全 文 ：作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2011, 37(11): 1926−1934 http://www.chinacrops.org/zwxb/
ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9 E-mail: xbzw@chinajournal.net.cn

本研究由国家重点基础研究发展计划(973计划)项目(2010CB134404), 甘肃省自然科学基金项目(0710RJZA088)和教育部博士生国内
访学项目(Z107-020901)资助。
* 通讯作者(Corresponding authors): 张金文, E-mail: jwzhang305@163.com, Tel: 0931-7631167; 王蒂, E-mail: wangd@gsau.edu.cn, Tel:
0931-7631167
第一作者联系方式: E-mail: wangw@gsau.edu.cn
Received(收稿日期): 2011-04-27; Accepted(接受日期): 2011-07-15; Published online(网络出版日期): 2011-09-06.
URL: http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20110906.1104.014.html
DOI: 10.3724/SP.J.1006.2011.01926
马铃薯块茎糖基转移酶基因的克隆及其 RNAi载体的构建
王旺田 1,2 张金文 1,2,* 王 蒂 1,2,* 张俊莲 1,2 司怀军 1,2 陶士珩 3
1 甘肃农业大学农学院, 甘肃兰州 730070; 2 甘肃省作物遗传改良与种质创新重点实验室, 甘肃兰州 730070; 3 西北农林科技大学生
命科学学院, 陕西杨凌 712100
摘 要: 为探讨鼠李糖基转移酶(rhamnosyltransferase, sgt3)基因与类固醇糖苷生物碱(steroidal glycoalkaloid, SGAs)
合成关系, 揭示 sgt3 基因在 SGAs 合成中的作用, 本研究根据 GenBank No: DQ266437 保守区设计特异引物, 通过
RT-PCR 技术获得马铃薯块茎 sgt3 相似基因; 采用生物信息学相关软件分析, 预测 sgt3 相似基因 cDNA 序列编码的
蛋白质结构和功能, 构建基于 sgt3基因的植物干扰表达载体。结果表明, 克隆的 sgt3相似基因与报道的 sgt3基因序
列相似性达到 99.54%, 其 ORF长为 1 500 bp, 编码 505个氨基酸残基, 具有 UDPG糖基转移酶保守结构域及许多重
要功能位点; 三级结构预测表明, 该氨基酸同糖基转移酶单体结构模型相似, 为糖基转移酶家族成员, 表明可能具
有合成类固醇糖苷生物碱功能, 基因序列已注册到 GenBank, 序列登录号为 HM188447。以此为靶序列, 构建由 Actin
启动子和 CIPP启动子驱动的与 sgt1和 sgt2基因相似度高的含有 sgt3基因序列的干扰表达载体, 将为糖苷生物碱的
合成、代谢的进一步研究及低糖苷生物碱转基因马铃薯品种的培育奠定基础。
关键词: 马铃薯; 鼠李糖基转移酶; 基因克隆; 序列分析; RNAi载体
Cloning of Rhamnosyl Transferase Gene and Construction of Its RNAi Vector
in Potato
WANG Wang-Tian1,2, ZHANG Jin-Wen1,2,*, WANG Di1,2,*, ZHANG Jun-Lian1,2, SI Huai-Jun1,2, and TAO
Shi-Heng3
1 College of Agronomy, Gansu Agricultural University, Lanzhou 730070, China; 2 Gansu Key Laboratory of Crop Genetic & Germplasm Enhance-
ment, Lanzhou 730070, China; 3 College of Life Sciences, Northwest A&F University, Yangling 712100, China
Abstract: Steroidal glycoalkaloids (SGAs) are potentially harmful metabolites found in potatoes and other Solanaceous plants.
SGAs accumulation affects food quality and safety, we hope to use molecular biology methods to reduce SGAs content and assist
breeding efforts to ensure food safety, develop new and improved varieties of potatoes. To investigate the relationship between the
gene expression of the rhamnosyltransferase (sgt3) and the biosynthesis of steroidal glycoalkaloid (SGAs), and reveal the role of
sgt3 gene in biosynthetsis of potato steroidal glycoalkaloid, similar gene cDNA sequence of the potato sgt3 was obtained from the
total RNA of potato tubers by reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) using specific primers synthesized ac-
cording to the conserved domain of GenBank No: DQ266437 sequence. The protein function and structure of the similar sgt3
gene cDNA sequence were predicted and analyzed by related software of bioinformatics technology. Interference expression vec-
tor based on sgt3 gene was constructed. The Blast result showed that the gene sequence shared a high level of similarity with the
sgt3 gene in GenBank (accession No: DQ266437) and its homology was 99.54%, and similarity of the amino acid sequence was
99%. The full-length of cDNA was 1 500 bp, which contained 505 amino acids, UDPG glycosyltransferase conserved domain and
many important functional sites. The 3D structure of protein was predicted by homology comparative modeling in Swiss-Model,
the results showed that the 3D structure of SGT3 was highly similar to that of the glycosyltransferase, so it was inferred that SGT3
第 11期 王旺田等: 马铃薯块茎糖基转移酶基因的克隆及其 RNAi载体的构建 1927


