全 文 ：基金项目：教育部博士点基金(No. 200806351015)
收稿日期：2012-08-09 接受日期：2012-10-17
研究报告
Letter
梁平柚鼠李糖基转移酶基因(Cm1, 2RhaT)的克隆与表达分析
张军 陈雪 陶静静 马婧 眭顺照* 李名扬 *
西南大学园艺园林学院，南方山地园艺学教育部重点实验室,重庆市花卉工程技术研究中心，重庆 400715
*通讯作者，sszcq@126.com；limy@swu.edu.cn
摘 要 柚皮苷是一种双氢黄酮类化合物的苦味剂，鼠李糖基转移酶是柚皮苷的合成过程中的关键酶。
本研究通过RT-PCR方法从梁平柚(Citru maxima cv. Liangping)扩增到鼠李糖基转移酶(Cm1, 2RhaT)基因，
构建了该基因的原核表达载体pET28a-CmRhaT并转化到大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(DE3)中，诱导表
达并分离纯化得到融合蛋白。利用SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测Cm1, 2RhaT基因在梁平柚等5
个柑橘品种叶片、果实及不同发育时期的表达差异。研究结果获得Cm1, 2RhaT的DNA和 cDNA序列
(GenBank登录号:JQ217381)，cDNA长 1 436 bp，推测的编码蛋白Cm1,2RhaT包含 453个氨基酸，理论分
子量为51.2 kD。分离纯化得到了较高浓度(0.526 mg/mL)和纯度(95%)的融合蛋白。定量分析表明，该基
因在梁平柚的果实和叶片中均有表达。从开花后30~180 d，该基因的表达量总体上随着果实的成熟而逐
渐降低。其同源基因在其它品种中也呈现和梁平柚基本一致的波动性表达模式。本研究从梁平柚中扩
增出一个Cm1, 2RhaT基因，其表达的酶具有典型的糖基转移基团，是柑橘苦味物质之一黄烷酮合成中的
关键酶，参与柑橘次生代谢过程，可能是无苦味柑橘品种改良的一个切入点。
关键词 鼠李糖基转移酶，Cm1, 2RhaT基因，原核表达，苦味，基因表达
Cloning and Expression Analysis of a 1, 2Rhamnosyl- transferase Gene
(Cm1, 2RhaT) from Citrus maxima cv.Liangping
ZHANG Jun CHEN Xue TAO Jing-Jing MA Jing SUI Shun-Zhao* LI Ming-Yang*
Key Laboratory of Horticulture Science for Southern Mountainous Regions, Ministry of Education, Chongqing Engineering Research Center for
Floriculture, College of Horticulture and Landscape, Southwest University, Chongqing 400715, China
* Corresponding author, sszcq@126.com; limy@swu.edu.cn
Abstract Naringin is a bittering agent of kinds of hydrotestosterone flavonoids and the rhamnosyltransferase
is a key enzyme in the synthesis of naringin. In this study we cloned a 1,2rhamnosyltransferase gene(Cm1,
2RhaT) which wa from Citrus maxima(Burm.) Merr. cv. Liangpin Yu. The Cm1, 2RhaT gene expression vector
pET28a-CmRhaT was constructed by the gene fragment cloned into the prokaryotic expression vector pET-28a
(+), which was then transformed into Escherichia coli BL21(DE3). The objective fusion protein was induced
and expressed. Further fusion protein was induced to express and purified. The SYBR Green Real-time qRT-
PCR was employed to analyze the expression differences of Cm1,2RhaT in the fruits and leavess different
developmental stages of Citrus maxima (Burm.) Merr. cv. Liangpin Yu and other four citrus varieties.The
results showed that Cm1,2RhaT was isolated and characterized from Citrus maxima (Burm.) Merr. cv.
Online system: http://www.jabiotech.org
农 业 生 物 技 术 学 报
Journal of Agricultural Biotechnology
2013, 21(5): 511~521
DOI: 10.3969/j.issn.1674-7968.2013.05.002
农业生物技术学报
Journal of Agricultural Biotechnology
梁 平 柚 (Citrus maxima (Burm.) Merr. cv.
