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云南甘草总皂甙清除氧自由基和抗脂质过氧化作用



全 文 :·
3 50
· 中国药理学通报 c 无 i,t、 几 a , m a c “ o夕ic a z B o&l 扭 1 9 9 3 o e t ; 9 ( 5 )
云南甘草总皂戒清除氧自由基和抗脂质过氧化作用
邓柯玉 ’ 辛洪波 张宝恒 曾 路 2
( 北京医并大 学基拙医学院药理教研室 . 北 京 10 08 3)
提要 云南甘草总皂贰 (S G Y )对 eF n ton 反应生成的
·
O H 具有较强的直接清除作用 、其 I sC 。为 29 m g · L一 ’ .
且作用明显强于 . O H 特异性清除剂甘露醇 (其 I C的为
2
·
2 7 X 1 0
一 Z m o l · L 一 ’ ·即 4 3 1 5 m g · L一 ` ) 。 S G Y 对黄嗦岭
一黄嗦吟氧化酶系统产生的 。矛也有较强的清除作
用 . 其 I C : 。为 89 m g · L一 ` 。 S G Y 对 自由荃发生 系统
( FR G S )诱导离体大鼠心肌匀浆组织产生的脂质过
氧化 ( L P o )作用有明显的抑制效应 . 对 F R G S 诱导离
体大鼠心肌线粒体膜 L P O 也有一定的抑制作用 。 结
果提示 S G Y 的抗脂质过氧化作用与其清除氧 自由
基作用有关 。
关链词 云南甘草总皂贰 甘露醉 经自由基 超
氧阴离子 自由基 自由基发生系统 脂质过氧化
线粒体 大鼠心脏
云南甘草总皂贰 ( S a p o n in , o f G ly e y r r h s z a
y u n n a n e n s i s
,
S G Y ) 系从云南甘草 ( G l y e y r r h iz a
Y u n n a n e n s奋5 C h e n ` f · e t L · K . aT s )的根茎中提
取的皂贰类化合物 , 为浅黄色粉末结晶 〔” 。近
年来的大量研究表明 , 甘草的有效成分甘草
酸 、 甘草次酸及甘草黄酮类化合物对羚 自由
基 ( h y d r o x y l f r e e r a d j e a ls , ·洲 ) 、 超氧 阴离子
自由基 ( s u详 r o x i d e a n i o n , o 了 ) 和 过 氧 化 氢
( h y d r咚e n p e r o x jd e s , H : o : )等均有明显的清除
作用 以及显著的抗脂质过 氧化 il( p jd p e r o 、 j-
da it on
,
L PO )作用〔 2一 5〕 。 但其皂试类化合物清
除氧自由基和抗脂质过氧化作用 尚未见报
道 。 本文报道 s G Y 对 · o H 和 。 歹的清除作用
和 对氧自由基发生 系统 ( f r e e r a d i o a x g e n e r a -
t i o n s y s `e m , F R G s )诱导离体大鼠心脏匀浆组
J 99 2一 0 8一 2 5收摘 . 1 9分3一 0 6一 0 4修回
,北京医科大学 “ 天然药物与厉生药物国家重点实验室 ” .
10 0 0 8 3
日匕京医科大学药学院植物化学教研室 . 1 0 0 0 8 3
织及心肌线粒体膜产生 LP O 的影响 , 旨在探
讨其抗 LoP 与清除氧自由基作用之间的关
系 。
1 材料和方法
1
.
