全 文 ：　中国南方果树　2011;40(3):1～ 5 , 10
研究报告 ·柑桔类果树·
资阳香橙根 cDNA全长文库的构建及 EST分析
王金萍1 , 2 , 3 ,宋二玲1 , 2 ,3 ,姚利晓2 , 3 ,李凤龙1 , 2 , 3 ,何永睿2 , 3 ,陈善春2 , 3
(1 西南大学园艺园林学院, 重庆 , 400716;2 西南大学柑桔研究所;3国家柑桔品种改良中心)
摘　要:以资阳香橙根 RNA为材料 ,采用 SMART 技术构建了 cDNA 全长文库 , 并对其质量进行
鉴定。结果显示 ,该文库的库容量为 4.8×105 pfu/ mL , 重组率为 93%,文库插入片段大小主要集
中在 0.5 ～ 1.0 kb。从文库中随机挑取 450 个克隆进行 5′端单向测序 ,去除载体序列及低质量的序
列后 ,共获得有效长度大于 150 bp 的高质量 ESTs(expressed sequence tag s)序列 438 条 , 利用 Bi-
oEdit软件对有效 EST S序列进行片段重叠群分析和拼接后 , 获得 251 个独立基因(Unigene s),其中
包括 87 个片段重叠群(Contig s)和 164 个独立的 ESTs (Singlets);通过与 NCBI 的非冗余核酸数
据库进行 tBLASTx 比对 ,初步确定已知功能基因 146 个 , 未知功能基因 91 个 , 另有 14 个 unigene
未与数据库中序列匹配。该研究为进一步分离克隆资阳香橙根部功能基因奠定了基础。
关键词:cDNA 文库;根;资阳香橙;表达序列标签;测序
中图分类号:S 666.4　　文献标志码:A　　文章编号:1007-1431(2011)03-0001-06
Construction of a Full-length cDNA Library from Roots of
Ziyang Xiangcheng (Citrus junos)and a Catalogue of the
Expressed Sequence Tags in Roots
WANG Jin-ping , SONG Er-ling , YAO Li-xiao , LI Feng-lo ng , HE Yong-rui ,
CHEN Shan-chun
(1 College of H ort icul tu re &Landscape Archi tectu re , S ou thwest University , Chongqing , 400716;2 Ci t rus Re-
search Ins titute , Sou thw est University;3 National Cit ru s Cu ltivar Improvement C enter of C hina)
Abstract:A full-leng th cDNA libra ry w as constructed f rom the roo t tissue s of Ziyang Xiangcheng
(Citrus junos)by using SMART techno lo gy and the quality of the librar y was evaluated.The results
showed tha t the titer o f the libra ry w as 4.8×105 pfu· mL-1 w ith a recombination rate o f 93%.
The inse rt size s o f the libra ry we re betw een 0.5 and 1.0 kb.Four hundred and fifty clone s we re
randomly sequenced fr om the 5-termina ls of the inserts and 438 expressed sequence tags w ere thus
obtained.Contig s w ere a ssembled using BioEdit sof tw are and a total o f 251 unig enes were finally
obtained.These unigenes included 87 contig s and 164 singlets.A tBLAS Tx search against NCBI
non-redundant nucleic acid databa se identified 146 gene s with known functions , 91 w ithout know n
functions , and 14 without a match in the databa se.The results should facilitate the cloning and
functional analy sis o f genes f rom the ro o ts of Ziyang j unos.