Liangpin Yu)，芸香科 ( Rutaceae) 柑桔属(Citrus)植
物。是中国三大名柚之一，果实硕大，芳香浓郁，汁
多味浓，营养丰富，是重要的栽培品种，品质上等，
但是果实直接食用带有苦麻味，榨汁饮用亦有苦
味，这是由于柚果实中含有较高含量的柚皮苷(He,
1999a)。柚皮苷是一种双氢黄酮类化合物的苦味
剂(Jung et al., 2003;贾冬英等, 2002)。植物次生代
谢物合成途径中关键酶的分离及其基因的克隆是
植物次生代谢酶促反应机制研究的基础，而特定植
物次生代谢物的合成与积累量取决于其合成途径
中的限速酶，它们在植物次生代谢物生物合成途径
中往往位于代谢支路分叉口或途径的下游(何水林
等, 2002;陈晓亚,刘培, 1996)。鼠李糖基转移酶是
柚皮苷的合成过程中的关键酶。鼠李糖基转移酶
表达降低，从而使柚皮苷水平降低，改善果实品
质。长期以来国内外众多的研究人员较多的关注
柑桔生物类黄酮的提取，及柑桔加工脱苦技术的研
究。由于柑橘果实中存在大量苦味物质，如柚皮苷
等，因而大大影响到柑桔汁和柑桔酒类的品质与销
售(张甘良等, 2005; 乔海鸥等, 2003)。因此，研究
梁平柚鼠李糖基转移酶(1, 2 rhamnosyl-tansferases)
基因(Cm1, 2RhaT)为育种筛选果实中柚皮苷含量
较低的品种提供帮助。
柑橘的苦味严重影响着柑橘鲜食以及加工产
品的品质，柑橘苦味形成方面的研究始于 20世纪
30年代。已证实柑橘苦味来自两方面的作用，黄酮
类化合物中的柚皮苷和柠檬苦素类化合物
(Hasegawa et al., 1996;眭顺照等, 2008)。柠檬苦素
类化合物它是由无苦味的柠檬碱 A-环内酯
(limonoate A-ring lactone, LARL) 在柠檬苦素D环
内酯水解酶( limonoid D-ring lactone hydrolase)的
作用下生成的，并且在酸性条件和果实受到生理损
伤时，使水解酶的作用得到加强 (Andrew et al.,
2004; Merino et al., 1996;马鑫等, 2011)。柚皮苷是
柚、酸橙、葡萄柚中的主要苦味物质，也是柑橘果
汁中主要苦味物质之一，其含量高低影响果汁色
泽、口味和稳定性 (Gil-lzquierdo et al., 2002; 李和
生等, 2006)。Lewinsohn等(1989)证明葡萄柚无细
胞提取物中 1, 2 RhaT活性。Bar-Peled等(1991)从
葡萄柚中纯化了 1, 2 RhaT酶，但由于缺少UDP-鼠
李糖，所以对研究该酶的同质性和酶动力学有了极
大的限制性。Frydman等(2004)已从葡萄柚中分离
得到的编码 1, 2鼠李糖转移酶基因(Cm1, 2RhaT)
并进行了功能研究，证明此酶对类黄酮化合物引起
的苦味有直接作用，但专门研究该酶的报道依然较
少。本实验以梁平柚为材料，通过PCR和RT-PCR
方法扩增到鼠李糖基转移酶(Cm1, 2RhaT)基因Cm
1, 2RhaT的基因序列，并通过大肠杆菌原核表达体
系获得Cm1, 2RhaT的融合蛋白，通过荧光定量分
析梁平柚、温州蜜柑、费米耐劳、血橙、沙田柚中的
Cm1, 2RhaT及其同源基因的表达关系，探索柚皮苷
在不同柑橘品种间的分布和积累规律。通过Cm1,
2RhaT的克隆、序列分析、基因的表达分析研究，为
进一步研究该酶的蛋白质特性及其在柚苦味改良
上提供依据。
1结果与分析
1.1 Cm1, 2RhaT基因的获得及其序列特征
Liangpin Yu. The accessed cDNA (GenBank accession No. JQ217381) was 1 436 bp in length encoding 453
deduced amino acids with a predicted molecular mass of 51.2 kD. We obtained the fusion protein after
isolation and purification. Its concentration and purity were 0.526 mg/mL and 95%, respectively. Real- time
fluorescence qPCR(RT-PCR)showed that the Cm1,2 RhaT expressed in the Liangpingyous fruits and leaves.
The expression level of Cm1,2 RhaT was reduced gradually with the fruit developing from 30~80 d after
flowering. Its homologous genes in other species also showed the same as volatility expression patterns as in
Liangpingyou. Cm1, 2RhaT which was amplified from Citrus maxima (Burm.) Merr. cv. Liangpin Yu
expressed a kind of enzyme with typical glycosyl transfer group. It is a key enzyme in the synthesis of
fiavanone which is one of Citrus′s bitter substances. The enzyme involves in secondary metabolism process
of Citrus. To sum up, the research and results has certain significance to not- bitter citruss varieties
improvement.
Keywords Rhamnosyltransferase, Cm1, 2RhaT gene, Bitter, Differential expression
512
电泳显示，从梁平柚嫩叶的基因组 DNA和
cDNA中扩增得到了大小一致的特异产物(图1)，分
析测序结果，两者都含有一个1 359 bp的开放阅读
框，根据BLASTX编码氨基酸均与GenBank上公
