全 文 ：2016 年第 57 卷第 1 期 65
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表 2 4 个番茄品种的商品性状与产量表现
品种 株型 生长势 果形 果色 青肩 硬度 纵径 /横径 产量 / (t·hm －2)
钱塘红宝 无限生长 强 扁圆 大红 无 硬 0. 627 83. 98 a
钱塘明珠 无限生长 强 扁圆 大红 无 硬 0. 628 66. 15 b
钱塘旭日 无限生长 强 近圆 大红 无 硬 0. 844 69. 14 b
倍盈 (CK) 无限生长 强 扁圆 大红 无 硬 0. 617 68. 80 b
注:产量后无相同小写英文字母，表示其差异达显著水平。
3 小结
试验结果表明，4个番茄品种均适宜舟山地区越
冬种植，生长势强，果实硬度好，耐贮运，其中钱塘
红宝早熟性好，从播种到始收历时 154 d，采收期最
长，为 121 d，产量也最高，达到 83. 98 t·hm －2。
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(责任编辑:张才德)
收稿日期:2015-11-12
基金项目:高等学校博士学科点专项科研基金 (20130146110020)
作者简介:颜廷帅 (1989 －) ，男，山东临沂人，硕士，从事果树方面的研究工作，E-mail:yantingshuai@ kingenta. com。
文献著录格式:颜廷帅，罗庆，潘志勇，等． 柑橘砧木枳橙和香橙 BOR2 基因的克隆与缺硼胁迫下的表达分析 ［J］． 浙江农业科学，2016，
57 (1) :65-68．
DOI:10. 16178 / j. issn. 0528-9017. 20160125
柑橘砧木枳橙和香橙 BOR2 基因的克隆与
缺硼胁迫下的表达分析
颜廷帅1，2，罗 庆1，潘志勇1，刘永忠1，彭抒昂1
(1. 华中农业大学 园艺植物生物学教育部重点实验室，湖北 武汉 430070;
2. 金正大生态工程集团股份有限公司 国家缓控释肥工程技术研究中心，山东 临沭 276700)
摘 要:以耐缺硼胁迫的枳橙 (Citrus sinensis (L．)Osb． × Poncirus trifoliata (L．)Raf．)和不耐缺硼胁迫的
香橙 (Citrus junos Sieb． ex Tanaka)为材料，克隆了拟南芥硼运输基因 AtBOR2 的同源基因枳橙 CpBOR2 和香橙
CjBOR2，进行相关生物信息学分析和缺硼胁迫下的表达分析。结果表明，CpBOR2 和 CjBOR2 的 ORF长度分别为
2 133 bp和 2 073 bp，CpBOR2 和 CjBOR2 蛋白都具有 7 个跨膜区域，且具有细胞膜极性定位和内吞降解的保守氨
基酸位点;缺硼胁迫下，CjBOR2 表达量与对照相比无显著变化，在前期降低，后期升高。
关键词:枳橙;香橙;BOR2;缺硼;克隆;qPCR
中图分类号:S666 文献标志码:A 文章编号:0528-9017(2016)01-0065-04
我国柑橘主产区主要位于南方多雨的山地丘陵
地区，土壤多为酸性的红黄壤，土壤状况较差，同
时南方湿润多雨，硼酸极易因淋溶作用而流失，因
此土壤缺硼的现象较普遍［1 － 2］。土壤缺硼易造成柑
橘老叶叶脉木栓化，树势早衰，果实产量和品质下
降，使产区农民遭受严重的经济损失［3］。
柑橘树体主要通过砧木根系吸收和转运硼，不
同的砧木可以影响树体的营养状况［4］。目前柑橘
砧木吸收和运输硼的机制还不清楚，最近在模式植
物拟南芥中发现 AtBOR2 在缺硼胁迫下硼的转运过
程中有重要作用:AtBOR2 定位于根部，转运共质
体的硼到质外体，促进细胞壁硼糖复合物的形成，
从而保证根部延长区细胞的正常伸长和硼向地上部
的转运，缺硼胁迫下 AtBOR2 表达量上升［5］。而柑
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橘砧木中 AtBOR2 的同源基因在缺硼胁迫下的作用
