全 文 ：CHINESE HORTICULTURE ABSTRACTS
金柑高效再生体系的建立
文露清1,2 杨 莉1,2 胡 威1,2 邓子牛1,2
（1.湖南农业大学园艺园林学院，湖南 长沙 410128；2.国家柑橘改良中心长沙分中心，湖南 长沙 410128）
摘 要：以金柑实生苗为试材进行试验，研究不同再生培养基和苗龄及不同暗培养时间对金柑不定芽再生的影响，
建立一套高效稳定的金柑组织培养再生体系。结果表明：采用35 d苗龄的无菌苗上胚轴茎段在MS+6-苄氨基嘌呤
(6-BA)2.0 mg/L+α-萘乙酸(NAA)1.0 mg/L+激动素(KT)1.0 mg/L+3%蔗糖+0.8%琼脂(pH值5.7)再生培养基上，不经
过暗培养直接转移至光/暗周期16 h/8 h条件下，为诱导金柑不定芽再生的最佳条件，再生率高达90%。
关键词：金柑；实生苗；再生体系
自1990年世界上诞生首例遗传转化柑橘以来[1]，不断完善
的遗传转化育种技术为柑橘提供了一种更快速直接的育种和品
种改良手段。在柑橘遗传转化中大多数采用的是实生态的材
料，因为实生态材料易于再生、转化率高。但是大多数柑橘品
种实生态的材料因为未渡过童期，即使转化成功，进入开花结
果一般要10～15年[2]，这不适于快速地进行田间观测及评价和
利用柑橘转基因植株进行基因性状表达等研究。成年态材料
作为转化的受体，可以有效缩短育种周期，却存在再生率低
且污染率高的问题。为了克服这些障碍，通过选择童期较短
的柑橘类植物，建立高效稳定的再生体系，为遗传转化奠定
基础，从而能够高效地在短期内进行基因性状表达研究。
金柑(Fortunella)属于芸香科(Rutacease)柑橘亚科(Au-
rantioideae)柑橘族(Citreae)柑橘亚族(Citrinae)真正柑橘组植
物，原产于我国，已有1600多年的栽培历史[3]，具有很高的食
用、药用价值以及观赏价值。与其他柑橘类植物相比，金柑童
期较短，实生繁殖后约2～3年便可开花结实，是利用转基因体
系研究某些基因、启动子或表达调控序列在果实中的功效较理
想的柑橘类植物材料。本试验以我国栽培历史悠久的金柑品种
‘阳朔’金柑为试材，建立了稳定高效的再生体系，为进一步
导入外源基因、利用转基因金柑探索基因功能的研究以及运用
基因工程手段对金柑进行遗传改良和种质创新奠定基础。
1 材料与方法
1.1 试验材料
供试品种为‘金弹’金柑( Swi-
ngle)，果实采自广西阳朔10年生实生树，由广西柑橘研究所
友好提供。种子自果实取出后，洗净存于5℃冰箱备用。试
验植物材料均保存于国家柑橘改良中心长沙分中心温室。
1.2 方法
1.2.1 无菌苗的获得 种子去外种皮后，经70%的酒精消
毒30 s，10%的次氯酸钠溶液消毒20 min，再用无菌水冲
洗3～4次，用镊子在无菌纸上去除内种皮，接种于MS(pH值
5.7)固体培养基上。26±2℃暗培养15 d实生苗长至6～7 cm
时，再置于26±2℃、光/暗周期16 h/8 h的条件下，光照
10 d、20 d、30 d，培育壮苗。
1.2.2 最佳外植体苗龄和再生培养基的确定 将苗龄为
25 d、35 d、45 d的实生苗上胚轴切成1 cm左右大小的茎
段作为外植体。参照Yang等[4]、Duan等[5]、敖小平等 [6]的培
养基配方，设置3种含有不同激素浓度及配比的再生培养基，
具体配方如下：1号培养基：MS+BA 2.0 mg/L+NAA
1.0 mg/L+KT 1.0 mg/L；2号培养基：MS+BA 0.5 mg/L +
NAA 0.1 mg/L+KT 0.5 mg/L；3号培养基：MS+BA
3.0 mg/L。26±2℃、光/暗周期16 h/8 h的条件下培养。
每处理60个外植体，重复3次，30 d后统计不定芽再生率，
并采用SPSS软件对数据进行邓肯式方差分析。
1.2.3 最佳暗培养时间的确定 取35 d苗龄的上胚轴茎段
平放于MS+BA 2.0 mg/L+NAA 1.0 mg/L+KT 1.0 mg/L
再生培养基上，26±2℃下暗培养0 d、7 d、15 d，再转至
光/暗周期16 h/8 h的条件下培养。每处理60个外植体，
重复3次，30 d后统计不定芽再生率，并采用SPSS软件对
数据进行邓肯式方差分析。
1.2.4 茎尖嫁接再生成苗 在无菌条件下，将诱导出的不
定芽进行嫁接再生成苗。选取卡里佐枳橙种子(方法与上述金
柑无菌苗播种方法一致)，播在不加激素的MS培养基上，置于
26℃下暗培养14 d，直径为2 mm左右，用作砧木。首先将培
养的黄化苗切去根端部留约5 cm长，切去茎上部留约2 cm
长，采取茎尖嫁接法[7]在显微镜下进行无菌嫁接。嫁接培养
基为液体培养基(MS无机盐+10 ml/L white有机物+75 g/L
蔗糖+100 mg/L肌醇)，将成活试管嫁接苗二次嫁接到一年生
枳壳上。在砧木切口处纵切2 mm左右的嫁接口，将2 cm接穗