布的其它植物的 Cm1, 2RhaT基因有很高的同源
性。其中同源性最高的是 Citrus maxima 的
flavonoid 1- 2 rhamnosyltransferase(GenBank
accession number:AAL06646.2)，同一性高达 99%。
初步获得Cm1, 2RhaT基因DNA和 cDNA序列，且
DNA和 cDNA测序结果一致，推测柚基因组Cm1,
2RhaT基因中无内含子存在。
1.2 cDNA编码蛋白Cm1, 2RhaT性质与结构分析
实 验 得 到 的 cDNA(GenBank 登 录 号 为:
JQ217381)编码蛋白 Cm1,2RhaT长有 453个氨基
酸，理论分子量为 51.2 kD，理论等电点为 6.2。
NCBI保守结构域搜索表明，Cm1,2RhaT蛋白属于
Glycosyltransferase_GTB_type超家族，具有典型的
糖基转移基团。利用 Prosite base分析，显示在
329 - 372位有UDP-糖基转移酶保守结构。进一步
将Cm1,2RhaT与同源蛋白进行序列多重比对和结
构预测分析。Cm1,2RhaT具有保守的UDP-糖基转
移酶保守结构区域(UDP-glycosyltransferase)(图2)，
这与Frydman等(2004)研究结果非常吻合。
1.3 Cm1, 2RhaT与具有糖基转移基团的基因的氨
基酸聚类分析
糖基转移酶在生物体内催化活化的糖连接到
不同的受体上，其家族成员丰富，糖基转移酶的作
用位点不尽相同，根据其催化后羟基连接的位置
可以将作用位点大致分为C-3、C-5、C-7、C-1,2、C-
1,6等。将本实验扩增出来的鼠李糖基转移酶基因
与具有糖基转移基团的基因聚类分析，如图 3所
示，可以看出在C-3位置具有糖基化或糖基转移基
2000
1000
750
500
250
100
bp 1 2 3M
图1梁平柚鼠李糖基转移酶基因的PCR扩增
Figure 1 PCR amplification of Cm1, 2RhaT from Citrus
maxima cv. Liangpin yu
M：DL2000 marker；1：Cm1, 2RhaT基因DNA；2：Cm1, 2RhaT
基因cDNA；3：阴性对照
M: DL2000 marker; 1: Cm1, 2RhaT gene DNA; 2: Cm1,
2RhaT gene cDNA; 3: Negative control
UDP-glycosyltransferase保守结构区域
UDP-glycosyltransferase conservative domain
图2 Cm1, 2RhaT与同源蛋白的多重比对
Figure 2 The multiple sequence alignment of Cm1, 2RhaT with homologous proteins
At：拟南芥；Cm：柚；Db：彩虹菊；LpY：梁平柚；Nt：烟草；Pf：紫苏；Ph：矮牵牛；Sb：黄芩；Vh：美女樱；Vm：黑吉豆；Vv：葡萄；
Zm：玉米
At: Arabidopsis thaliana; Cm: Citrus maxima; Db: Dorotheanthus bellidiformis; LpY: Liangpin Yu; Nt: Nicotiana tabacum; Pf:
Perilla frutescens; Ph: Petunia hybrida; Sb: Scutellaria baicalensis; Vh: Verbena hybrida; Vm: Vigna mungo; Vv: Vitis vinifera; Zm:
Zea mays
梁平柚鼠李糖基转移酶基因(Cm1, 2RhaT)的克隆与表达分析
Cloning and Expression Analysis of a 1, 2Rhamnosyl-transferase Gene (Cm1, 2RhaT) from Citrus maxima cv.Liangping 513
农业生物技术学报
Journal of Agricultural Biotechnology
团的聚为一类，如:矮牵牛、拟南芥、葡萄、黑吉豆、
玉米，在C-5位置具有糖基化位点或糖基转移基团
的作用位点的聚为一类，如:紫苏、美女樱,在C-7位
置具有糖基化位点或糖基转移基团作用位点的聚
为一类，如:烟草、黄芩、彩虹菊，在 1，2位有酶作用
位点的柚、梁平柚聚为一类，在 1，6位具有酶作用
位点矮牵牛则单独形成一支。经过聚类分析可以
看出有相同糖基化位点或酶作用位点的能够聚为
一类，这也证实了本研究所获得的 Cm1,2RhaT基
因是在1，2位上有酶作用位点的鼠李糖基转移酶。
1.4原核表达载体的构建及诱导表达分析
用 BamHⅠ和 SacⅠ双酶切验证重组质粒
pET28a-CmRhaT，表明扩增的Cm1,2RhaT片段已插
入原核表达载体质粒中(图4)。进一步用特异引物
进行 PCR扩增鉴定，得到了与已知 Cm1,2RhaT基
因ORF框大小一致的特异片段(图 5)，对重组表达
质粒pET28a- CmRhaT进行了测序。测序结果表明
Cm1,2RhaT基因已经正确插入到原核表达载体
pET28a中，未出现碱基突变及移码现象，成功构建
Cm1,2RhaT基因的原核表达载体。从图 6来看，在
16℃，20℃，28℃，37℃诱导条件下都出现了大约
52 kD大小的特异条带，与预期结果一致。但破碎
上清中没有出现特异条带，说明没有产生可溶性蛋
白且诱导温度对诱导可溶性蛋白没有明显促进作
228.6
200 150 100 50 0
Nucleotide substitutions (×100)
Ph-3GalT(AAD55985)
Ph-3Glct(BAA89008)
At-3RhaT(AF360160)
Vv-3GlcT(AAB81683)
Vm-3GalT(BAA36972)
Zm-3GlaT(P16166)
Pf-5GlcT(BAA36421)
Vh-5GlcT(BAA36423)
Nt-7GlcT(AAB36653)
Sb-7GlcT(BAA83484)
Db-7GlcT(CAB56231)
Cm-1,2RhaT(AY048882)
CmLPY(JQ217381)
Ph-1,6RhaT(CAA50376)