Key words:cDNA library;roo t;Citrus junos;expressed sequence tag(EST)
　收稿日期:2011-03-01
基金项目:教育部科学技术研究重点项目(109131);柑桔学重庆市市级重点实验室开放基金计划项目(CKLC200801)资助。
作者介绍:王金萍(1985-),女 ,山东人 ,硕士研究生 ,从事遗传育种方向的研究。
通信作者:陈善春(1966-),男 ,研究员。 E-mail:s cchen2004@vip.sina.com。
DOI :10.13938/j.issn.1007-1431.2011.03.035
中 国 南 方 果 树　　　　　　　　　　　　　　　第 40 卷
　　资阳香橙 Citrus j unos Sieb.ex Tanaka ,又名资
阳软枝香橙 ,是宜昌橙与宽皮柑桔的天然杂种 , 属于
糖橙类型。资阳香橙的抗病 、耐旱 、耐寒及抗碱能力
强 ,被誉为“中国柑桔抗碱砧木之王” [ 1] 。目前对于
资阳香橙的研究主要集中在其抗碱能力[ 2-4]和耐碱
机理[ 5]等方面 ,相对于拟南芥 、水稻 、小麦等 1 年生
草本植物 ,柑桔在分子生物学方面的研究目前还属
起步阶段 ,大部分特异基因还没有得到分离和建立。
基因的分离和建立主要是通过蛋白质纯化 、兼
并引物设计 、RACE 和 RT-PCR 方法。表达序列标
签(expr essed sequence tag , EST)是源于 mRNA
(cDNA)的短的 、单向测定的序列片段 , 也是一种发
现新基因 、研究基因表达图谱的有效工具[ 6-7] 。近些
年来 ,构建 cDNA 文库并进行大规模测序(EST)已
成为一种高效率 、低成本的发现新基因的技术。西
班牙 Fo rment等[8]构建了克里迈丁桔 、脐橙 、杂柑和
枳橙等品种不同组织 、不同发育时期和不同逆境条
件下的 25 个 cDNA 文库 , 是迄今为止报道的最为系
统的柑桔功能基因组研究成果。巴西构建了柑桔不
同品种 、不同组织的 33个 cDNA 文库 , 测序 286 559
个 cDNA 克隆 , 得到 242 790 va lid reads 和 91 821
个 unig ene s;我国钟广炎等构建的一系列 cDNA 文
库填补了椪柑基因组学研究材料的空白。
目前柑桔的研究都集中在地上部分 , 而柑桔碳
氮营养的吸收以及次生代谢产物的合成等都源于根
部 ,柑桔根部有其特定的表达基因。为此 , 笔者首次
构建了以资阳香橙根为材料的 cDNA 全长文库 , 并
进行了初步测序 , 对 EST 测序结果进行了分析 , 这
将为分离克隆资阳香橙根部重要功能基因 、比较不
同器官基因表达的差异奠定分子生物学基础 , 也为
以后通过差异杂交获取资阳香橙根部特定途径的代
谢及调控基因提供平台。
1　材料与方法
1.1　材料
供试材料为资阳香橙的根。在田间取样后 , 将
根用自来水冲洗干净 , 使用灭菌的 0.1% DEPC 水
处理 ,并用灭菌滤纸吸干根表面的水 , 液氮速冻后保
存于-70 ℃冰箱中备用。
主要试剂:SMART cDNA Libray Construction
Kit购自 Clontech 公司 , JM109 购自 P romega公司 ,
TRIZOL 购自 Invitro gen Co rpor alion 公司 , 其他生
化试剂均购自上海生工生物工程技术服务公司。
1.2　方法
1.2.1　RNA 的提取:取 100 mg 左右资阳香橙的
根 , 在加有液氮的研钵中快速研磨成粉末 ,转移到无
RNAase的 1.5 m L 离心管中。 迅速加入 1 mL 的
TRIZOL提取试剂 , 充分混匀后 , 后续的操作参照
TRIZOL提取液说明书进行。
沉淀用 75%乙醇(预冷)洗涤后 , 于空气中干
燥 , 用适量的 DEPC 水溶解 , 置于-70 ℃下保存备
用。在 1.1%琼脂糖凝胶上电泳检测 RNA 的完整
度 , 并用 Beckman Coulte r DU640 紫外分光光度计
测定 RNA 的纯度及含量。
1.2.2　cDNA 第一链的合成与 LD-PC R(1ong dis-