should be a member of glycosyltransferase superfamily that has function of steroidal glycoalkaloid. Sgt3 similar gene obtained
here was rhamnosyl transferase gene, and its sequence was submitted with GenBank No: HM188447. The RNA interference
transformation expression vector in which sgt3 gene was regulated by Actin and CIPP promoters was constructed, which will lay
a solid foundation for the synthesis of alkaloids glycosides, further research of metabolism and cultivation of transgenic potato
varieties with low indican alkaloids character.
Keywords: Potato; sgt3 gene; Gene cloning; Sequence analysis; RNA interference vector
类固醇糖苷生物碱(steroidal glycoalkaloid, SGAs)
是茄科和百合科等许多植物主要的次生代谢产物 ,
其含量除受遗传控制外, 还受环境因素影响[1-3], 同
时对植食动物或昆虫的取食及微生物的攻击给以积
极的应答, 是关系生物防治的途径之一[4]。在栽培马
铃薯(Solanum tuberosum L.)中 α-茄碱和 α-查茄碱是
2 个天然存在的主要的类固醇糖苷生物碱, 占总生
物碱苷类的 95%[5], 是糖苷配基糖基化形成的产物,
而糖基化反应需要数量众多的糖基转移酶协同作用,
并且糖基化被认为是植物次生代谢产物形成的最重
要的一个修饰反应, 在维持细胞内稳态中扮演了重要
的角色, 参与调节植物的生长、发育和防御反应[6-7]。
在马铃薯 SGAs 代谢途径上目前较清楚的是从乙酰
CoA 开始[8], 形成胆固醇, 再经糖基化逐步形成茄
碱和查茄碱, 由于 α-茄碱和 α-查茄碱具有毒副作用
及累积效应, 长期食用会在体内积累, 引起人畜中
毒。在开发低糖苷生物碱的转基因马铃薯中, 利用
反义技术已有报道[9], 但未见利用 RNA 干扰(RNA
interference, RNAi)技术创制低糖苷生物碱马铃薯转
基因的报道。RNAi是利用RNA序列特异性匹配, 通
过双链 RNA 介导诱发的高效特异的降解与之同源
的 mRNA 的现象, 在转录水平、转录后水平或翻译
水平抑制靶基因表达[10-13]。而在马铃薯类固醇糖苷
生物碱代谢途径上受多个代谢调控点的协调, 其中
龙葵次碱鼠李糖基转移酶基因(sgt3)是最靠近 α-茄
碱和 α-查茄碱生物合成的调控点。
本研究通过克隆 sgt3基因及用生物信息学方法
分析 sgt3 基因编码氨基酸的保守序列, 选择 RNAi
目标片段, 构建用于农杆菌转化的含 sgt3 基因序列
的 RNAi植物表达载体, 旨在通过 RNAi方法将糖基
转移酶基因导入马铃薯, 为低糖苷生物碱转基因马
铃薯品种的培育奠定基础, 并为研究糖苷生物碱合
成与代谢过程中的功能提供基础资料。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
马铃薯品种庄薯 3号(糖苷生物碱含量相对较高)
试管薯和大肠杆菌 DH5α 由甘肃省作物遗传与改良
重点实验室保存。克隆载体 pGE00000000000M-T
Easy vector购于大连 TaKaRa公司。p2300-actin 载
体、pUCCRNAi克隆载体由中国农业科学院生物所
黄荣峰研究员惠赠。总 RNA 提取试剂盒、cDNA
第一链合成试剂盒、DNA聚合酶、琼脂糖凝胶回收
试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司。
1.2 马铃薯块茎总 RNA提取与 cDNA合成
用天根生化科技(北京)有限公司的植物总 RNA
提取试剂盒结合 Trizol 试剂盒提取马铃薯块茎总
RNA, 用甲醛变性琼脂糖凝胶电泳和核酸蛋白检测
仪检测总 RNA 质量。采用 M-MLV 反转录酶合成
cDNA第一链。
1.3 马铃薯鼠李糖基转移酶基因引物设计及克
隆
根据已报道鼠李糖基转移酶基因(GenBank 登
录号为 DQ266437)的编码序列, 用 Premier5.0 设计
1对引物 P1(表 1), 由北京三博远志生物有限责任公
司合成。PCR反应体系为 cDNA模板 1 μL, 2.5 mmol
L−1 dNTP 2 μL, 10×pfu buffer 5 μL, 10 pmol L−1 N-端
和 C-端引物各 1 μL, 3 U μL−1 pfu聚合酶(Promega)
0.5 μL, ddH2O补足至 50 μL。PCR反应条件为 95℃
预变性 2 min; 94℃变性 60 s, 54℃退火 50 s, 72℃延
伸 90 s, 30个循环; 72℃延伸 10 min; 4℃保存。PCR
产物经 1.0%琼脂糖凝胶电泳检测。将扩增得到的目
的片段用琼脂糖凝胶试剂盒回收纯化, 与 PGEM-T
Easy 载体连接, 连接产物转化 DH5α 感受态细胞,
涂于含有 Amp/X-gal/IPTG 的 LB固体培养基上, 蓝
白斑筛选后, 挑取白色菌落, 提取质粒, 用 EcoR I
进行酶切、PCR (反应体系和条件同前)鉴定, 选择阳
性克隆 10个样品(命名为 pSGT)送天根生化科技(北
京)有限公司进行 DNA序列测定。
1.4 马铃薯鼠李糖基转移酶基因的序列分析
通过 DNAMAN 软件拼接测序结果 , 利用
GENSCAN (http://genes.mit.edu/GENSCAN)在线分
析基因预测, 并用 http://us.expasy.org/tools/dna.html
的DNA序列翻译工具, 将这些拷贝的核苷酸序列翻
译成氨基酸序列; 采用 NCBI (http://www.ncbi.nlm.
1928 作 物 学 报 第 37卷