图3 Cm1, 2RhaT与具有糖基转移基团的基因编码氨基酸聚类图
Figure 3 Phylogenetic tree based on amino acid sequences of Cm1, 2RhaT from Citrus maxima
3GalT：3-半乳糖转移酶；GlcT：3-葡萄糖基转移酶；5GlcT：5-葡萄糖基转移酶；7GlcT：7-葡萄糖基转移酶；1, 2RhaT：1, 2鼠李
糖基转移酶；1, 6RhaT：1, 6鼠李糖基转移酶；At：拟南芥；Cm：柚；CmLpY：梁平柚；Db：彩虹菊；Nt：烟草；Pf：紫苏；Ph:矮牵
牛；Sb：黄芩；Vh：美女樱；Vm：黑吉豆；Vv：葡萄；Zm：玉米；括号内是各基因的NCBI登录号
3GalT: 3- galactosyltransferase; 3GlcT: 3- glycosyltransferase; 5GlcT: 5- glycosyltransferase; 7GlcT: 7- glycosyltransferase; 1,
2RhaT: 1,2 rhamnosyltransferase; 1,6RhaT: 1,6 rhamnosyltransferase; At: Arabidopsis thaliana; Cm: Citrus maxima; CmLpY:
Liangpin Yu; Db: Dorotheanthus bellidiformis; Nt: Nicotiana tabacum; Pf: Perilla frutescens; Ph: Petunia hybrida; Sb: Scutellaria
baicalensis; Vh: Verbena hybrida; Vm: Vigna mungo; Vv: Vitis vinifera; Zm: Zea mays. The content in the brackets is the NCBI
accession No. of the corresponding protein
2000
1000
750
500
250
100
bp 1 2M
图4原核表达载体pET28a-CmRhaT的双酶切鉴定
Figure 4 Verification by double digestion of prokaryotic
expression vector pET28a-CmRhaT
M：DL2000 marker；1和2：pET28a- CmRhaT酶切产物
M: DL2000 marker; 1 and 2: Digested product of recombined
vector pET28a- CmRhaT
514
用。IPTG浓度的变化对目的蛋白的表达量没有明
显的影响，随着诱导时间的增加，目的蛋白的表达
量也在上升，在 4 h时达到最高，4 h后表达量没有
变化。因此，确定 37℃，1.0 mmol/L IPTG，4 h为
pET28a-CmRhaT在大肠杆菌BL21(DE3)中的最适
表达条件。
1.5重组目的蛋白的分离、纯化及复性
重组蛋白的分离、纯化及复性重组蛋白以包涵
体的形式存在，以6 mol/L的尿素溶解包涵体，并通
过透析复性，SDS-PAGE电泳结果(图 7)与预期一
致，结果显示分离纯化得到了较高浓度 0.526 mg/
mL和纯度95%的融合蛋白。
1.6 Cm1, 2RhaT基因在梁平柚中的表达分析
Cm1, 2RhaT基因在果实中的表达呈现波动式
降低(图 8)，说明在果实的不同生长发育阶段该基
因的表达量也是不同的，这与柚皮苷在果实中的积
累规律是一致的，幼果期柚皮苷含量最高，到了成
熟期时柚皮苷含量下降。果实的品质可以通过调
控该基因的表达来进行优化。
不论是果实还是叶片，在开花后 90 d到 120 d
之间Cm1,2RhaT基因表达量迅速升高，这种变化可
2000
1000
750
500
250
100
bp 1 2 3 4M
图5 pET28a-CmRhaT的PCR鉴定
Figure 5 PCR verification of pET28a-CmRhaT
M：DL2000 marker；1~3：阳性重组子；4：阴性对照
M: DL2000 marker; 1~3: Positive recombinant plasmid
pET28a-CmRhaT; 4: Negative control
97.4
66.2
43
31
20
14.4
kD 1 2 3 4 5 6 7 8M
56
kD
图6温度对pET28a-CmRhaT表达的影响
Figure 6 The expression of pET28a-CmRhaT at different
temperature
M：蛋白质标准分子质量；1：pET28a-CmRhaT 16℃破碎上
清；2：pET28a-CmRhaT 16℃破碎沉淀；3：pET28a-CmRhaT
重组质粒 20℃破碎上清；4：pET28a-CmRhaT重组质粒 20℃
破碎沉淀；5：pET28a-CmRhaT 28℃破碎上清；6：pET28a-
CmRhaT 28℃破碎沉淀；7：pET28a-CmRhaT 37℃破碎上清；
8：pET28a-CmRhaT 37℃破碎沉淀
M: Protein marker; 1, 3, 5 and 7: Supernatant after supersonic
(16℃, 20℃, 28℃ and 37℃); 2, 4, 6 and 8: Inclusion body after
supersonic(16℃, 20℃, 28℃ and 37℃)
97.4
66.2
43.0
31.0
20.0
14.4
kD 1 2M
图7重组目的蛋白的分离与纯化
Figure 7 The purification of fusion protein
M：蛋白质标准分子质量；1：纯化的后蛋白质；2：PTG诱导
后菌液
M: Protein marker; 1: Protein after purified and refolded; 2:
pET28a- CmRhaT induced by IPTG
图 8 Cm1,2RhaT在梁平柚果实(A)和叶片(B)不同时期的表
达分析
Figure 8 Expression analysis of the Cm1, 2RhaT in fruits