tance PCR):合成 cDNA 第一链时 , 按照 Clontench
公司 Crea torTM SMART cDNA 文库构建试剂盒说
明书 , 在无 RNAase 的 PCR 管中加入下列试剂:3
μL(约 1.0 μg)RNA、1μL SM ART Ⅵ Oligonucleo ti-
de、1 μL CDSIII/ 3′PCR引物;72 ℃温育 2 分钟后 ,
放冰上 2 分钟 ,稍离心后加入 2μL 5× First Str and
Buffer 、1.0 μL DT T(20 mmol/ L)、1.0 μL dNTP
Mix(10 mmol/ L)、 1.0 μL Pow erScript Reverse
T ranscriptase , 混匀离心 , 42 ℃置 PCR 仪上作用 1
小时 , 取出置于冰上终止第一链反应。
取 2 μL 第一链 cDNA 、80 μL 去离子水 、10 μL
10 × Advantage 2 PCR Buffer 、2 μL 50 ×dNTP
Mix、2 μL 5′PCR引物 、2 μL CDSⅢ/ 3′PC R引物 、2
μL 50×Advantage 2 Polymerase M ix 于 0.5 m L 的
PCR管中(总体积为 100 μL)轻轻混匀 , 稍离心后置
95 ℃预热的 PCR仪中 , PCR 反应程条件为:95 ℃
变性 1 分钟 , 95 ℃ 15 秒 、68 ℃ 6 分钟 , 24 个循环 ,
循环结束后取 5 μL样品 , 1.1%琼脂糖凝胶电泳检
测产物。
1.2.3 　cDNA 的纯化 , SfiI 消化及分级分离:取
dscDNA 加入 2μL蛋白酶 K(20 μg/μL)45 ℃水育
20分钟消化残存的 Taq 酶及蛋白质 , 去杂质并沉淀
dscDNA , 得到的沉淀用 100 μL 80%乙醇清洗 , 室温
干燥沉淀 , 待乙醇完全挥发后加 79 μL 去离子水溶
解 , 然后加入 10 μL 10 × SfiⅠ Buffer、10 μL SfiI、1
μL 100×BSA ,总反应体系为 100 μL , 充分混匀后 ,
50 ℃温浴 2 小时 , 酶切产生黏性末端 , 加入 2 μL
1%二甲苯胺染料。 将酶切产物过 CHROMA
SPIN-400 柱 ,每管 1滴(约 35 μL), 每管取 3 μL 进
行 1.1%琼脂糖凝胶电泳(150 V)10 分钟 , 收集符合
要求的 3 ～ 5 管合并 ,沉淀回收。
2
　第 3 期 王金萍 , 等:资阳香橙根 cDNA 全长文库的构建及 EST 分析
1.2.4　cDNA 与 pDNR-LIB 质粒的连接与转化:按
试剂盒的要求 ,分别取 0.5 、1.0 和 1.5 μL cDNA 与
1.0 μL pDNR-LIB 载体设置 3 个试连接反应 , 16℃
下连接过夜。取大肠杆菌 JM109 感受态细胞 , 放在
冰上使其自然融化 , 分别加入上述连接液 , 轻轻混
匀 , 42 ℃热激 50秒 , 37 ℃, 225 rpm 培养 60 分钟后
涂板 ,选取最佳反应体系。
1.2.5　文库的质量评价
1.2.5.1　原始文库的滴度测定。 测算滴度步骤如
下:取 5 mL 原始文库做 10 倍梯度稀释 , 按下列公
式测定。
pfu/m L=噬菌斑数×稀释倍数×103(μL/ mL)稀释噬菌体的铺板体积(μL)
1.2.5.2　扩增和保存。为了得到足够数目的克隆
用于后期文库筛选 ,同时也为方便长期保存 , 在得到
原始文库后 , 通常要对原始文库进行扩增 , 每一个
LB 培养基 , 涂布 10 μL 原始文库 , 37 ℃培养 18～ 20
小时;加入 5 mL 含 25%甘油的 LB 培养基 ,使菌落
悬浮于液体中 , 收集所有平板中的菌落悬浮液于
-80 ℃保存 ,即为扩增文库。
1.2.5.3　文库插入片段大小及重组率检测。 从原
始文库中随机挑选 20 个单菌落 , 接种于含氯霉素的
LB 培养液中 , 37 ℃过夜培养;提取质粒做模板 ,
PCR扩增 , 反应条件如下:94 ℃变性 5 分钟 , 94 ℃
退火 1 分钟 , 55 ℃复性 1 分钟 , 72 ℃延伸 1 分钟 , 25
个循环 ,扩增产物用 1%琼脂糖凝胶电泳检测插入