1 药品和仪器 s G Y 由北京医科大学药
学院植化教研室提供 : 黄嗦吟氧化酶 ( X o )为
上 海生物 化学 研 究所产 品 ; 黄 嗦 p令为美 国
is g m a 公司产品 ; 甘露醇 为上海化学试剂 总
厂 产品 ;苯甲酸 、过氧化氢 ( H 2 0 : ) 、 硫酸亚铁
胺 (民5 0 ; ( N H ; )多o ; · 6 H : o 〕为北京化工厂产
品 ; 四 乙氧基丙烷 ( T E )P 为瑞士 lF uk a 公司产
品 ; 硫代巴 比妥酸 ( T B A ) 为 S er va 公 司产品 ;
亚硝酸钠为北京红星化工 厂产品 ;抗坏血酸
为中国医药公司北京采购供应站提供 ;其它
试剂均为进 口 或国产分 析纯级产品 。 双波长
双光 束紫外分 光光度 计 ( U v 一 30 0 , 日本 岛
津 ) ;荧光分光光度计 ( F 一 3 0 0 0 , 日本岛津 ) ;高
速冷冻离心机 ( R c 5 C , 美国 D u p o n t ) 。
1
.
2 经自由基 ( · O H ) 的生成及测定阅 根
据 凡 n t o n 反应原理 ` 7 , , H , o ,在 eF Z+ 存在的情
况下可生成 · o H : eF 抖十 H Z仇一 eF 3十 + · o H +
O H 一 。生成的 · O H 用过量的苯甲酸捕捉 ,可形
成 具有荧光 的轻 苯 甲酸 。 后 者的激发波 长
( E x )为 3 0 0 n m , 发射波长 ( Em ) 为 4 0 8 n m 。 其
荧光强度 (F )可代表 · O H 生成 的相对量 。 反
应 终体积为 3 . s fln , 内含 : 苯 甲酸 3 m m ol ·
L一 ’ , K : H P O 4 / K H
? P 0 4 15 0 m m o l

L一 ’ , p H 7
.
4
,
F e Z +

E D T A 0
.
18 9 m m o l
·
L 一 ’ , H : O : 0
,
2 8 9
m m ol
·
L 一 `及各种浓度的被试药物 。 F扩长 E D -
T A 临用前配制 〔内含 F e s o . ( N H ; ) : 5 0 ; · 6 H : o
0
.
18 9 m m o l
·
L 一 1 , E D T A 一 N a : 0
.
5 8 6 m m o l
·
L
一 ’ 〕。 以加入 H 。 : 触发反应 , 在室温下反应 5
h 后测定荧光值 (F ) 。其清除率 (S 写 ) ~ ( F空一
中国药理学通报 C h: : 。二 p ha r m a co lo 夕ic a l B o la t执 19 9 3o e t; 9 ( 5 ) 5 31
1 m m o l
·
L一 1 , F eS O
冶 · 7H , 0 1 m m o l
.
L 一 I , T r i s -
H C 1 2 0 m m o l
·
L 一 1 , P H 7 . 0 , K C I 17 5 m m of ·
L 一 ` , 线粒体 0 . 5 m g 及各种浓度的药物或等
体积双 氧水 。 加 入 F R G S 后 , 反应管立即置
3 7℃恒温振荡水浴 ,且分别于第 0 、 1 0 、 2 0 、 3 0 、
6 0 m in 取出 0 . l m 一样品测定 M D A 含量 。 实
验还设立一组不含抗坏血酸和 eF S O ; 的对照
管 , 另设一 组仅含等浓度抗坏血酸和 eF S 。 :
管 ,以观察 F R sG 对 M D A 测定的影响 。
2 结果
2
.
1 s G Y 对 · oI { 的清除作用 结果表明 ,
本实验条件下 · O H 的生成在加入 H Z。 :后 s h
已 达稳态 , 故 以 反应 s h 后 的 F 值变 化作 为
7Rù21二s
u。忍忿二国
O
A
1 7
.
9 3 5
.
7 7 1
.
4 1 4 2
.
9
s G Y / m店· L一 ’
O八甘U
O
的卜ù,Jgùs
u”足“óo。日
F动一 F空 X 10 写 。实验以 · O H 特异性清除率
甘露醇作对照 。
1
.