(A) and leaves(B) of different developmental of Citus
maxima cv. Liangping
Reference gene is β-actin, n=3, * P<0.05
1.0
0.8
0.6
0.4
0.2
0.0
30 60 90 120 150 180
开花后天数/d
Days after flowering
相
对
表
达
量
N
or
m
al
iz
ed
fo
ld
ex
pr
es
si
on *
A
0
10
8
6
4
2
30 60 90 120 150 180
开花后天数/d
Days after flowering
相
对
表
达
量
N
or
m
al
iz
ed
fo
ld
ex
pr
es
si
on
*
B
梁平柚鼠李糖基转移酶基因(Cm1, 2RhaT)的克隆与表达分析
Cloning and Expression Analysis of a 1, 2Rhamnosyl-transferase Gene (Cm1, 2RhaT) from Citrus maxima cv.Liangping 515
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能与果实即将进入成熟期体内的各种次生代谢产
物迅速积累有关。果实内的各种代谢产物迅速积
累，该基因的表达量明显上调，说明果实中柚皮苷
的大量积累。推测此时是梁平柚果实苦味形成的
25
20
15
10
5
30 60 90 120 150 180
相
对
表
达
量
N
or
m
al
iz
ed
fo
ld
ex
pr
es
si
on
0
*
开花后天数/d
Days after flowering
12
10
8
6
4
30 60 90 120 150 180
2
0
* *
开花后天数/d
Days after floweringA B
8
7
6
5
4
30 60 90 120 150 180
3
2
1
0
*
*
开花后天数/d
Days after flowering
90
80
70
60
50
30 60 90 120 150 180
40
30
20
10
0
开花后天数/d
Days after floweringC D
40
30
20
10
0
30 60 90 120 150 180
开花后天数/d
Days after flowering
3.0
2.5
2.0
1.5
1.0
30 60 90 120 150 180
0.5
0.0
*
开花后天数/d
Days after floweringE F
G H
1.0
0.8
0.6
0.4
0.2
30 60 90 120 150 180
开花后天数/d
Days after flowering
0.0
* 7
6
5
4
3
30 60 90 120 150 180
开花后天数/d
Days after flowering
2
1
0
*
图9 Cm1,2RhaT在费米耐劳、温州蜜柑、血橙和沙田柚的不同时期的表达分析
Figure 9 Expression analysis of the Cm1,2RhaT of Citrus limon.(L).Burm F.Femminello, Citus reticulate cv.Unshiu, Citrus
sinensis cv.(L.)Xuecheng and Citus maxima cv.Shatian in various stages
A：费米耐劳果实；B：费米耐劳叶片；C：温州蜜柑果实；D：温州蜜柑叶片；E：血橙果实；F：血橙叶片；G：沙田柚果实；H：沙田
柚叶片；内参基因为β-actin，n=3，*P<0.05
A: The fruit of Citrus limon L.Burm F. Femminello; B: The leaves of Citrus limon.(L).Burm F. Femminello; C: The fruit of Citus
reticulate cv. Unshiu; D: The leaves of Citus reticulate cv. Unshiu; E: The fruit of Citrus sinensis cv.(L.) Xuecheng; F: The leaves
of Citrus sinensis cv.(L.) Xuecheng; G: The fruit of Citus maxima cv. Shatian; H: The leaves of Citus maxima cv. Shatian;
Reference gene is β-actin, n=3, * P<0.05
相
对
表
达
量
N
or
m
al
iz
ed
fo
ld
ex
pr
es
si
on
相
对
表
达
量
N
or
m
al
iz
ed
fo
ld
ex
pr
es
si
on
相
对
表
达
量
N
or
m
al
iz
ed
fo
ld
ex
pr
es
si
on
相
对
表
达
量
N
or
m
al
iz
ed
fo
ld
ex
pr
es
si
on
相
对
表
达
量
N
or
m
al
iz
ed
fo
ld
ex
pr
es
si
on
相
对
表
达
量
N
or
m
al
iz
ed
fo
ld
ex
pr
es
si
on
相
对
表
达
量
N
or
m
al
iz
ed
fo
ld
ex
pr
es
si
on
516
一个关键时期。开花后180 d，也就是果实成熟期，
该基因表达量达到最低。可以推测，果实成熟期时
柚皮苷含量较低，果实品质变优。
本研究中，开花后30 d(幼果期)期间，该基因在
梁平柚果实和叶片中的表达量最高。在开花后 30
d(幼果期)到开花后 90 d(果实膨大期)直至开花后
180 d(果实成熟期)，该基因在梁平柚果实和叶片中
的表达量降低。各个时期的基因表达量和柚果实
中柚皮苷的含量变化趋势一致。通过该基因的研
究，揭示了柚皮苷在柚果实中的变化趋势。
开花后150 d，Cm1,2RhaT的同源基因在温州蜜
柑的果实和叶片表达量达到最高(图9C, D)。开花
后 60 d时Cm1,2RhaT的同源基因在费米耐劳果实
中的表达量达到最高，而叶片则在开花后150 d时，
Cm1,2RhaT的同源基因的表达量达到最高(图 9 A,