片段长度。
2　结果与分析
2.1 　总 RNA 的提取﹑ cDNA 第一链的合成及
LD-PCR
提取的资阳香橙总 RNA 通过琼脂糖凝胶电泳
检测看出 ,条带清晰 ,且 28S 较 18S 条带亮;测定其
0D值 , 结果 A 260/ A280为 1.93 , 说明 RNA 纯度高 ,
完整性好 , 完全可以满足 cDNA 文库构建的要求
(见图 1)。反转录后第一链 cDNA 经过 LD-PCR 合
成 dscDNA , 经电泳检测 , dscDNA 片段条带呈弥散
状 , 主要分布在 0.5 ～ 4.0 kb 之间 , 表明获得的
dscDNA 已经符合下一步试验要求 。
图 1　资阳香橙根总 RNA
2.2　cDNA的纯化 、回收连接转化
双链 cDNA 经 SfiI 酶切后 , 含有大量的小于
500 bp 的小片段 , 包括未使用完的引物 、引物二聚
体以及小的 cDNA 片段等 , 这些片段可通过 SP IN-
400 柱的分级分离除去 。过 SPIN-400 柱收集的液
体在150 V 1.1%琼脂糖凝胶上电泳 l 0 分钟。电泳
结果显示 , 过柱分离的 cDNA 片段主要集中于第三
管到第六管中 , 因此收集并回收第 3 ～ 6 管的
cDNA ,用于连接试验(见图 2)。
2.3　cDNA文库的质量分析
cDNA 文库的质量取决于原始文库与扩增文库
的滴度 、插入片断的大小及重组率 ,本试验的原始文
库滴度为4.8×10 5 pfu/m L ,扩增文库滴度达5.0×
109 pfu /m L , 随机挑取 20 个克隆进行 PCR 扩增。
结果表明 , 文库重组率为 93%, 电泳结果显示插入
片段大小分布在 500 ～ 2 000 bp 之间(见图 3)。 以
上结果表明 , 本试验构建的 cDNA 文库滴度 、重组
率和插入片段大小 , 均符合 cDNA 文库构建要求。
注:M :DNA 分子量标记 DL 2000;1～ 15:ds cDNA 过柱分离时的收集管号。
图 2　ds cDNA 过柱分级分离电泳图谱
3
中 国 南 方 果 树　　　　　　　　　　　　　　　第 40 卷
注:M :DNA 分子量标记 DL 2000;1～ 20:随机挑选克隆。
图 3　PCR 检测插入片段大小
2.4　EST测序结果的初步分析
从 cDNA 原始文库中随机挑取450 个克隆进行
测序 ,去除载体序列及低质量的序列后 , 共获得有效
长度大于 150 bp 的高质量 ESTs 序列 438 条 , EST s
序列长度主要集中在 500 ～ 1 000 bp 之间 ,有效序列
长度跨度从150 bp 至 1 075 bp。具体分布情况见图
4。
EST 长度/ bp
图 4　EST 长度分布
2.5　EST比对分析
利用 BioEdit软件对有效 EST 序列进行片段重
叠群分析和拼接 , 获得 251 个独立基因(Unigene),
其中包括 87 个片段重叠群(Contig)和 164 个独立
的 EST s(Sing le t),通过与 NCBI的非冗余核酸数据
库进行 tBlastx 比对 , 初步确定已知功能基因 146
个 , 占 58%;推定功能基因 91 个 ,占 36%;未知功能
基因 14 个 ,占 6%。将与已知基因同源的 ESTs 按
功能分为 4 个大类:第 1 大类为与代谢相关的基因 ,
如醛脱氢酶 、酸性几丁质酶等;第 2类为参与蛋白质
合成加工 、细胞结构建成等过程的基因 ,如转录起始
因子等;第 3 类为细胞代谢 、细胞结构 、细胞信号相
关基因 , 如肽聚糖识别蛋白 、膜联蛋白 , DNA 结合蛋
白;第 4 类为抗逆相关基因如热休克蛋白 、金属硫蛋
白等。对部分功能基因在 GenBank 中进行同源性
比对 , 结果见表 1。
表 1　部分功能基因在 GenBank 中的同源性比较结果
编　号 碱基长度/
bp
功 能 注释 生 物体 e-值 数量
Cont ig20 682 转录起始因子 t fiid 蓖麻 Ricinus comm unis 4.00E-90 1
Cont ig18 620 转录起始因子 IIF 亚基 蓖麻 R.communis 7.00E-40 1
