全 文 ：第 , 9卷 第 2 期
1 9 98年 4 月
大 连 大 学 学 报
J O U RN A L O F D A L IAN UN! V任 R S IT Y
V O }门 9
A rP
.
N o
.
2
1 99 8
云南甘草总皂贰对氧自由基诱导羊心肌细胞膜
aN
+ , K + 一 A T P 酶活性降低的保护作用
刘 磊 高 卫
(医学院基础部 , 大连 n 662 2)
李钧波
(大连市卫校 , 大连 n 6622 )
摘 要 云南甘草总皂试对正常羊心肌细胞膜 N巨十 , K 十 一 A TP 酶活性无影响 ; 但对氧 自由基诱
导羊心肌细胞膜 Na 十 , K + 一 A T P酶活性的降低有明显保护作用 , 随浓度增高 , 酶的活性逐渐升
高 . 与对照组比较 , 总皂贰浓度为 .0 2mg · L 一 `时 , 酶的活性恢复 27 .9 % , 浓度为 .0 s ngr · L 一 ’ ,
酶的活性恢复 46 .6 % .
关键词 云南甘草总皂贰 ; 心肌细胞膜 , Na + , K 十 一 A T P酶 ; 超氧阴离子 自由基 ; 氧 自由基发
生系统 ; 经自由基
中图分类号 R 972 .9
云 南 甘 草 总 皂 贰 (s aP o n ins of G ly cy hr ha Y u n a
~
,
S G Y ) 系 从 云 南 甘 草
( lyG 叮hr ha yu ~ ~
15 e h碗 fct L K aT i) 中提取 的皂 贰类化合物川 . 近年研究表明 ,
甘草的有效成分甘草酸 、 甘草次酸及甘草黄酮类化合物对轻自由基 ( · O H ) 、 超氧 阴离 子
自由基 ( O力 和过氧化氢 (H八 ) 等均有 明显的清除作用 以及有 显著的抗脂质过氧化作
用氏 ’ 】. 本文报道 S G亨对氧 自由基发生 系统 (fh戈 aI d ica l gen ar t 10 n s y s teln
,
F R sG ) 诱导
离体羊 心肌细胞膜 N +a , K + 一 A T P 酶 活性降低 的保护 作用 , 旨在 为 该药 可 用于 心肌 缺
血 /再灌注损伤的防治及 阐明其抗心肌损伤机制提供依据 .
1 材料和方法
L l 药品和仪器
S G (Y 北京医科大学药学院植化教研室 ) , ED T A 一 N a Z(瑞士 F l往K a 公司 ) , 哇巴 因 (中
国药检所标准品 ) , H尹2 、 硫酸亚铁胺 (北京化工厂产品 ) , 其它试剂均为分析纯 . 高速冷
冻离心机 ( R C S C , 美国 D ul, o )rt , 低温冰箱 ( 一 80 ℃ , 美国 B a ck lna n) , 7 21 分光光度计
(上海第三分析仪器厂 ) .
1.2 羊心肌细胞膜的制备
参考文献 [’] 加 以改 良 , 取新鲜羊 心室 肌 50 9 , 加 10 倍体积 的缓 冲液 工 ( T ier 一 H O
20
~
1
·
L 一 1
,
p H .7 o
,
E D丁 A 一 N a 2 1
~
卜 L 一 ’ ) 制备 组 织匀 浆 , 双层纱布 过滤 , 离心
收稿 日期 ; 19 7 一 12 一 2
作者 : 刘磊 , 女 , 1958 年生 ; 大连大学医学院药理学副教授 .
第 2 期 刘 磊等 云南甘草总皂武对氧自由爹诱导羊心肌 细胞膜 陌 十 , K一 A TP 酶活性降低的保护作用 7 7
(8 (刃o x g, 20 m i n ) , 上 清液离心 (l 0 0 0 x g, 20 ~ )
, 上清液再离心 (科 (K幻 x q, l h) ,
沉 淀 用 缓冲液 1 (T irS 一 草 酸 钾 20
~
1
·
L
一 ` , p H 6名 , K C I .0 6伽 1 · L 一 1, DE T A 一 N a :
1
~
l
·
L 一 l) 混悬 , 离心 ( 4 0 o x g , l h) . 最后 沉淀物 (即羊心肌细胞膜 ) 用缓冲液
nI (T isr 一 H O 20
~
卜 L 一 ’ , p H .7 ;2 M g。 : or ~ ol
·
L 一 ’ ) 混悬 , 将心肌细胞膜蛋 白浓度
调至 2 9 · L 一 ` . 蛋 白含量采用考马斯亮蓝法测定 [ ’ l , 牛血清蛋 白作标准 . 整个制备过程在
O 一 4 ℃ 之间进行 , 标本置 一 80 ℃ 冰箱保存 .
