲现象, 因此在诱导培养基中添加质量分数为
6%的蔗糖最为适宜(见表 2).
2.3 不同激素组合对南丰蜜橘离体再生芽增殖的
影响
培养 5 周后, 将茎段转接到 L1~L9培养基中, 5
周后对正交设计的结果进行极差和方差分析, 结果
见表 3. 极差分析与方差分析也表明 6-BA 对芽的
增殖有显著影响 . 当在 MS 基本培养基中添加
6-BA0.4 mg/L+ZT0.1 mg/L+NAA0.05 mg/L时离体再
生芽平均增殖数最高, 达 5.40, 且芽生长健壮. 后
期实验中还发现当再次提高 6-BA 和 NAA 浓度时,
增殖芽又开始出现愈伤现象, 这可能是其芽内已有
一定水平的内源激素, 过高的外源激素易导致其愈
伤 , 不添加任何外源激素 , 再生芽也可增殖 , 同时
也说明了这一点. 因此南丰蜜橘离体再生芽增殖的
最佳培养基为改良 MS+6-BA0.4 mg/L+ZT0.1 mg/L+
NAA0.05 mg/L(见表 3和图 1(B)).
2.4 成年态南丰蜜橘离体再生芽的可溶性蛋白电
泳图谱
取不同材料与不同生理发育状态的成年态南丰

第 6期 彭先全, 等: 成年态南丰蜜橘离体再生芽培养及芽维持的蛋白谱特征 581



表2 培养基中不同蔗糖用量对再生芽诱导效果的影响
蔗糖用量/(g⋅L−1) 茎段腋芽萌动率/% 每块丛芽发生数/个 芽生长情况
30 22 3.8±0.2b 丛芽尚可, 芽茎紧缩, 叶发育不正常
45 70 4.5±1.1a 丛芽多, 芽茎伸长较好, 叶展开慢
60 84 4.7±1.3a 丛芽多, 芽茎伸长好, 叶正常展开
75 64 3.2±0.6c 丛芽偏少, 芽茎伸长较快, 叶片稍有卷曲
90 36 2.8±0.5c 丛芽少, 芽茎难伸长, 叶展开不正常
注: a、b、c表示邓肯氏新复极差法检验在 0.05水平上差异有统计学意义.

表 3 不同激素组合对南丰蜜橘离体再生芽增殖系数的影响
培养基类型 6-BA /(mg⋅L−1) ZT /(mg⋅L−1) NAA/(mg⋅L−1) 增殖系数
L1 1(0.1) 1 (0.1) 1(0) 3.33
L2 1 2(0.5) 2(0.025) 3.23
L3 1 3(1.0) 3(0.05) 4.02
L4 2(0.2) 1 2 4.54
L5 2 2 3 4.59
L6 2 3 1 3.98
L7 3(0.4) 1 3 5.40
L8 3 2 1 4.67
L9 3 3 2 4.40
水平 1 3.527 4.257 3.933
水平 2 4.203 4.163 3.890
水平 3 4.823 4.133 4.670 误差
极差 R 1.296 0.124 0.780
SS 2.623 638 0.153 939 0.844 460 3.764 309 0.142 272
Df 2 2 2 8 2
MS 1.311 819 0.076 970 0.422 230 0.470 539 0.071 136
F 18.440 950 1.082 002 5.935 515


A: 初代诱导培养, B: 继代增殖培养.

图 1 成年态南丰蜜橘离体再生芽培养

蜜橘培养物进行可溶性蛋白 SDS-PAGE电泳, 结果表
明(见图 2)成年态柑橘茎段离体培养不同阶段表达的
蛋白是有差异的, 腋芽分化生长期, 蛋白图谱差异明
显, 出现约为 33.4 kD 的蛋白带, 而前期无芽分化的
培养物中没有此蛋白, 并且再生芽后期出现愈伤的培
养物中该蛋白组分的电泳条带亦不清晰, 可能是再生
芽愈伤化时, 其内部蛋白组分发生了代谢改变. 说明
该差异蛋白组分(图 2 中箭头 1 所示)与再生芽的维持
生长有关, 进一步回收提纯该蛋白组分, 对照标准相
对分子质量蛋白电泳(见图3), 依据迁移率标准曲线换
算[11]得出差异蛋白组分的相对分子质量约为 33.4 kD,
其功能有待于氨基酸测序后进一步研究.


1. 标准蛋白 marker; 2. 杨小-26 培养 13 d无芽材料; 3. 杨小-26
培养 25 d分化的芽; 4. 杨小-26 培养 25 d愈伤化材料; 5. 甜柚
组培芽; 6. 草莓组培芽.

图 2 不同培养材料与成年态南丰蜜橘再生芽的可溶性蛋
白质 SDS-PAGE 图谱对照

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1. 低相对分子质量蛋白 marker; 2. 牛血清蛋白(5mg/mL); 3. 纯
化后的上清液中的蛋白; 4. 纯化后胶中提取余留的蛋白; 5. 纯
化前的蛋白条带; 6. 牛血清蛋白(10mg/mL).

图 3 纯化回收成年态南丰蜜橘再生芽体差异蛋白组分
的 SDS-PAGE


3 结论
在成年态南丰蜜橘离体再生芽的诱导过程中
需添加适宜的 6-BA、KT和 NAA, 研究表明成年态
南丰蜜橘离体再生芽的最佳诱导培养基为改良
MS+6-BA0.5 mg/L +KT0.5 mg/L + NAA0.1 mg/L,
诱导率可达 86%. 诱导培养过程中把培养基中的蔗
糖质量分数由 3%提高到 6%可以很好地解决再生芽
的叶片发黄、脱落问题. 5 周后将诱导的腋芽采取逐
步去除老组织的方法转入改良 MS+6-BA0.4 mg/L+
ZT0.1 mg/L+NAA0.05 mg/L继代增殖培养基中, 离
体再生芽平均增殖数达 5.40, 且芽生长健壮. 不同阶
段和不同生长状态的成年态南丰蜜橘茎段可溶性蛋
白电泳表明 33.4 kD的蛋白可能是维持再生芽正常生
长的特异蛋白组分, 其具体功能有待于进一步研究.
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The Study on Mature Citrus reticulita Blanco Regeneration Buds Culture
in Vitro and Protein Spectral Characteristics of Buds Maintained
PENG Xian-quan1, TU Yi-sheng1*, DING Ming-hua1, LI Yue-jin2, ZHANG Zhi-qiang2
(1. College of Life Sciences, Jiangxi Normal University, Nanchang Jiangxi 330022, China; 2. Orange Seed
Breeding Company of Nanfeng County, Nanfeng Jiangxi 344511, China)
Abstract: In this paper, the mature stem segments of Citrus reticulita Blanco were used as explants for buds in-
duction and subculture culture on medium with different hormone combinations .The results showed that the best
induction medium is improvement MS+6-BA0.5 mg/L +KT0.5 mg/L + NAA0.1 mg/L. The induction medium of
sucrose concentration from 3% to 6% can solve the leaves of buds yellow, shedding problems; subculture prolif-
eration medium of buds is improvement MS+6-BA0.4 mg/L+ZT0.1 mg/L+NAA0.05 mg/L. Proliferation of multi-
ple was 5.40. The results of SDS-PAGE show that 33.4kD protein is only expression in the period of the buds begin
to normal growth. It probably the specific protein of buds maintained for normal growth.
Key words: mature stem segment; Citrus reticulita Blanco; regeneration bud; in vitro cultivation; SDS-PAGE
(责任编辑: 刘显亮)