B)。开花后 150 d，Cm1,2RhaT的同源基因在血橙
果实中的表达量达到最高，而叶片则在开花后 120
d时，Cm1,2RhaT的同源基因的表达量达到最高(图
9 E, F)。开花后 30 d，Cm1,2RhaT的同源基因在沙
田柚的果实和叶片中的表达量最高(图 9 G, H)。
所有品种的果实在开花后 90 d时Cm1,2RhaT的同
源基因都有一次低丰度表达，在开花后 180 d时迅
速降低。
开花后30~180 d期间，Cm1,2RhaT基因在温州
蜜柑、费米耐劳、梁平柚、沙田柚、血橙的果实和叶
片中呈波动性表达模式。不论是果实还是叶片，
在开花后 120 d或 150 d时Cm1,2RhaT基因及其同
源基因都有一次表达升高的趋势，其中梁平柚最
明显。开花后 30 d该基因及其同源基因在梁平柚
和沙田柚中的表达量相对较高，推测该基因参与
了果皮的形成与果皮中的黄烷酮类化合物的积
累。血橙果实的变化趋势可能与果实进入成熟期
后体内的各种次生代谢产物迅速积累有关。果实
内的各种代谢产物迅速积累，该基因的表达量明
显上调，说明果实中代谢产物尤其是柚皮苷的大
量积累。推测此时是柑橘类果实苦味形成的一个
关键时期。
2讨论
本实验从梁平柚中获得 1 359 bp鼠李糖基转
移酶基因 Cm1,2RhaT，该基因编码 453个氨基酸。
通过 blastX分析，Cm1,2RhaT基因属于GTB超家
族，UDP-glycosyltransferase是一个超家族酶类，从
UDP-糖类转移一个糖基到一个小的亲水基团上，
通过保守结构域搜索分析，该基因具有保守的
UDP-葡萄糖转移酶结构域，具有转移糖基基团的
功能。与Frydman等(2004)克隆的 1,2鼠李糖基转
移酶特征相同。通过与具有糖基转移基团的基因
的氨基酸聚类分析，该基因能够和 1,2鼠李糖基转
移酶聚为一类，推测本研究获得的基因即为 1,2鼠
李糖基转移酶基因。
本研究将 Cm1,2RhaT基因克隆到 pET-28a(+)
表达载体中，经 IPTG诱导和SDS-PAGE分析发现，
融合蛋白多以包涵体形式存在。通过降低诱导温
度，从而降低目的蛋白的表达量，但未有可溶性蛋
白出现。本实验通过提取包涵体，通过 6 mol/L尿
素溶解包涵体，利用试剂盒分离纯化，最后复性得
到高浓度和纯度的融合蛋白。进行酶活性检测时，
需要UDP-鼠李糖和 naringenin-7-O-glucoside这两
种底物，然而，UDP-鼠李糖没有商品化生产，所以
酶活性检测受到了很大程度上的限制，这是本研究
的一大难点，有待于进一步探索。
从开花后 30~180 d，分别对 5种柑橘品种中的
Cm1,2RhaT的表达量进行荧光定量分析。5个品种
都有表达且呈波动性表达模式，在开花后180 d(果
实成熟期)时，该基因及其同源基因的表达量明显
下降。而对于该基因调控合成的柚皮苷，许多学者
对其进行了研究。
在不同的柑橘组织器官中，Bar-Peled等(1993)
等从蛋白水平研究葡萄柚中的鼠李糖基转移酶的
含量，结果显示在幼嫩的果实和叶片中的含量很
高，且其在叶片中的含量要比果实中的要高。本研
究中各个时期该基因在叶片中的的表达量明显比
果实中的高，但在 180 d时都明显降低。这可能与
柑橘果实成熟以后该基因低丰度表达，果实中糖发
酵的开始而导致的。
在不同生长时期，Castillo等(1992)、Jourdan等
(1985)、Ortuno等(1995)、Nogata等(2006)认为在幼
嫩的果实和叶片中柚皮苷含量最高。幼果期果实
的主要成分是果皮，果皮中的柚皮苷在此时迅速合
成，因而幼果期间柚皮苷含量极高(杨爽等, 2007a;
Nogata et al., 2006;杨爽等, 2007b)。本研究中各个
时期该基因及其同源基因在开花后 30 d时该基因
就有表达，随着果实发育时间的延长而逐渐下降。
不同生长时期的柚果实中柚皮苷含量随果实发育
时间的延长而下降，幼果期到果实膨大期间柚皮苷
梁平柚鼠李糖基转移酶基因(Cm1, 2RhaT)的克隆与表达分析
Cloning and Expression Analysis of a 1, 2Rhamnosyl-transferase Gene (Cm1, 2RhaT) from Citrus maxima cv.Liangping 517
农业生物技术学报
Journal of Agricultural Biotechnology
的含量直线下降，膨大期到成熟期柚皮苷含量下降
(吴厚久等, 1995; Rouseff et al., 1987)。梁平柚和
沙田柚中该基因及其同源基因在幼果期的表达量
最高，且幼果期到成熟期该基因及其同源基因的表
达量与Castillo等(1992)；杨爽等(2007 b)；吴厚久等
(1995)所得到柚皮苷的变化趋势一致。说明该基
因能够反应柚果实中柚皮苷的变化趋势，成熟期时
该基因的表达量和柚皮苷的积累达到一个较低水
平，在温州蜜柑和梁平柚中，他们在各个时期都有
表达，但Cm1,2RhaT基因在梁平柚中的表达量比其
同源基因在温州蜜柑中的表达量要高，致使开花后
180 d的积累量的有所差异。若能通过调控果实发
育早期的Cm1,2RhaT基因的表达，调控柚皮苷的合
成和积累，达到控制各个品种果实中的柚皮苷的积
累量。其次，在开花后 30 d时，Cm1,2RhaT基因及
其同源基因在梁平柚、沙田柚中的表达量与温州蜜
柑中的表达量差异明显，可能对无苦味柚的早期筛
选有帮助。
本研究从梁平柚中克隆得到Cm1,2RhaT基因
的cDNA序列，分析显示在329~372位有UDP-糖基
转移酶保守结构。分离、提纯该酶，为研究该酶的
体外活性以及在柑橘中的次生代谢酶促反应机制
提供基础数据。通过对该基因的荧光定量分析揭
示了其合成的柚皮苷在梁平柚、沙田柚等的果实形
成过程中的分布与积累，为无苦味柚品种的选育提
供一定的理论基础。
3材料与方法
3.1实验时间、地点
本研究室内实验于 2010~2011年在南方山地
园艺学教育部重点实验室/重庆市花卉工程研究中
心进行。
3.2实验材料
3.2.1植物材料
梁平柚(Citus maxima cv. Liangping)、温州蜜柑
(Citus reticulate cv. Unshiu)、费米耐劳(Citrus limon.
(L.)Burm F.Femminello)、沙田柚 (Citus maxima cv.