1 3 aN
+ ,
K
十 一 A T P 酶活性测定 `礴 l
反 应终体积 1血 , 内含 T由 一 H o 50 ~
l
·
L 一 1
,
p H 7 .4 一 .7 6 , M gq 4~
卜 L 一 1 ,
Na O
10
~
1
·
L 一 ’ , K Q 10
~
1
·
L 一 ’ , 膜蛋白量 .0 2 mg , 含或不含哇巴因 ( 1~
1
·
L 一 ` ) ;
37 ℃ 预温 5而n , 加人 A l , p 一 N a : 4~
卜 L 一 , 以触发反应 . 37 ℃ 水浴孵育 10 n五n , 加人
78 2 尸m o l · L 一 , 三氯醋 酸 1耐 终止 反应 , 离心 (3 o o r · ~
一 1,
10 而n) 除去蛋 白 . 取
.0 5血 上清液测定 A T P 水解无机磷含量 , 含 哇巴 因和不含 哇 巴 因 的 A T P 酶 活性 之 差为
N a + 一 K + 激活的 、 M g+2 依赖的 、 哇巴因敏感的 A T p 酶 (Na + , K + 一 A T p酶 ) 酶活性 以每
小时每克膜蛋 白水解 A T p 所产生的无机磷量表示 , 即
~
I iP
·
g 一` rP
·
h
一 ’ .
2 结 果
.2 1 叙自由基发生系统对羊心肌细胞膜 Na + 一 K 十 一 A T P 酶活性的影响
根据 F en ot n 反应原 理 [` ], 将硫 酸 亚铁
胺 和 H夕 2 两 者 相 加 , 各 浓 度 均 为
.3 2 n n n o l
·
L
一 `与心肌细胞膜 37 ℃ 孵育 s n五n .
结果表明 , F R G S 产 生的 · O H 对 Na + , K +
一 A T P 酶活性有 明显的抑 制作用 (表 1) .
.2 2 S G Y 对羊心肌细胞膜 Na + , K + 一 A T P
酶活性的影响
将不 同浓度 s G Y (0 . 05 一 .0 s mg
·
L 一 ’ ) 与
心肌细胞膜 3 7 oC 孵育 s n 五n , 测 N a + , K +
一 A l卫 酶的活性 . 结果表 明 , S G Y 对羊 心
肌细胞膜 N +a 一 K 十 一 A T P 酶活性均无显著
影响 .
表 1 F R G S 对羊心肌细胞膜 Na 十 , K 十 一 A T P酶
活性的影响 (。 = 4 , 又士 )S
组别加叨。 1 · L
N a
于 ,
K
十一 A T P 酶
六山加〕 p i · s 一 , p r
抑制率
/%
气曰,山0
.162.7
对 照
F e Z
+
3 2
H户: 3之
F R G S
(F e ,
卡 + H ZO g
l住 10土 2 .06
.8 43 士 1
.
0 3
.
7
.
% 土 1
.
5 8
.
2
,
8 5士 住8*7 *
与对照组 比较 , *P < 仓05 , * . < 尸 < 。01 ; F R G A ( n忱
aI id司g即` n io n s娜肋 ) ; 人 : 10而 n
.2 3 S G Y 对 F R G S 诱导羊心肌细胞膜 Na 十 , K + 一 A T p 酶活性降低的影响
将不同浓度 的 S G Y 与 F R GS 和心肌细胞膜 37 ℃ 孵育 5 ~
, 同时设空 白组 、 F R sG
组 、 甘露醇对照组 , 测 N a + , K 十 一 A T P 酶活性 , 结果表 明 , SG Y 对 F R G S 诱导的羊心肌细
胞膜 N a + , K + 一 A T P 酶活性降低有明显的保护作用 , 并呈浓度依赖性 , 其作 用强 于甘露醇
见 (表 2) .