芽用刀片将其基部削成光滑的斜面，与枳壳韧皮部紧密贴合，
然后用封口膜将砧穗结合部位及砧木切口部分密封固定。在结
合部位下方套湿润的脱脂棉，以保持充足的水分，套1个塑料
袋，待萌发新叶后逐渐在塑料袋上戳孔直至去除塑料袋。
2 结果与分析
2.1 不同再生培养基及苗龄对金柑不定芽再生的影响
采用3种培养基对金柑上胚轴茎段进行离体再生，结
第一作者简介：文露清（1986－），女，硕士研究生；研究方向为
生物技术在果树上的应用。
通讯作者：邓子牛，教授，博士生导师。E-mail:Deng7009@163.com
项目来源：农业部948项目(2010-Z47)；现代农业(柑橘)产业技
术体系。
10

PDF 文件使用 pdfFactory Pro 试用版本创建 www.fineprint.cn
中国园艺文摘 2011年第2期
果表明：1号培养基上，不同苗龄茎段的再生率都明显高于
后两种，该现象可能与BA、NAA和KT在一定浓度配比下
产生的加性效应有关。经观察，35 d苗龄的再生率最高，
达到93.1%(见表1)，浓绿粗壮且多为丛芽(见附图B)，培养7
d时外植体两端出现明显的膨大(见附图A)，15 d左右就能
观察到不定芽的再生；2号培养基再生率居于1和3号之间，
分化速度慢，大约20 d后才能观察到芽点的出现，且40 d
后茎段几乎都出现了发黄现象，这可能与各激素浓度过
低有关；3号再生率最低，在培养初期时大多数茎段两
端被愈伤组织覆盖，虽有绿色小芽点出现，但数量很少。
因此，在后续试验中，我们选择实生苗苗龄在35 d的上胚
轴茎段作为外植体及1号培养基作为再生培养基。
表1 不同以及不同苗龄对金柑不定芽再生的影响
苗龄25 d
再生率
78.5±4.31 c
37.5±1.42 b
17.1±1.27 a
再生系数
2.21±0.09
1.65±0.05
0.89±0.09
再生率
30.0±1.09 c
19.3±2.37 b
0 a
再生系数
1.65±0.08
1.71±0.07
0
再生率
93.1±0.98 c
47.0±3.84 b
17.9±1.17 a
再生系数
2.72±0.11
1.74±0.15
1.40±0.06
培养基序号
1
2
3
苗龄35 d 苗龄45 d
注：经邓肯式新复极差法显著性检测，同列中不同小写字母表示在0.05水平的显著差异。
2.2 不同暗培养时间对金柑不定芽再生的影响
在筛选出的最佳不定芽分化诱导培养基(MS+BA 2.0
mg/L+NAA 1.0 mg/L+KT 1.0 mg/L)上，采用最适的
35 d苗龄的上胚轴茎段，不同暗培养时间条件下进行离体
再生，接种20 d后观察结果表明：没有经过暗培养直接进
行光照培养的茎段呈绿色，出芽时间早，不定芽生长健壮
且生长快，再生率高达91.3%(见表2)；经过7 d暗培养的茎
段部分再生率不高，培养后期出现黄化现象；经过15 d暗
培养的茎段90%以上呈黄白色，只有少量长出不定芽的茎
段呈绿色，但是不定芽生长缓慢，且生长至2～3 mm时就
停止生长并逐渐变成透明状。因此，从试验结果来看，不
需要经过暗培养更利于金柑不定芽的再生。
2.3 嫁接成苗
大多数柑橘品种离体培养中生根困难，通常采用茎尖
试管嫁接法获得再生植株(见附图C)。本试验采用约1 cm的
接穗芽进行嫁接，其成活率达到90%以上。不定芽通过试
管嫁接30 d后，二次嫁接到一年生盆栽枳砧木上(见附图
D)，从而实现了不定芽的顺利移植。
3 讨论
近年来，有关柑橘再生系统研究报告中所采用的主要包
括原生质体再生、体细胞胚发生实生苗茎段和成年态节间茎
段的直接发生等。其中，以实生苗上胚轴茎段直接发生系统
操作简便，培养过程中发生的变异少，是被广泛采用的再生
系统。目前的转基因报道中，有多例是以实生苗上胚轴茎段为
外植体的，包括枳、枳橙、甜橙、葡萄柚、柠檬、来檬等[8]。
这说明以柑橘实生态为遗传转化的起始材料较为理想，但
它受基因型影响较大，需要针对不同柑橘种类进行优化。
关于金柑实生态离体再生的试验，国内外仅有两篇文献有
相关报道 [4,5]。本试验所用再生培养基与Yang等 [4]相同，但
在品种和暗培养时间上有所差别，我们获得的再生率达
90%以上，远高于后者外植体平放时的30%再生率。
从本试验研究结果来看，金柑实生态离体再生体系的最佳
条件是：(1)以经过暗培养15 d，光照培养20 d，苗龄在35 d的
实生苗为外植体。可能由于金柑实生苗弱小，而未经过较长时
间光照培养的外植体木质化程度低以至于很难再生，所以相比
于其他柑橘品种，金柑实生苗培养的所需光照时间较长；(2)实
生苗茎段不经过黑暗，直接转移至光照，暗周期16 h/8 h的
条件下诱导不定芽的再生，其再生率显著高于同等条件下经
表2 不同暗培养时间对金柑不定芽再生的影响
再生率
91.3±1.69 c
40.5±5.73 b
17.8±0.66 a
注：经邓肯式新复极差法显著性检测，同列中不同小写字母表示在0.05水