nih.gov/Structure/cdd/cdd.shtml)保守功能区 (conserve
domain)在线分析马铃薯鼠李糖基转移酶保守序列;
多序列比对 MEGA2.0 软件在默认参数下进行; 利
用 ProtParam 在线分析软件 (http://www.au.expasy.
org/tools/protparam.html)分析序列确定外显子和内
含子结构。三级结构利用 Phyre 网站分析, 用 PSI-
BLAST方法多序列比对建模进行三级结构预测。
1.5 RNAi目标区段选择、引物设计及亚克隆
对克隆到的马铃薯鼠李糖基转移酶基因序列在
线分析保守区, 在非保守区和保守区内选择与 sgt1、
sgt2基因相似的区段在 NCBI中在线 Blast分析, 选
择在马铃薯基因组中特异的 300~400 bp的片段作为
RNA干扰区段。使用 Primer5.0程序设计引物 P2 (克
隆非保守区内 RNAi 目的片段)、P3 (克隆保守区内
RNAi 目的片段), 并在引物两端分别加上 Xho I 和
Bgl II位点序列(表 1)。以克隆的 pSGT质粒为模板、
分别以 P2、P3为引物进行 PCR扩增, PCR反应体系
同 1.3, PCR反应条件为 95℃预变性 3 min; 94℃变性
30 s, 50℃退火 30 s, 72℃延伸 60 s, 30个循环; 72℃
延伸 10 min; 4℃保存。扩增产物经琼脂糖凝胶纯化
回收后克隆到 pGEM-T Easy载体上。经 PCR、酶切
检测, 正确的阳性克隆, 命名为 pSGTI1/pSGTI2。

表 1 目的基因 PCR扩增引物
Table1 Specific PCR primers for target genes
基因
Gene
引物序列
Primers sequence (5′–3′)
退火温度
Annealing temperature ( )℃
产物长度
Length of product (bp)
P1 F: ATGGCGATGGAACAGAATGAAG R: TCAAGAGGATTTCTTGAAAGCACAAC 55.3 1518
P2 F: ggctcgagGTTTTTGATTCCTGGTTTGC R: gcagatctCAATCACCGTACCCTTTCC 52.1 324
P3 F: ggctcgagATCCAAGGCTGGGCACCAC R: gcagatctACAACGCTTGATCTCCTC 52.2 408