3 0 了生成及其测定 .t, . , 黄嗦吟在 x o
的作用 下可产生 0 了 , 后者可与经胺反应 形
成亚硝酸盐 ( 2 0 了+ H + + N H必H 一~ H刃 : +
H必 + N o 于 ) ,亚硝酸盐可与对氨基苯磺酸和
a 一奈胺发生成色反应 ,从而在 53 0 n m 处可检
测 出 N O子的生成量 ,进而转换成 0 歹的生成
量 。 反应终体积为 2 m l 内含黄嚓吟 37 5 协m ol ·
L 一 ` , 轻胺 5 0 0 以m o l · L 一 ` , N a : H p o ; · 12 H : o /
N a H ,
oP
4 . 2 H Zo 10 0 m m o l
·
L一 ` , pH 7 . 8及 各种
浓度 的药物 。 同时设立一不含药物组和试剂
空白管 。 先 将 反 应管 置 37 C 水 浴 中预 温 5
m i n
。 以加入 X o ( 0 . 0 12 IU )触发反应 , 然后在
3 7℃水 浴中孵育 30 m in 整 , 冰 浴终止 反应 。
然后 取上 清液 0 . s ml 加 入 对 氨基 苯磺酸
( 17
.
2 6 m m o l
·
L 一 ’ )
、 a 一奈胺 ( 7 m m o l · L 一 ’ )和
上述磷酸盐缓冲液 ( p B , 10 0 m m o l · L 一 ` )各 0 . 5
m1
,混匀 ,在室温下静止 20 m in , 然后 , 以试剂
空白管调零 ,在波长 5 30 n m 处 比色 , o 了的生
成量由亚硝酸钠标准 曲线计算 。
L 4 F R G s 诱导 L P o 生成 的反应体系及 其
测定 〔 , “ , 反应终体积为 2 m l, 内含抗坏血酸 1
m m 0 1
·
L一 ’ , F e s o ; · 7 H Z o 0 . 1 m m o l · L 一 ’ , 1 0%
匀浆组织 l iln , 各种浓度的药物或等体积 的
双氧水 , 37 ℃恒温振荡孵育 ,且分别于加入抗
坏血酸和 F e s o ;后第 o 护10 、 2 0 、 3 0和 6 0 m sn 从
反应管中抽取 0 . l ml 伴品检测脂质过氧化
产物 丙二醛 ( m a l o n d i a ld e h y d e , M D A ) 的生 成
量 。 M D A 采用 T B A 荧光法测定〔 , ” 。对照组不
含抗坏血酸和 eF s o 4。 此外 , 另设一组试验管
仅加抗坏血酸和 F e s o ; , 以观察 F R G S 本身对
M D A 测定的影响 。
1
.
5 FR G s 诱导心肌线粒体膜 P L O 生成的
反应体系及其测 定〔 1。〕 大 鼠心肌线粒体的
制备参照文献〔 ’ 2 ,进行 ,将制备的线粒体蛋 白
浓度调至 5 9一 ’ , 置 4 一C 冰箱保存备用 。蛋白含量采用考马斯亮蓝法测定 〔 ’ “ 〕 , 牛血清白蛋
白作标准 。反应终体积为 l ml , 内含抗坏血酸
。一- 护丁翁六态 2 . 5 0 5、 0 0 1 0 0
B M a n川以 /m功旧】· L一 1
图一 s G Y (入 )和甘劣醉 ( B )对经自由基 ( · o H )
的清除作用
, 二 4 . : 士 : . 与对照组比较二 p < 0 . 05 … p < 0 . 01 . … p <
0
.