Cont ig3 327 醛脱氢酶基因 地中海松 Pinus halep ensis 2.00E-06 14
Cont ig4 1 023 60S 核糖体蛋白 蓖麻 Ricinus comm unis 2.00E-105 1
Cont ig17 1 446 金属硫蛋白 温州蜜柑 Citru s un sh iu 2.00E-67 3
Cont ig24 1 604 组蛋白乙酰转移酶(HAF901)杨毛果 Populus tr ichocarpa 8.00E-83 1
NM 119262.5 1 075 蛋白甲基转移酶 SKB1 鼠 耳 芥 Arabidop sis th aliana(L.)Heynh 3.00E-122 1
Cont ig32 1 801 膜联蛋白 蓖麻 Ricinus comm unis 1.00E-140 1
DQ402076.1 1 045 14- 3- 3 蛋白 陆地棉 Gossyp ium h ir sutum 6.00E-142 1
XM 002514977.1 508 A TP 结合蛋白 蓖麻 Ricinus comm unis 2.00E-27 1
AB081944.1 1 512 酸性几丁质酶 柑桔 Citrus sp. 3.00E-149 1
AF283537.1 944 凝集素相关蛋白前体 柑桔×葡萄柚 Citrus × Paradisi 2.00E-16 1
XM 002527964.1 1057 shk1激酶结合蛋白 蓖麻 Ricinus comm unis 3.00E-122 1
FJ969431.1 973 热休克蛋白 90-2 大豆 Glycine max 1.00E-21 1
AJ290819.1 805 h sp11小热休克蛋白 花旗松 Pseudotsuga menz iesi i 1.00E-51 1
XM 002517504.1 764 硫酸运输子 蓖麻 Ricinus communis 1.00E-50 1
4
　第 3 期 王金萍 , 等:资阳香橙根 cDNA 全长文库的构建及 EST 分析
　　进一步对功能基因进行生物信息学分析 , 结果
表明 ,其中部分有完整的阅读框 、5′非翻译区和 3′非
翻译区 , 可初步确定为全长 cDNA 克隆 , 其中包括
60S 核糖体蛋白 、酸性几丁质酶 、金属硫蛋白 、肽聚
糖识别蛋白 、膜联蛋白 、DNA 结合蛋白 、热休克蛋白
等以及质膜固有蛋白系列和组蛋白系列的基因等。
3　讨论
构建 cDNA 文库的关键是要保证文库的完整
性与覆盖度。本试验采用 SM ART 技术 , 构建了资
阳香橙根的全长 cDNA 文库。 SMART 法由 Clone-
tech 公司创建[ 9] , 利用逆转录酶内源的末端转移酶
活性 ,使只有 5′帽子结构的 mRNA 才能利用这个反
应扩增得到全长 cDNA。 另外 , SMART 法采用具
有稀有酶切位点的内切酶 SfiⅠ构建文库 ,建成的文
库是定向文库 ,克服了其他文库的不定向克隆问题 ,
实验快速 、简单 , 建成文库的全长比例较高 , 是目前
比较完善的全长文库构建方法[10] 。
通过测序分析得到了一些功能蛋白的 EST 序
列 ,如热休克蛋白(heat shock pro tein)、金属硫蛋白
(Metallo thionein)、14-3-3 蛋白(14-3-3 pro tein)等 ,
这些功能蛋白可能与资阳香橙根适应碳酸钙碱性土
壤并具有抗寒 、抗旱 、抗病等特性有关。热休克蛋白
是生物体在环境温度显著变化时大量合成的一组蛋
白质 ,属于分子伴侣蛋白家族 , 部分热休克蛋白还与
细胞防脱水蛋白存在序列上的相似性 ,使其能减轻
冷胁迫对膜的损伤 ,减少溶质渗漏 , 从而增强组织的
抗冷性。 郭九峰等对沙冬青(Ammopiptanthus
mongo licus)cDNA 文库中的热休克蛋白序列进行了
分析 ,结果显示其对沙冬青抗冻相关[ 12] 。金属硫蛋
白广泛存在于植物中 ,对植物耐重金属特别重要 , 具
有解除金属离子的毒害及维持细胞内环境稳定的作
用[ 13] 。同时植物金属硫蛋白还具有较谷胱苷肽
(g lutathione , GSH)强的氧自由基清除能力和抵抗
氧化胁迫的作用[ 14] 。 Akashi等[ 15]从野生西瓜里分