1.6 中间过渡载体及 RNAi载体构建
对亚克隆得到的阳性克隆 pSGTI1质粒用 Xho I
和 Bgl II双酶切, pUCCRNAi质粒用 Xho I和 Sal I、
BamH I和 Bgl II酶切, 分别回收 pSGTI1质粒酶切
产物的 RNAi 目标区段 324 bp 片段和 pUCCRNAi
质粒酶切产物的 2 650 bp片段、200 bp片段。将回
收的 RNAi目标区段与 pUCCRNAi质粒酶切回收的
片段按一定比例混合 , 加入 T4 DNA 连接酶 , 在
16℃条件下连接过夜; 连接产物转化 DH5α 感受态
细胞, 通过 PCR 鉴定和酶切鉴定筛选出重组克隆,
将此含 RNAi 目标区段的中间载体命名为 pUCC-
SGTI1, 送 2个克隆样品到天根生化科技(北京)有限公
司进行 DNA序列测定。pUCCSGTI2的构建过程同
pUCCSGTI1。
对测序正确的 pUCCSGTI1/pUCCSGTI2质粒、
p2300-actin 质粒分别用 Pst I 酶切 , 分别回收含
RNAi 目标区段的正向序列加内含子和反向序列片
段及 p2300-actin酶切产生的线状分子片段。用碱性
磷酸化酶, 在 37℃处理 p2300-actin片段 30 min, 用
苯酚∶氯仿∶异戊醇=25∶24∶1 的液体抽提, 醋酸
钠、无水乙醇沉淀回收目的片段, 将回收的两个片
段按照一定的比例混合, 在 16℃、T4 DNA 连接酶
条件下连接过夜, 连接产物转化 DH5α 感受态细胞,
涂布在含有 Kan+的 LB固体平板上, 通过 PCR和酶
切鉴定筛选出重组克隆 , 命名为 p2300SGTI1/
p2300SGTI2。
2 结果与分析
2.1 总 RNA的提取及糖基转移酶基因的克隆
以马铃薯庄薯 3 号试管薯为材料, 采用植物总
RNA提取试剂盒结合 Trizol试剂盒提取总 RNA (图
1)。利用扩增鼠李糖基转移酶基因 PCR引物 P1, 扩
增庄薯 3号的 cDNA, 获得 1条约 1 500 bp的特异条
带(图 2), 其长度与已报道马铃薯鼠李糖基转移酶基
因序列相当。经 1%琼脂糖凝胶试剂盒回收纯化后,
与 pGEM-T Easy载体连接, 经 EcoR I酶切, 得到约
1.5 kb 的目的片段, 正好与 sgt3 基因的分子大小相
符(图 3)。由此可初步确定目的片段已连接到
PGEM-T Easy载体上。

图 1 马铃薯试管薯总 RNA提取
Fig. 1 Electrophoregram of extracted total RNA from potato
tubers
第 11期 王旺田等: 马铃薯块茎糖基转移酶基因的克隆及其 RNAi载体的构建 1929



图 2 电泳检测 sgt3 PCR产物
Fig. 2 Electrophoregram of sgt3 PCR products
1: D2000 marker; 2: PCR产物。1: D2000; 2: PCR product.

图 3 电泳检测 pSGT酶切产物
Fig. 3 Electrophoregram of pSGT digested products
1: EcoR I酶切鉴定; 2: D2000 marker。
1: identification by EcoR I; 2: D2000 marker.