0 0 1
观察药物对 · o H 的清除效应 。 S G Y 和甘露醉
对 eF nt o n 反应生成的 · o H 均有明显的清除
·
35 2
· 中国药理学通报 e卉i7l e, hP a , 二 a c o lo 沙 a l B。枷认 1 9 9 3 o e t ; 9 ( 5 )
.2 4 s C Y 对 FR G s 诱导离体大鼠心脏匀浆
组织 L P O 生成的影响 结果表明 , s G Y 对
F R G s 诱导离体大鼠心脏匀浆组织 L PO 生成
具有显著的抑制作用 ,并呈明显的浓度依赖
性 (表一) 。
叫卜 . + F R G S
·奋 - 一 F R G S
n甘ù“ónn甘nùnU月,自七ù性,`1二
11(幸冬O0)
。万uz口丈O昙
作用 (图 l ) 。 S G Y 浓度 为 1 7 . 9 、 3 5 . 7 、 7一 4和
14 2
.
9 m g
·
L一 ’ 时 , 其清除率分别 为 3 1 . 7 4% 、
57
.
56 %

82
.
6 0%和 97 . 61 % ; 当甘露醇浓度
为 6 . 2 5 X 1 0一 ` 、 1 . 2 5 X 1 0一 3 、 2 . 5 X 10 一 3 、 S X
10 一 , 和 1 0一 ’ m ol · L 一 ’ 时 , 其清 除率 分别 为
7
.
1 8%

8
.
2 8吓 、 14 . 5 6% 、 2 0 . 7 4环 和
3 9
,
5 7纬。两药的 IC 动分别为 2 9 m g · L一 ` ( r =
0
.
9 8 5 7
,
9 5环的可信限为 17 ~ 4 7 m g · L一 ` )和
2
.
2 7 X 10 一 2 m o l · L 一 ` ( 4 3 15 m g · L一 ` , r =
0
.
9 74 4
,
9 5写的可信限为 0 . 8 2~ 6 . 3 x 1 0一 ,
m o z
·
L一 ’ ) , S G Y 清除 · O H 的 I c s。 ( m g · L 一 ` ) 约
为甘露醇的 1 / ] 54 。
2
.
2 s G Y 对 。 子的清除作用 结果表明 , 黄
嗦 p令在 x o 的作用下可生成大量的 0 孑〔3 5 . 7
林m o l · L一 ’ · ( 5 0 m sn ) 一 ’ 〕。 s G Y 对该体系生成的
o 百有显著的抑制作用 (图 2 ) , 其 IC S。为 89 m g’
L一 ` ( r = 0
.
9 9 3 5
,
9 5写的可信限为 3 4~ 2 3 3 m s
·
L 一 I ) 。
0 1 0 2 0
二全竺艺草竺
3 0 4 0 5 0 6 0
T i r o e /m i n
15
1 0
, 卜 . M打 o
十于获 G S
代卜 M I T O
三习。ó户10。
司卜 F R G S曰óQ
万日ft、哎O芝八U勺J
ùǎ三O的)。
了 2。
闷 。 扩节广俞甲氛芍厂窃飞 6
B iT m e /m i nn甘
。乞`二\场O
”一一宁— 寸一-
S G Y /m g尹之一 l 1 0 0 0
图 3 , 晓G s 诱导离体大民心肌匀浆组织 ( A )
和心肌线较体成 ( )B M O A 生成的时效关系
每个点为 3一 4次测定值的均数
图 2 sG Y对超级阴离子自由基 (颐 )的清除作用
, 一 3 . : 士 , .与对照组比较 · ’ 尸< 0 . 05 . ’ ` P < 0 . 01 “ . ` 尸<
0
.
0 0 1
2
.
3 皿sG 诱导大鼠心脏匀浆组织 L P O 生
成的时效关系 结果表明 , 仅含 F R G S 组的
荧光值很低并在孵育前后无明显变化 ,表明
此浓度下的 F R G s 不干扰 M D A 测定 。 F R G S
诱导 L oP 生成的作用呈明显的时间依赖性 ,
孵育至第 10 m in 就可观察到 M D A 的明显升
高 , 至第 3 0 rn in , M D A 增高达对照组的 2 0倍 ,
至反应第 6 0 m in 仍有增高的趋势 (图 3 A ) 。
衰 1 s G Y 对 FR G s 诱导离体大砚心肌匀桨组织
M D人 生成的形响 (云士 : )
S G Y
/ m g
·
L 一 】
M D A
/ n m o l
·
( 名w w ) 一 l · ( 3 0m i n ) 一 l
抑制率 / %
0 19 5 0士 9 5 一
5 0 1 7 2 0士 8 4 . 苍 1 1 . 7 9
2 0 0 1 3 1 0士 5 6 . “ 3 2 . 8 2
8 00 7 5士 1 2二 愁 9 6 . 1 5
, 一 6 ;与对照组比较二 ` p < 0 . 0 1 . “ · p < 0 . 0 0 1
2
.