平上差异显著。
时间(h)
0
7
15
再生系数
2.34±0.05
2.11±0.09
1.06±0.04
A B
11

PDF 文件使用 pdfFactory Pro 试用版本创建 www.fineprint.cn
CHINESE HORTICULTURE ABSTRACTS
过暗培养的材料。并且，暗培养时间越长，外植体黄化情况越
严重。这可能依然与金柑本身生长势弱有关，其原因有待进
一步研究；(3)以MS+BA 2.0 mg/L+NAA 1.0 mg/L+KT
1.0 mg/L+3%蔗糖+0.8%琼脂(pH值5.7)为再生培养基，再
生效果最好。可能与此培养基中的各激素加性效应有关，
能在不同金柑品种中起到有效的再生促进作用，可用于其
他金柑品种的再生试验。
参考文献：
[1] Vardja,Bleicmhna S.Genetic transformation of citms pro-
to-plants and regeneration of transgenic plants [J].
Plant Science,1990,(69):199-206.
[2] 王子成,邓秀新.柑橘转基因研究进展[J].华中农业大学学报,
2002,(10):494-499.
[3] 孟鹏.金柑的研究现状及其开发前景[J].农产品加工,2009,
(11):35-41.
[4] L.Yang,C.-J.XU,G.-B.HU,et al.Establishment of an Agrobac-
terium-mediated transformation system for Fortunella
crassifolia[J].Biologia Plantarum,2007,51(3): 541-545.
[5] Yan-Xin,Wen-Wu Guo.Regeneration and characterization
of transgenic kumquat plants containing the Arabidop-
sis APETALA1 gene[J].Plant cell Tiss Organ Cult,2009,
(9):l203-1211.
[6] 敖小平,胡新喜,郭琛等.用 rolB 基因转化大红甜橙的初步研
究[J].湖南农业大学学报(自然科学版),2005,31(6):623-626.
[7] Ahmet Onay, Vedat PiRiNC, Filiz Adiyaman,et al.In Vivo
and in Vitro Micrografting of Pistachio,Pistacia vera
L.cv.“Siirt”[J].Turk J Biol,2003,(27):95-100.
[8] 胡新喜,敖小平,邓子牛等.大红甜橙遗传转化高效再生体系的建
立[J].湖南农业大学学报(自然科学版),2007,33(5):576-579.
附图 金柑实生态上胚轴茎段的再生成苗
注：A：培养7 d后，茎段两端出现膨大；B：不定芽再生；C：不定芽茎尖嫁接；D：二次嫁接温室盆栽枳壳砧木成苗。
Establishing Efficient Regeneration System for
Genetic Transformation of Fortunella crassifolia
WEN Lu-qing YANG Li HU Wei DENG Zi-niu
Abstract: Using epicotyls of kumquat 渊Fortunella crassifolia Swingle冤 seedlings growing in vitro as explants, an efficient regeneration
system was established. The results show that, using 35-day-old epicotyl segments of kumquat, and based on the culture media of
MS+6-BA 2.0 mg/L+NAA 1.0 mg/L+KT 1.0 mg/L+ sucrose 3% + agar 0.8% 渊pH5.7冤 in the tempreture of 26益 for a 16/8 h light/
dark cycle and without dark-culture, adventitious shoots regenerated from 90% of the epicotyl explants.
Key words: Fortunella crassifolia Swingle; seedling; regeneration system
C D
12

PDF 文件使用 pdfFactory Pro 试用版本创建 www.fineprint.cn