离出金属硫蛋白 CLMT2 , 发现其具有很强的自由
基清除能力。 14-3-3 蛋白是重要的调控蛋白 , 涉及
植物细胞生物合成代谢酶 、囊泡穿梭 、细胞周期 、细
胞凋亡和细胞信号转导等多方面的调控 , 越来越多
的研究表明 14-3-3 蛋白不仅通过与转录因子和其
他信号分子结合参与调控植物细胞信号转导[ 16-18] ,
还广泛参与了植物对各种胁迫应答的信号转导过
程[ 19] 。在拟南芥中 14-3-3 蛋白质在低温胁迫应答
中被诱导[ 20] ;水稻幼苗和愈伤组织在高盐胁迫下
14-3-3 蛋白转录增加[ 21] , 推测 14-3-3 蛋白可能参与
盐胁迫应答功能调节。 14-3-3蛋白通过对胁迫信号
转导过程终端蛋白的调节 , 广泛参与了植物胁迫应
答响应过程 , 可以推测 , 14-3-3 蛋白在协调植物耐受
胁迫因子过程中具有重要地位。本试验还得到了凝
集素 、几丁质酶等 ,这些为今后资阳香橙根部功能相
关基因的进一步研究提供了基础 。
资阳香橙是重要的砧木资源 , 由于其耐寒 、耐
旱 、耐盐碱 、耐贫瘠等特性 , 也是重要的抗性基因资
源库。本试验构建了高质量的资阳香橙根 cDNA
文库 , 不仅为克隆资阳香橙重要基因奠定了基础 , 还
为进一步研究及开发利用这一基因资源库提供了条
件。虽然获得了部分的测序结果所指代的信息不够
全面 , 但是通过这些有限的信息可以粗略地了解资
阳香橙基因的种类及表达丰度 , 为进一步挖掘资阳
香橙的特有基因资源奠定了基础 。
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5
中 国 南 方 果 树　　　　　　　　　　　　　　　第 40 卷
上 ,获得相对高的产量 , 同时经试验验证重复性好。
一些使用者认为 RAPD 技术存在稳定性差 、扩
增结果的重复性受多因素影响等[ 13]不足之处。本
研究认为只要保持试验操作的稳定性 ,仪器设备 、药
品等前后一致 , RAPD的扩增结果是完全可重复的。
另外 ,在一个反应体系和条件下扩增出的条带必须
首先是特异的 ,而不是首先表现出条带的丰富性 , 在
消除一切产生假阳性条带 , 保证条带的特异性的前
提下 ,适当提高每一片段的产量 , 由此建立的 RAPD
反应体系和程序能够保证 RAPD结果的忠实性。
3.3　4 个品种 DNA扩增带的多态性和引物的筛选
在 4个柑桔品种中共扩增出 173 条谱带 , 每个
引物扩增谱带在 1 ～ 6 条之间。其中沙糖桔扩增出
条带的引物个数最多 ,达 18 个。八月桔的最少 , 仅
12 个。在沙糖桔中 , 能扩增条带清晰 、多态性好的
引物有 5 个 , 即 S10 、S237 、S266、S147 和 S90 , 它们
可以作为进一步筛选沙糖桔品种鉴定引物的基础;
在八月桔中能扩增条带清晰 、多态性好的引物有 3
个 ,分别为 S230 、S253 和 S418;在五月桔中 ,能扩增
出条带的引物是 14 个 , 其中扩增条带清晰 、多态性
好的引物是 S266、S253 、S99、S90 、S227 和 S418。值
得注意的是 ,能揭示贡柑的多态性的引物较多 , 能扩
增出条带的引物个数是 17 个 , 而扩增条带清晰 、多
态性好的引物有 7 个 , 分别为 S230 、S266 、S253 、
S147 、S90、S227 和 S418。对德庆县不同果园贡柑
样品做品种纯度检测试验 ,结果表明 , 在利用 RAPD
标记技术进行柑桔种质纯度鉴定时 , 必须进行多个
引物特征条带的检测 , 可以将芽变等微小突变造成
的单株间带型差异和种质混杂有效区别 , 获得正确
的检测结果。
肇庆地区 4 个柑桔品种 DNA 的提取 、RAPD
反应条件的优化和反应程序的建立 , 以及随机引物
的筛选研究 , 将为今后在这些地方优良品种基础上
选育的新品种鉴定 、突变体检测 、基因定位 、遗传多
样性及系谱分析等提供研究基础;同时将 RAPD 技
术与其他分子标记技术一起结合 , 相互补充 ,在柑桔
遗传育种研究领域中将发挥更重要的作用。
参　考　文　献
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