5 F R G s 诱导大鼠心肌线粒体膜 L P O 生
成的时效关系 结果表明 , 不含 F R G s 的对
照组及仅含 F R G S 的试剂空 白组 , 其荧光值
中国药理学通报 C h认 e se P h叮 , a e如妙 a l 刀 , let 玩 2 9 9 3 o e t ; 9 ( 5 ) · 3 5 3 ·
-
都较低 ,且在孵育前后无明显变化 。在 分R G s
+ 线粒体组 , F R sG 可 明显诱导心肌线粒体
膜 M D A 的生成 , 且于反应第 10 m in 就可见
M D A 含量的显著增多 ,约为对照组的 4倍 。 此
后 , M D A 生成趋 于稳至反应第 60 m in 未见
M D A 继续升高 (图 3 B ) 。
.2 6 s G Y 对 FR G s 诱导大鼠心肌线粒体膜
L P O 生成的影响 结果表明 , s G丫 对 F R G s
诱导大鼠心肌线粒体膜 L P O 的生成有一定
的抑制作用 ,并呈浓度依赖性 (表 2 ) 。
衰 2 孤Y 对 F R sG 诱导离体大砚心肌线粒体
膜 M D A 生成的影响 (z 士 。 )
组 别 药 物
/ m g
.
L一 J
M O A
/ m m倪 . kg 占 1
讲ot e五n . ( 30 m i n )一 1
2
.
16士 0 . 16
1 1
.
2 5士 0 . 2 5+ + +
8
.
5 , 士 1 . 17 , .
.8 别七 1 . 0 2…
5
.
9 5士 0 . 3 8…
抑制率
/ %
2 3
.
5 4
2 6
.
9 6
4 7
.
1 4
一系列损伤过程如 LoP 等 。 现 已证明 , 氧自
由基尤其是 · O H 是导致 心 、 脑组织等缺血 /
再灌注损伤的关键因素〔`习 。 氧自由基导致组
织损伤的重要方式之一就是与组织细胞的膜
成分发生脂质过氧化 ,进而诱发一系列损伤
过程 。 S G Y 为云南甘草中的主要 成分 , 本文
结果显示 , s G Y 对 eF nt on 反应产生的 · O H 及
黄嗦岭一黄嚓岭氧化酶系统产生的 。 孑均有显
著的清除作用以及对 F R G s 诱导心肌匀浆组
织和心肌线粒体膜 L P o 生成也有较强 的抑
制作用 ,这就表明 s G Y 的抑制脂质过氧化作
用与其清 除氧自由基作用密切相关 ,从而提
示 S G Y 可能对心肌缺血 、 心肌缺血 /再灌注
损伤具有保护作用 。
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Ph or y l a t i o n i n h e a r t m i t oc h o n d r i a i n t h e a b s
e n t o f e x t e r n a 】
ǎUùUOn
é
已J八U
O
,ó8
线位体 (随 t)
( M i t十 F R G S ) + S G Y
: 二 5 . 与 M i t 组 比较 . + + + 尸 < 0 . 0 0 1 .与 M i t+ F RG s 组
比较二 ` P < 0 . 0 1 , ` 一 P < 0 . 0 0 1
3 讨论
电子自旋共振法 (E S R )是检测氧自由基
的最直接方法 , 化学发光法用于检测氧 自由
基也具有灵敏度高的特点 , 但两者均需特殊
的仪器设备 ,故在应用中受到一定的限制 。本
文采用亚硝酸盐形成法成功地检测了黄嗦吟
一黄嚓吟氧化酶系统产生的 o 了 , 本法有灵敏
度高 (为细胞色 素 C 法的 8 . 5倍 , 与化学发光