目前还不清楚，为了确定缺硼胁迫下不同柑橘砧木
中 AtBOR2 的同源基因表达量的变化，本试验所用
材料为耐缺硼胁迫的柑橘砧木枳橙和不耐缺硼胁迫
的柑橘砧木香橙［6］，克隆枳橙 CpBOR2 和香橙
CjBOR2，并在缺硼胁迫下对水培条件下的枳橙和
香橙进行缺硼胁迫处理，通过 qPCR 技术，测定
CpBOR2 和 CjBOR2 表达量的变化，为进一步确定
柑橘吸收和转运硼的机制奠定基础。
1 材料与方法
1. 1 材料
试验材料为生长 3 个月的枳橙和香橙幼苗。
选取长势一致的枳橙和香橙幼苗转入 1 /2
Hoagland和 Aron (全浓度)溶液培养，每 2 h 通
气 15 min，在光周期为 16 h /8 h (L /D)和昼夜温
差为 28 ℃ /22 ℃的条件下，每 7 d 更换一次营养
液。待枳橙和香橙幼苗长出新根后分别随机分为两
组，分别移入含有 0 mg·L －1 (缺硼)和 0. 25 mg·
L －1 (对照)的 1 /2 Hoagland和 Aron (全浓度)溶
液培养 0 h，4 h，8 h，1 d，2 d，3 d 后采样，采
样部位分别为根、茎和叶，迅速置于液氮速冻，储
存于超低温冰箱 (－ 80 ℃)备用。
1. 2 方法
1. 2. 1 CpBOR2 和 CjBOR2 的克隆
总 RNA的提取按照 Trizol 试剂盒 (Ambion 公
司)说明书进行。第一链 cDNA 的合成按照
PrimeScript RT reagent Kit (Perfect Real Time)试剂
盒 (TaKaRa 公 司)说 明 书 进 行。以 CsBOR2
(orange1. 1 t01735. 1)转录本序列为模板设计一对
引物 BOR2-F:CAGAACAATGGAAGAAAC 和 BOR2-
R: CTCCTGGAAAGTAGATAGATC， 以 第 一 链
cDNA为模板进行 PCR 扩增，扩增产物回收、纯
化，连接 pMD18-T 载体 (TaKaRa 公司) ，转化大
肠杆菌 DH5α 感受态细胞，筛选阳性克隆进行
测序。
1. 2. 2 生物信息学分析
生物信息学分析使用一系列在线服务工具和软
件，使用 ORF Finder 预测 ORF 区域 (http: / /
www. ncbi. nlm. nih. gov /gorf /gorf. html)，使用 TMHMM
Server (http: / /www. cbs. dtu. dk /services /TMHMM/)
预测蛋白质跨膜区域，使用 ClustalW2 (http: / /
www. ebi. ac. uk /Tools /msa /clustalw2 /)进行蛋白质
多序列比对和一致性分析，使用 MEGA 5. 0 软件的
Neighbor-Joining算法构建蛋白质系统进化树［7-8］。
1. 2. 3 基因表达分析
以 β-Actin 为内参基因，定量引物为 Actin-F:
CCAAGCAGCATGAAGATCAA 和 Actin-R:ATCTGC
TGGAAGGTGCTGAG［9］。以测序所得基因转录本保
守序列为模板，设计一对引物 qBOR2-F:ATTCT
GCCCAAGTTTTTC和 qBOR2-R:GCACCCATCTGTG
TCTCT，以稀释 5 倍的样品 cDNA 为 qPCR 反应的
底物，按 照 SYBR Premix Ex Taq Ⅱ 试 剂 盒
(TaKaRa 公司)说明书进行反应，每个样品的
cDNA 扩增反应进行 4 次独立重复，利用 SPSS
16. 0 中 Duncan’s多重比较对结果进行显著性分析
(P ＜ 0. 05)。
2 结果与分析
2. 1 CpBOR2 和 CjBOR2 的克隆与测序
CpBOR2 和 CjBOR2 的 PCR 扩增产物的电泳如
图 1，片段大小 2 000 ～ 3 000 bp。对 CpBOR2 和
CjBOR2 测序结果进行 ORF 预测发现 ORF 长度分
