全 文 ：生物多样性 2008, 16 (3): 263–270 doi: 10.3724/SP.J.1003.2008.07362
Biodiversity Science http: //www.biodiversity-science.net
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收稿日期: 2007-12-03; 接受日期: 2008-02-15
* 通讯作者 Author for correspondence. E-mail: lijq@rose.whiob.ac.cn
** 同等贡献作者 The two authors contributed equally to this work
用EST-SSR标记分析中国北部和中部地区
天蓝苜蓿的遗传多样性和遗传结构
闫 娟1, 2** 楚海家1, 2** 王恒昌1 李建强1*
1 (中国科学院武汉植物园, 武汉 430074)
2 (中国科学院研究生院, 北京 100049)
摘要: 天蓝苜蓿(Medicago lupulina)隶属于苜蓿属, 是一年生或越年生、广布的草本植物。通常认为它是自交种, 但
也有些研究报道它具有异交或者混合交配的繁育系统。为了了解它的居群遗传变异、基因流、繁育方式及其遗传
背景, 我们用9个EST-SSR标记分析了中国新疆、内蒙古、甘肃、北京、山西、陕西、湖北7个省区的17个天蓝苜
蓿野生居群。结果表明: (1) EST-SSR的多态位点百分率(PPL)为71.9%; 每个SSR位点的等位基因数(A)为4–11(平均
为7.333); 遗传多样性(HE)最高的居群是新疆那拉提(0.388), 最低的为陕西西安(0.042)。自交率达93.8%。(2)居群
间的遗传分化水平高(FST = 0.528; RST = 0.499), AMOVA分析结果显示遗传变异主要存在于居群间, 占总变异的
59.02%。(3) Mantel检验发现遗传距离和地理距离有显著的相关性(r = 0.4141, P ≤ 0.0003)。根据Nei’s遗传距离(Da)
得出的Neighbor-joining树显示, 地理距离近的居群聚在一起, 这进一步验证了Mantel检验的结果。由此推测, 天蓝
苜蓿中等水平的遗传多样性和高度的居群间遗传分化主要受它的自交特性和分布方式影响。上述结果有助于初步
了解天蓝苜蓿的种群动态和遗传结构, 同时对苜蓿属种质资源的保护和遗传育种有重要意义。
关键词: Medicago lupulina, EST-SSR, 遗传多样性, 遗传结构, 自交
Genetic structure and diversity of Medicago lupulina populations in
northern and central China based on EST-SSRs markers
Juan Yan1,2**, Haijia Chu1,2**, Hengchang Wang1, Jianqiang Li1*
1 Wuhan Botanical Garden, Chinese Academy of Sciences,Wuhan 430074
2 Graduate University of the Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049
Abstract: Medicago lupulina is an annual or short-perennial and widespread herbaceous plant. It is generally
considered a selfing species with a strong self-compatibility system, but a shift in mating system towards
outcrossing or mix-mating has been reported. To estimate genetic variation, gene flow, mating system and
genetic background of M. lupulina, we characterized 354 individuals from 17 wild populations from northern
and central China using nine EST-SSRs markers. We found that: (1) EST-SSRs markers had a high percent-
age of polymorphic loci (PPL = 71.9%) and 4–11 alleles per loci. The Xinjiang-Nalati population had the
highest level of genetic diversity (HE = 0.388), whereas the Shaanxi-Xi’an population had the lowest (HE =
0.042). Selfing rate was 93.8 %. (2) Genetic differentiation was high among populations (FST = 0.528; RST =
0.499). Of the total genetic variation, 59.02% was found among populations. (3) Mantel test revealed that
genetic distance and geographic distance were positively correlated (r = 0.4141, P ≤ 0.0003). Neighbor-
joining trees based on Nei’s genetic distance (Da) showed that neighboring populations clustered into the
same clade, which was consistent with results of Mantel test. Our results indicated that the genetic structure
of M. lupulina populations have been strongly affected by dispersal patterns and a strategy of inbreeding.