大 连 大 学 学 报 第 1 9卷
表S G Y 2和甘姆醉对皿S G 诱导羊心肌细胞膜 a N +, K + 一 A T P 酶活性降低的影响 。 二 4 , 又士 s)
恢复率
组 别
药物
八飞 , L 一 ,
N +a
,
K
+ 一 ATP 酶
八1〕n 〕0 1 p i , g 一 , p砂
心肌细胞膜
心肌细胞膜 + F R sG
1O
J亡J
6
,尹100 5273546138
{
心肌细胞膜
} + S G Y+ F R G S
{
心肌细胞膜
+ F R G S }
+ 甘露醇
0
.
0 5
0
.
2
0
.
4
0
.
8
2
.
4 x l护
9石 x l护
19 x l护
3 8 x l护
9月8土 1 . 2 6
2
.
68 士 0石3十 十
2
.
73 土 住7 8
4
.
7 1土 0名 l * *
5
t
27 士住 7护*
6
一
08 士 0月 1* *
3
`
76 土 住8*2
64 3士 1 . 1沪*
7
.
17士 0 , 9 5* *
7 72 士欣8 9* 中
与心肌细胞膜组 比较 , + +尸 < 住01 ; 与心肌细胞膜 + FR sG 组比较 , * p < 住05 , * p < 住01 ; 八: 10 o n
3 讨 论
现已证明 · O H 是导致缺血 /再灌注等心肌损伤的关键因素 !了 l , 因为 · O H 是一 个极其
活泼的氧化剂 , 能与众多的细胞有机成分和生物膜起反应 , 使膜脂质 过 氧化 . 导致 通透
性增加 . 使膜 内酶蛋白发生交联反应 , 酶的活性降低二 O H 能使 N +a , K + 一 A T P 酶 的活性降低 , 细胞 内【N a + ]` 增高 , Na 十 一 aC +2 交换增加 , 细胞 内叮a Z + l 超负荷 , 继发引起心肌
组织的一系列损伤 . S G Y 对 F e n t o n 反应生成的 · O H 有较强的清 除作 用和抗脂质过氧化
作用 [ ’ ] , 本实验证明 SG Y 对 F R sG 诱导羊心肌细胞膜 N a + , K + 一 A T p 酶活性降低有 明显的
保护作用 , 从而提示 S G Y 可用于防治心肌缺血 /再灌注损伤 .
参考文献
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Na
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14 :7 332 e s l
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誉 2 期 刘 磊等 : 云南甘草总皂武对氧自由墓诱导羊心肌细胞膜 吻 ` , K ` 一 A丁尸晦活性降低的保护作用 7 9
7 I la 粥 M L , M毗 on NH . M o k 。止址 。 x鸡即 : F 6 既dl or F co 二 . n 此 m k of 此 。 大地即 丘茂 觅 d cj al s声 te n l in
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a 目d uln paJ 丑 d o x
, 血 以犯即 p a ar dox an d 抬迁目曲 a er/ P e ft 山沁n inj u r y . J M of C笼l Q 汀id o l , 1984 , 16( l :)
% 9一 85 .
E fl 泌e t s o f S a p o n i n s o f G l y yC r r址 z a Y u n n a n叨 51 5 o n t h e D cer ae s e o f
N a
十 , K + 一 A T P a se A ict 竹 yt In d u e de b y o x y g en F r e e R a d ica l s
L泣封 乙e应
归 e P t o f P h a mr a e o l o g y , M e d ica l C o l e g e o f D a l i a n U n ive r s it y , D a l i a n 1 1 6 6 2 2 )
汕 s tr a e t T h e s t u d y s h o we d t h a t s a P o n in s o f gxl y 一 e yr r h i z a y u n n a n e sn is (S G Y ) h a d n o s i g n i if ca n t
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s zg n币 e a n t p r o te e ti ve e fe e t o n t h e er d u ct i o n o f N a + , K 十 一 A T p a s e a e t zv lt y I n d u e e d b y o x y g e n fre e
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.
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十 一 A T P a s e a e t l v l t y w a s e ic v a t e d , C o m -
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汕 s tr a e t T h e 仰 P a n o s o me ’ 5 gen o me e o n t a ms a ht o u s a n d d j月飞er n t VS G ge n e s . hT u s , i t is 皿 P o s s ible
t o m an u fa c t ur e a e o n v e n t i o n a l v a c 眠 t o g u ar d a ga ms t tr y P a n o s o me iofe ct io n , T he h o p e 15 t h at a
b e t e r u n d眺 t a dn i n g o f t h e b a s i c m o le e ul a r b io l o g y o f t汀a n P o n o s o me in fe c t i o n w 沮 s u g e s t ne w
a P P r o a e h es fo r e r a d i ca t i n g t he d is e韶e .
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