2.2 马铃薯 sgt3基因的克隆及序列分析
阳性克隆经天根生化科技有限公司测序后, 用
分子生物学软件 DNAMAN 对测序结果与报道的
sgt3 基因序列进行对比后发现, 获得的目的片段的
核苷酸序列与已公布的 sgt3基因序列只有 7个碱基
差异(表 2), 相似性为 99.54%, 根据 ProtParam 软件
预测表明, 克隆到的 sgt3 相似基因序列为一个完整
的开放阅读框, 编码 505 个氨基酸(图 4), 其中异亮
氨酸含量最高(9.1%), 酪氨酸最少(1.6%), 与 sgt3氨
基酸序列的相似性 99.01%, 在 7 处碱基突变位置有
5 处发生错义突变(表 2), 带负电荷的氨基酸残基总
数(Asp + Glu)为 63, 带正电荷的氨基酸残基数(Arg
+ Lys)为 50。运用 NCBI 的 Conserved Domains 工
具分析克隆基因保守结构域, 发现含有名为糖基转
移酶超家族基因(glycosyltransferase superfamily)的
保守区, 与 GenBank 中序列号 ABB84472.1 的结构
域比较表明, 克隆基因属于糖基转移酶基因家族中
的 GT-B超家族, 克隆序列提交 GenBank, 登录号为
HM188447。
将克隆 SGT3 的氨基酸序列提交到 Phyre 网站,
用 PSI-BLAST方法进行多序列比对建模, 通过分析
后选取植物中与新陈代谢相关的糖基转移酶
C2Vg8A 作为模板进行三级结构预测, 将获得的模
板和 SGT3的 PDB文件用 Rasmol查看, 发现两者单
体结构十分相似, 图 5 左侧为模板 C2Vg8A 三级结
构, 右侧为 SGT3 三级结构, 表明克隆马铃薯 SGT3
蛋白可能具有糖基转移酶的功能。
2.3 RNAi 目标区段基因的克隆及中间过渡载体
的构建
以克隆的糖基转移酶基因的质粒 pSGT为模板、
P2 为引物进行 PCR 扩增, 获得 1 条 324 bp 左右的
条带, 长度与目标片段长度一致(图 6第 3泳道), 回
收纯化后连接于 pGEM T Easy 载体后转化 DH5α,
PCR 及酶切检测为阳性的克隆菌用 Xho I 和 Bgl II
酶切(图 6 第 2 泳道), 纯化回收的目标片段与 Xho
I/Sal I、BamH I/Bgl II酶切的 PUCCRNAi质粒的目
标片段利用 T4 DNA 连接酶连接后, 转化菌用 Pst
I/Bgl II酶切, 获得 330 bp和 540 bp的 2条带 (图 7
第 2泳道), Pst I酶切获得 870 bp左右的条带(图 7
第 3 泳道), 两次酶切结果和预期片段大小一致, 表
明该菌液质粒为正向片段和反向片段连接到内含子
的两侧, 将上述阳性克隆送交测序公司测序, 其结
果与设计的目的序列完全一致, 即获得中间过渡载
体 pUCCSGTI1。
2.4 RNAi载体的构建
根据构建的 pUCCSGTI载体和 p2300-actin上限
制性酶切位点的特点, 利用 Pst I对 2个载体分别进
行酶切, 经连接后获得 p2300SGTI 表达载体, 由于
该载体中限制性酶切位点的复杂性, 用 Pst I对克隆
菌质粒进行单酶切检测, 琼脂糖凝胶电泳检测表明,
单酶切后得到预期大小的条带(图 8)。表明所得的克
隆菌为阳性克隆, 说明成功构建了含有 sgt3 基因部
分序列为靶标的 RNAi 载体 p2300SGTI, 其结构如
图 9 所示。块茎特异性启动子 CIPP 驱动的干扰表
达载体构建同上。
3 讨论
次生代谢产物是一类并非植物生长发育所必需
的小分子有机化合物, 而有毒次生代谢化合物的积
累是植物一个重要的防御反应。但是这些次生代谢
物大量积累往往导致人畜食用中毒, 从而限制了对
该植物的利用。RNAi技术可通过抑制关键酶基因的
1930 作 物 学 报 第 37卷


图 4 马铃薯 sgt3基因的 cDNA序列及其推测的氨基酸序列
Fig. 4 Nucleotide sequence and deduced amino acid sequence of sgt3 cDNA of potato
利用 PredictProtein在线工具, 分析氨基酸序列的结构及功能。单粗下画线是预测糖基化位点。同时具有字符底纹和字符边框的是预
测依赖 cAMP/cGMP蛋白激酶磷酸化位点。蛋白激酶 C磷酸化位预测采用字符边框标出。预测的酪蛋白激酶 II磷酸化位点用字符底
纹标出。豆蔻酰化位点预测用双下画线表示。UDPG糖基转移酶标签用中括号标出。
The structure and function of the deduced amino acid sequence of sgt3 is analyzed by the tool of PredictProtein. The prediced N-glycosylation
site is underlined. The cAMP- and cGMP-dependent protein kinase phosphorylation site is boxed and background-shaded. Protein kinase C
phosphorylation site is boxed and the casein kinase II phosphorylation site is indicated by letters with shaded background, N-myristoylation
site is double-underlined, and UDPG-glycosyltransferases signature is marked by brackets.