Shatian)和血橙 (Citrus sinensis cv.(L.) Xuecheng)等
成年树幼叶、果实，采摘于中国农科院柑橘研究所
资源圃，取新鲜叶片于-70℃冰箱保存备用。
3.2.2菌株、载体及主要试剂 大肠杆菌感受态菌
DH5α购自天根生物技术(北京)有限公司，原
核表达载体 pET-28a(+)及宿主菌(Escherichia coli)
BL21(DE3)为本实验室保存。克隆载体pMD19-T、
限制性内切酶BamHⅠ和SacⅠ、T4 DNA连接酶、反
转录试剂盒 PrimeScriptTM RT reagent Kit均购于大
连TaKaRa公司。RNA提取试剂盒为TIANGEN公
司生产的 RNAprep pure Plant Kit试剂盒。SDS-
PAGE低分子量标准蛋白质及其他分析纯均购于上
海生物工程有限公司，引物由华大基因合成。
3.3实验方法
3.3.1叶片DNA、总RNA提取及cDNA第一链的合成
以梁平柚成年树幼叶为试材，按照TIANGEN
公司 Plant Genomic DNA Kit试剂盒提取基因组
DNA。分别提取温州蜜柑、费米耐劳、梁平柚、沙
田柚、血橙5个柑橘品种开花后30、60、90、120、150
和 180 d的 RNA用 TIANGEN公司 RNAprep pure
Plant Kit 试剂盒提取总 RNA，按 TaKaRa 公司
PrimeScriptTM RT reagent Kit试剂盒说明书合成
cDNA第一链，-20℃保存备用。
3.3.2寡核苷酸引物
根据GenBank上公布的已知的Cm1,2RhaT基
因 的 cDNA 序 列 (GenBank accession number:
AY048882)设计一对引物：
F：RhaTF5-CTTGTCATGAATACCAAGCATCAAGATAAG-3
R：RhaTR5-GCATCCTTATTCAGATTTCTTGACAAGC-3。
3.3.3梁平柚鼠李糖基转移酶基因的克隆
分别取梁平柚DNA、cDNA 1 μL为模板进行
PCR扩增，PCR产物连接pMD19-T载体，挑选阳性
克隆送华大基因测序。连接有 Cm1,2RhaT基因
cDNA序列的重组质粒记作pMD19T-CmRhaT。
3.3.4核酸及氨基酸序列分析
通过ORF Finder (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/
gorf/gorf.html)分析 Cm1,2RhaT的 cDNA的开放读
码框；利用 ExPASy Proteomics Server(http://www.
expasy.org/tools)分析蛋白质分子量、等电点和亲水
性；利用 BLAST软件(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/
BLAST)进行序列相似性搜索；参照 Ahuva
Frydman等方法并利用DNAStar软件进行同源比
对和氨基酸聚类分析。
3.3.5表达载体pET28a-CmRhaT的构建及鉴定
518
分析该基因的限制性酶切位点并结合原核表达
载体 pET-28a(+ )的特点，利用 Premier 5.0软件在
Cm1,2RhaT基因全长 cDNA开放阅读框(ORF)的 5
和3末端设计1对特异性上下游引物:
RhaT-P1：5-CGGGATCCATGAATACCAAGCATCAAGATAAGC -3；
BamHⅠ
RhaT-P2：5-CGAGCTCATTGCATCCTTATTCAGATTTCTTG -3。
SacⅠ
斜体部分为保护碱基。将重组质粒 pMD19T-
CmRhaT与原核表达载体 pET-28a(+)分别用BamH
Ⅰ和 SacⅠ双酶切后回收并纯化，用T4连接酶过夜
连接后转化E.coli DH5α感受态细胞，挑选阳性克
隆送华大基因测序，验证基因序列及读码框的正确
性，融合表达载体命名为pET28a-CmRhaT。将序列
分析正确的载体 pET28a-CmRhaT转入E.coli BL21
(DE3)中。
3.3.6重组Cm1,2RhaT在BL21(DE3)中的表达及表
达体系优化
将表达菌株接种于含50 μg/mL卡那霉素的液
体LB培养基中，37℃振荡培养至OD600≈0.6，加入
终浓度为 1 mmol/L的 IPTG，诱导表达 4 h，收集菌
体，用 1×PBS重悬菌体。超声破碎 5 min。在 4℃、
13 000 r/min下离心 10 min，分离上清和沉淀。对
全菌、裂解的上清和沉淀进行 SDS-PAGE电泳分
析。未诱导的的重组表达载体和空载体作为对
照。检测融合蛋白的表达情况。在保持菌种不改
变的前提下，按照依次改变诱导温度 16℃、20℃、
28℃、37℃，IPTG终浓度 0.1、0.4、0.8和 1.0 mmol/L
及诱导时间2、4、6和8 h，来优化表达并分别收集培
养产物，分离培养基和菌体，菌体超声破碎后，分离
上清和沉淀，分别经SDS-PAGE分析蛋白的分布情
况及确定最适表达条件。
3.3.7 融合蛋白的 pET28a-CmRhaT的分离纯化与
复性
参照默克公司的蛋白纯化系统操作指南，用
Ni2+-NTA亲和层析柱进行纯化，过柱后得到的融合
蛋白在一定尿素梯度的透析缓冲液(4、3、2、1.5、1、
0.5和 0 mol/L清水)下中，按尿素浓度从高到低于
4℃低温透析，每 6 h更换 1次透析缓冲液，最后在
清水中透析 12 h。并利用Bradford法测定复性后
蛋白质含量 (汪家政,范明, 2002)。
3.3.8基因表达特征分析
基因表达特性分析使用 SYBR Green 荧光染
料法，在 CFX96 (Bio-Rad)实时荧光定量 PCR仪上
对温州蜜柑、费米耐劳、梁平柚、沙田柚、血橙 5个
柑橘品种开花后 30、60、90、120、150和 180 d的果
实和叶品中Cm1, 2RhaT基因及其同源基因的表达