法相近 〔吕, “ , ) 、 显色稳定 、 可定量及简便易行等
优点 。
一般认为抗坏血酸和 eF Z十产生 · O H 是
基于 凡 n t on 反应原理进行的〔“ 〕 : 抗坏血酸 +
ZH十 + 2 0 了~ ZH刃: 十脱氢抗坏血酸 ; eF ”十十
H , o :一 F e 3+ + o H 一 + · o H 。从上述反应方程式
可见 ,少量抗坏血酸可清除 o 了 , 对机体起到
一定的保护作用 ; H , o :和 。互均为正常组织中
氧代谢的异常产物 , 当大量抗坏血酸存在时 ,
组织中 H Z o Z的形成也增多 ,后者可与 eF ?十作
用生成毒性作用更大的 · O H , · O H 则可引发
·
3 5 4
· 中国药理学通报 c h 、` * 外a ; m a c o l o 夕。 IB : lof I: , 1 9 9 3 o e t ; 9 ( 5 )
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1 4 M i n o t ti G

A u s t 5 0
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T h e er q u i r e m
e n t f o r i r o n ( I ) i n t h e
i n i t i a t i o n of l i P i d pe
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今老药新用令
老药新用治疗 痛经
i 维生素 B 。 vi t B。有促进镁离子进入子宫肌细胞 而产
生解痉的作用 .故有主张 补充镁离子及 v “ B`治疗原发性
痛经 。
2 心痛定 机理是本品可松驰子宫平滑肌 . 有效地抑制
月经头 2天的子宫收缩 。方法 : 于每次月经前 3 ~ s d 开始服
药 · 10 m二 idt · 7 ~ 10 d 为1疗程 . 连用 3个疗程 . 月经来潮时
亦可服药 . 10 ~ 3 0 m : n 后疼痛减轻 。
3 炎痛喜康 有少、 使用本品治疗原发性痛经取得较好疗
’ 效 。用法 : d u 、 d Z单剂量 4 0 m s . d 3 、 d 4 、 。 5改为: 0 m g 。
4 消炎痛 本品通过抑制 GP 的合成 . 可减弱子宫收缩 。
方法 : 均在庸经发 生之 前的 l ~ Z d 口眼本品巧 m g . t id . 用
药时间不超过 3 d 口
` 可乐定 用50 阳一 ’ . 在月经前到 行经期连服 1 4 d 为 1
疗程 . 巧例 两重痛经者试用表 明 , 1 例 ( 7 3 . 3 叱 ) 有效 。
6 碳酸锉 铿 能改变神经兴奋性及神经突触传递功能 .
增加脑内去甲肾上腺素脱 氨代谢的量 . 抑制腺昔 酸环 化
酶活性 . 减少 c A M P 的产生 . 对痛经有较好疗效 。方 法 : 预
计经前 10 d 开始口服 0 . 9 宁 d 一 ’ . 分3次 . 到月经来潮时停
药 。
7 阿斯匹林 蒲经是由于体内 P G 的 浓度异常升高 . 引
起子宫平滑叽痉挛所致 。而阿斯匹林具有抑制 P G 合成的
作用 .故可用于治疗痛经 。
8 磨香追风膏 将本膏一片均分为 4份 . 干痛经开始时或
月经前 Z d 贴敷于关元 、 血海和三阴交 3穴 . 犯 h 更换 1次 .
至疼痛消失或月经后 3 d . 有效率叭 . 5叱。
( 肖软林 济南市历城区铁 14 局中心 医院 . 25 0 10 1)