表 2 克隆序列与已发表序列比对结果
Table 2 Alignment results of sequence cloned compared with the published one in GenBank
编码区碱基位置
Site of base pair
碱基变异
Mutation of base pair
密码子变异
Mutation of codon
氨基酸变异
Mutation of amino acid
483 C-A UUC-UUA F-L
486 C-T AUC-AUU —
523 G-T GCU-UCU A-S
530 A-G AAG-AGG K-R
1130 A-G CAA-CGA Q-R
1189 G-A GUA-AUA V-I
1467 T-C CUU-CUC —
第 11期 王旺田等: 马铃薯块茎糖基转移酶基因的克隆及其 RNAi载体的构建 1931



图 5 预测 SGT3单体(左)与 C2Vg8A单体(右)三级结构比较
Fig. 5 Monomer 3D structure of SGT3 (left) and C2Vg8A (right)


图 6 RNAi目标区段的酶切及 PCR扩增检测
Fig. 6 Electrophosegram of digested and PCR RNAi target
fragments
1: DNA marker II; 2: Xho I/Bgl II酶切; 3: PCR产物。
1: DNA marker II; 2: Xho I /Bgl II digestion; 3: PCR products.

表达, 改变植物的代谢流, 从而使相关次生代谢产
物下降。最近, 在农业上 RNAi技术已发展成为控制
病虫害[14-15]、抗逆[16]、提高作物品质[17-18]、功能基
因组研究及代谢途径分析[19-21]的新方法。与传统转
基因手段相比, 这一技术更具选择性和安全性, 其抑
制效率比单独应用正义或反义 RNA强 10倍以上[22]。
有关利用 RNAi 技术降低作物有毒次生代谢化合物
的报道较多[23-24], 但还未见降低糖苷生物碱含量方
面的报道。sgt3是合成 SGAs的前体, 为获得低含量
SGAs 的马铃薯块茎, Kent 等[9]利用反义 RNA 技术
抑制了马铃薯块茎中 SGAs的表达。RNAi技术的效
果比单独的正义或反义技术高 10倍, 本研究构建的
含有 sgt3 基因序列的 RNAi 植物表达载体, 有望降

图 7 中间载体酶切检测
Fig. 7 Electrophoregram of the product of vector digestion
1: DNA marker II; 2: Pst I/Bgl II酶切; 3: Pst I酶切。
1: DNA marker II; 2: Pst I/Bgl II digestion; 3: Pst I digestion.

低马铃薯块茎中糖苷生物碱的含量。
在植物次生代谢物合成途径中关键酶的分离及
其基因的克隆是植物次生代谢酶促反应机制研究的
基础, 而特定植物次生代谢物合成与积累量取决于
其合成途径中的限速酶, 它们在植物次生代谢物生
物合成途径中往往位于代谢支路分叉口或途径的下
游[25]。而在 SGAs 合成途径中, 由胆固醇合成茄啶,
再合成糖苷生物碱过程中, 由葡萄糖基转移酶基因
(sgt1)、半乳糖基转移酶基因(sgt2)和鼠李糖基转移
酶基因(sgt3)调控, 而 sgt1合成 γ-茄碱后再转变为 β-
茄碱, sgt2合成 γ-查茄碱后转变为 β-查茄碱, β-茄碱
和 β-查茄碱在 sgt3的作用下转变为糖苷生物碱的主

1932 作 物 学 报 第 37卷


图 8 p2300SGTI1 酶切检测
Fig. 8 Electrophosegram of the product of p2300SGTI1
digestion
1: D2000 marker; 2~3: Pst I酶切。
1: D2000 marker; 2–3: Pst I digestion.
要产物 α-茄碱和 α-查茄碱。若限制 α-查茄碱的合成,
则补偿了 α-茄碱的含量, 因此总的 SGAs 含量下降
并不明显[26]。在糖苷生物碱合成的分支代谢途径中,
sgt3 共同控制着 α-查茄碱和 α-茄碱合成, 所以通过
基因工程手段阻断或降低该类前体的合成有望降低
马铃薯块茎中糖苷生物碱的含量。
对鼠李糖基转移酶的研究 , 不仅有助于了解
类固醇糖苷生物碱的合成机制 , 而且还很可能有
助于了解马铃薯块茎中糖苷生物碱的代谢途径。然
而 UDPG 糖基转移酶基因序列相互之间的同源性
很低, 即使是被认为结合 UDPG 的特征性序列的
44 个氨基酸区域也只有大约 43%~68%的相似性[27],
很难利用这类基因的同源或保守区域设计同源简
并引物克隆基因。因此本试验根据已发表的基因序
列, 采用 RT-PCR技术克隆到 sgt3 相似基因, 采用
生物信息学方法对克隆的序列分析发现 , 该基因