情 况 进 行 实 时 荧 光 定 量 PCR (Real- time
quantitative PCR)分析，选取柑橘β-Actin基因作为
目标基因定量表达的内参基因(表2)根据SsoFastTM
EvaGreen Supermix试剂盒(Bio-Rad)说明配制反应
体系，每个样品设 3个技术重复。反应体系中含有
5 μL SsoFast EvaGreen Supermix，上下游引物 (10
μmol/L)各 0.5 μL，模板 (50 ng/μL) 0.5 uL，得到
ddH2O 3.5 μL，总体积 10 μL。反应程序:98℃预变
性 30 s；95℃变性 5 s，60℃退火/延伸 5 s(每次循环
后采集荧光)，40个循环；95℃变性10 s，65~95℃做
溶解曲线分析，每个温度以每步0.5℃上升，每个温
度停留 5 s。实验数据通过 Bio- Rad ManagerTM
Software进行分析，用2-△△Ct法(Livak et al., 2001)获
得Cm1,2RhaT基因及其同源基因的相对表达量。
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表1实时荧光定量PCR引物序列
Table 1 Primer sequences used in Real-time quantitative PCR
基因名称
Gene
β-actin
Cm1, 2RhaT
上游引物序列(5~3)
Forward primer
CCAAGCAGCATGAAGATCAA
AGGAGCCTCGTTCAGTCGTGTATGC
下游引物序列 (5~3)
Reverse primer
ATCTGCTGGAAGGTGCTGAG
AGGAGCCTCGTTCAGTCGTGTATGC
梁平柚鼠李糖基转移酶基因(Cm1, 2RhaT)的克隆与表达分析
Cloning and Expression Analysis of a 1, 2Rhamnosyl-transferase Gene (Cm1, 2RhaT) from Citrus maxima cv.Liangping 519
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梁平柚鼠李糖基转移酶基因(Cm1, 2RhaT)的克隆与表达分析
Cloning and Expression Analysis of a 1, 2Rhamnosyl-transferase Gene (Cm1, 2RhaT) from Citrus maxima cv.Liangping
动力学原理解析艾滋病毒HIV-1蛋白酶成熟的关键步骤
Kinetic characterization of the critical step in HIV-1 protease maturation
艾滋病毒(HIV)，和所有其他的逆转录病毒一样，成为有传染性的成熟新生病毒颗粒需要通过病毒蛋白酶裂解聚合
蛋白前体。包括蛋白酶本身在内的GagPol链包含有多个共价连接的前体蛋白。从结构上看，在这个分子内部裂解的过程
中，HIV蛋白酶的一端(N端)会与自身活性位点结合，然后切开自身与其余蛋白链之间的化学键。这是整个HIV成熟过程
的第一步，研究人员指出若能在病毒成熟过程中阻断HIV蛋白酶将自身从多蛋白链中剪切出来的过程，就能够使病毒颗
粒无法成熟，也就不能产生有传染性的病毒。近期 IMIM(Hospital del Mar Medical Research Institute)和Pompeu Fabra大学
的生物信息学家使用分子模拟技术揭示了HIV病毒成熟的关键步骤，该研究发表在最近一期的美国《国家科学院院刊》
(PNAS)杂志上，帮助人们进一步了解了新生惰性病毒成为传染性病毒的过程。
研究人员利用超级计算机提供的分子模拟软件ACEMD和GPUGRID.net技术，在此技术平台上处理了大量数据，进
行了数千个计算机模拟，并最终完成了高度复杂的模拟模型。整个HIV成熟过程中最令人感兴趣的是HIV蛋白酶(“蛋白
剪刀”)从蛋白长链中解离出来的机制(病毒的其他功能蛋白也要从聚合蛋白长链中剪切下来才能执行其功能)。该研究从
N-末端自催化、分子构象变化、构象与能量的关系及生化反应动力学机理几个方面，展示了“蛋白剪刀”将自身从多蛋白链
中剪切出来的过程：研究结果表明，最初的切割发生在蛋白聚合体分子内部，由嵌在GagPol链上的蛋白酶前体来完成。从
催化反应效率来看，完成这个病毒前体加工过程的绝对唯一的前提条件是蛋白酶N末端的自动加工。从分子结构上来
看，HIV蛋白酶的N端与其自身活性位点相结合的过程，由一对灵活的β发夹结构调控，该发夹结构通过开启和关闭来纳
入需要剪切的位点，使得剪切反应在一个结构上保守的识别模式下进行。然而，在原子水平上阐明这一瞬间过程的全部
细节才是这项研究的挑战性目标。在此，研究人员推导出一个与HIV-1蛋白酶N-端关联的计算机模拟自催化剪切过程。
并在原子分辨率水平上研究了 HIV-1蛋白酶N端识别位点及自身的裂解过程，从而提供给我们分子内裂解机制的证据，
HIV病毒感染引发的艾滋病是一种免疫缺陷性疾病，病毒直接攻击并削弱人体免疫系统，使患者更容易遭受其他感染
性疾病的攻击。这项研究利用计算机模拟技术，向我们展示了HIV生命周期关键步骤中蛋白酶自我剪切的过程及HIV成
熟的机制，对这一过程的揭示，为设计和研制新型抗艾滋病毒的药物提供了直接的依据。
编者：田兆丰(北京市农林科学院植保环保所)，本刊通讯员
本文引用格式：田兆丰, 2013.动力学原理解析艾滋病毒HIV-1蛋白酶成熟的关键步骤.农业生物技术学报，21(5): 521
信息来源：Published online before print November 26, 2012, PNAS December 11, 2012 vol. 109.
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