别为 2 133 和 2 073 bp。与甜橙数据库 CsBOR2
(orange1. 1t01735)的 ORF 序列进行相似性比对，
相似性分别为 99%和 99%，从而确定所克隆序列
为目的序列。
M表示 Marker，1表示 CpBOR2 PCR产物，2表示 CjBOR2 PCR产物
图 1 CpBOR2 和 CjBOR2 的 PCR扩增产物电泳图
2. 2 CpBOR2 和 CjBOR2 的生物信息学分析
CpBOR2，CjBOR2 和 CsBOR2 的多序列氨基酸
比对和跨膜区域预测表明 (图 2) ，CpBOR2 和
CjBOR2 都具有 7 个跨膜区域，CpBOR2 和 CjBOR2
都具有与 AtBOR1 相同的保守酪氨酸 (Y)位点和
赖氨酸 (K)位点［10-11］，其中 CpBOR2 在第 41 ～
60 bp处比 CjBOR2 多出 20 bp。
构建 CpBOR2 和 CjBOR2 蛋白与其他植物
BOR2 蛋白的进化树 (图 3)表明，CpBOR2 和
CjBOR2 蛋白与甜橙 CsBOR2 蛋白的进化关系最近，
颜廷帅，等:柑橘砧木枳橙和香橙 BOR2 基因的克隆与缺硼胁迫下的表达分析 67
黑框所示为蛋白质跨膜区域，星号所示为保守酪氨酸位点，箭头所示为保守赖氨酸位点
图 2 枳橙 CpBOR2、香橙 CjBOR2 和甜橙 CsBOR2 蛋白氨基酸多序列比对和跨膜区域预测
所用序列的登录号为 AtBOR2 (NP_ 191786) ，OsBOR2 (DQ421408) ，
CsBOR2 (orange1. 1 t01735. 1) ，VvBOR2 (XP_ 002272575)
图 3 CpBOR2 和 CjBOR2 蛋白与其他植物
BOR2 蛋白的进化树分析
其次与同为多年生双子叶植物的葡萄 VvBOR2 进
化距离较近，与水稻 OsBOR2 蛋白的进化距离
最远。
2. 3 CpBOR2 和 CjBOR2 在缺硼胁迫下的表达
模式
为了确定 CpBOR2 和 CjBOR2 的表达情况，本
试验用 qPCR方法测定了 2 个基因在缺硼胁迫下各
个时期的表达量 (图 4)。缺硼胁迫下，CjBOR2 相
对于对照无显著变化;CpBOR2 在前期表达量显著
下降，8 h时最低，仅为对照的 0. 24 倍，后期表达
量上升，48 h 时最高，为对照的 5. 76 倍，且正常
硼浓度下 CpBOR2 的表达量变化也较 CjBOR2 表达
量变化剧烈。
3 讨论
缺硼是我国南方柑橘产区常见的现象，严重影
响南方柑橘产业的发展。最近发现拟南芥 AtBOR2
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A表示缺硼胁迫下根中 CjBOR2 表达量变化，B表示根中 CpBOR2 在缺硼胁迫下表达量变化
图 4 缺硼胁迫下根中 CpBOR2 和 CjBOR2 表达量的变化
可以应对一定程度的缺硼胁迫。柑橘为嫁接栽培，
主要通过砧木根系吸收和转运硼到地上部，本试验
以耐缺硼的砧木品种枳橙和不耐缺硼的砧木香橙为
材料，克隆了 AtBOR2 的同源基因 CpBOR2 和
CjBOR2，进行了相关生物信息学分析和缺硼胁迫
下的表达分析。
CjBOR2 较 CpBOR2 的氨基酸序列在 N 端缺失
了 20 bp，表明它们的蛋白质的功能可能出现了差
别。缺硼胁迫下耐缺硼胁迫的枳橙 CpBOR2 表达量
剧烈变化，响应缺硼胁迫，不耐缺硼的香橙
CjBOR2 的表达量与对照相比无显著变化，不响应
缺硼胁迫，表明 CpBOR2 在缺硼胁迫条件下可能参
与体内硼酸的运输从而调节体内硼浓度，而
CjBOR2 在香橙缺硼胁迫条件下的作用则不明显，
且正常情况下，CpBOR2 表达量的变化较 CjBOR2
更加剧烈。缺硼胁迫下 CjBOR2 与 CpBOR2 对植物
体内硼酸浓度调节能力的差异可能是造成 2 种砧木
耐缺硼能力的差异的原因之一。
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(责任编辑:张 韵)