图 9 p2300SGTI表达框架示意图
Fig. 9 Structure map of p2300SGTI expressing framework

具备一个完整的开放阅读框架 , 大小为 1 500 bp,
编码 505个氨基酸, 是糖基转移酶家族蛋白成员之
一, 且属于 GT-B 超家族, 具有一个 UDPG 糖基转
移酶的保守功能区域, 存在着蛋白激酶Ｃ磷酸化、
酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化、糖基化、依赖 cAMP/cGMP
蛋白激酶磷酸化和豆蔻酰化等功能位点, 在 cGMP
介导的信号传导途径中蛋白激酶的 N 端豆蔻酰化
蛋白发挥重要作用, 而本研究分析存在依赖 cAMP/
cGMP 蛋白激酶磷酸化位点, 这与王旺田等[28]在细胞
信号分子和糖苷生物碱积累的关系的研究结果相
吻合。三级结构预测结果同糖基转移酶模型具有十
分相似的结构模型, 结合具有一个UDPG糖基转移
酶的特征性保守功能区域的基因一般都被认为是
糖基转移酶基因家族的成员的结论 [29], 表明该蛋
白可能具有糖基转移酶活性功能 , 可能参与合成
类固醇糖苷生物碱, 以上信息为 RNAi 目标片段的
选择提供预测参考 , 并有助于实验方案的修正和
完善。
在 RNAi 技术方面, 干扰片段长度的选择存在
很大范围, 120~1 000 bp的片段都可以有效抑制靶
标基因的表达 [30-31], 所选最适片段长度应该在
200~600 bp左右[32]。而在干扰片段区域的选择上要
求不干扰其他基因的表达 , 因此 , 本研究选择与
sgt3相似基因的目标片段, 通过 NCBI的 Blast技术,
在非保守区和保守区分别筛选到 324 bp和 408 bp的
靶标序列作为干扰区段。由于干扰中间载体内含子
序列两侧的酶切位点 Xho I和 Sal I、Bgl II和 BamH
I 为同尾酶, 所以在干扰片段的克隆过程中仅设计
Xho I和 Bgl II, 通过一次 PCR扩增, 一次酶切即可
同时获得两条正反向的干扰片段 , 从而减少了酶
切、连接、转化的工作量。同时在干扰表达载体构
建过程中, 采用 3个片段同时连接的方法 , 避免了
繁琐的操作 , 使工作量大大降低。目前已构建好
Actin 启动子及块茎特异性启动子 CIPP 驱动的含有
sgt3 相似基因部分序列的干扰表达载体, 准备转化
优良马铃薯材料, 验证 sgt3 相似基因功能, 以深入
探索马铃薯甾醇类糖苷生物碱合成机制。
4 结论
获得的马铃薯块茎 sgt3 相似基因与已发表的
sgt3 基因序列相似性达 99.54%, 其开放阅读框长
1 500 bp, 编码 505个氨基酸, 具有 UDPG糖基转移
第 11期 王旺田等: 马铃薯块茎糖基转移酶基因的克隆及其 RNAi载体的构建 1933


酶保守结构域、糖基化、依赖 cAMP/cGMP 蛋白激
酶磷酸化、蛋白激酶 C磷酸化、酪蛋白激酶Ⅱ磷酸
化、豆蔻酰化等重要功能位点, 三级结构同糖基转
移酶单体结构模型相似, 为糖基转移酶家族 GT-B
超家族成员, 基因序列已注册到 GenBank, 序列收
录号为 HM188447, 以此为靶序列, 选择与 sgt1、
sgt2基因相似度高的 324 bp和 408 bp区段, 各自构
建了 Actin启动子和 CIPP启动子驱动的干扰表达载
体。
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