Key words: Medicago lupulina, EST-SSR, genetic diversity, genetic structure, selfing
264 生 物 多 样 性 Biodiversity Science 第 16 卷
天蓝苜蓿(Medicago lupulina)是一年生、两年生
或越年生的草本植物, 主要分布于欧亚大陆, 世界
各地都有其归化种，在中国南北各地及青藏高原均
有分布(Wei & Huang, 1998)。它的野生种具有很强
的适应性和生存能力, 一般常见于牧场、草地、河
岸、路边及田野。据报道, 天蓝苜蓿的染色体数目
一般是2n = 16, 而在欧洲, 2n = 16和2n = 32均有报
道 (Clapham et al., 1962; Turkington & Cavers,
1979)。
从20世纪中后期开始, 国内外学者从细胞染色
体、形态特征、生物物候、繁育及生理生化方面对
天蓝苜蓿进行了研究。Lammerink(1968)对新西兰南
海岛6个地区天蓝苜蓿的物候进行了调查, 发现它
的花期从早春到秋季, 繁育系统根据传粉昆虫的多
少, 有完全自交和部分异交两种类型。Sidhu(1971)
研究了加拿大天蓝苜蓿的形态和物候特征, 发现不
同的生境和气候条件会造成其基因型的差异。
Pavone和Reader(1985)阐述了微地貌对天蓝苜蓿
的生存和繁殖的影响。近来一些学者研究了天蓝
苜蓿的固氮作用(根瘤菌)和生理休眠机理(Wilson,
2005)①。有些草地和农业专家尝试将天蓝苜蓿作
为草坪植物和绿肥、饲料等(朱邦长等, 1996; 曹致
中等, 2003)。到目前为止, 还没有在分子水平上对
天蓝苜蓿的遗传多样性水平和遗传结构进行过研
究。
直接检测物种的遗传变异难以操作, 一般常使
用基于居群遗传学理论的间接方法 , 例如分析
Hardy-Weinberg平衡、遗传距离、遗传分化、基因
流等来推测物种的遗传变异。而微卫星分子标记是
估测这些居群遗传参数的重要手段。SSR标记在同
属物种间的通用性高达50%(Peakall et al.,1998), 因
而得到广泛利用。近年来, SSR也用于估测苜蓿属的
遗传变异水平。例如Bonnin等(2001)用SSR标记研究
了截叶苜蓿(Medicago truncatula)的多态性水平和
空间遗传结构; Diwan等(2000)和Flajoulot等(2005)
用SSR标记分析了紫花苜蓿(M. sativa)的遗传变异;
Julier等(2003)从截叶苜蓿的EST数据库中发掘107
个SSR标记用于构建紫花苜蓿遗传连锁图谱并且用
于遗传多样性的研究; Eujayl等(2004)证明从截叶苜
① Wilson LC (2005) Characteristics of black medick (Medicago lupulina
L.) seed dormancy loss in western Canada. Master Thesis, University of
Manitoba, Winnipeg.
蓿EST中开发的SSR标记可用于苜蓿属其他种的遗
传变异分析。
EST-SSR标记是根据表达序列标签(expressed
sequence tag, EST)建立的简单重复序列(simple se-
quence repeat, SSR), 因此这种标记在同属的物种间
的通用性更高。通过比对, EST序列和蛋白序列数据
库能对应起来, 使特殊的遗传标记位点的功能更加
清晰(Bouck & Vision, 2007), 这就为苜蓿属植物的
遗传变异和功能基因多态性的研究提供了便利。
本研究利用从截叶苜蓿和紫花苜蓿的EST数据
库中筛选出具有多态性的SSR引物, 试图探究天蓝
苜蓿的居群遗传变异、基因流和繁育方式, 了解其
遗传背景, 为苜蓿属牧草资源的保护利用和遗传育
种提供科学依据。
1 材料和方法
1.1 实验材料
2004年8月和2005年10月在7个省区共采集了
天蓝苜蓿的17个自然居群, 包括新疆6个、内蒙古3
个、甘肃2个、陕西3个、山西1个、北京1个、湖北
1个(图1和表1)。根据物种的密度和分布情况, 各居
群随机取样12–27株, 采集少量叶片放入装有硅胶
的密封袋中保存, 带回实验室备用。
1.2 DNA提取
采用改进的CTAB法(Doyle & Doyle, 1987)。从3
片干燥的叶片中提取总DNA。模板DNA的质量用
0.8%的琼脂糖凝胶电泳(六一电泳仪)来检测, 浓度
图1 天蓝苜蓿17个居群的具体采样点分布(居群代码同
表1)
Fig. 1 Map showing the distribution of the sampled 17 Medi-
cago lupulina populations. Population codes are the same as in
Table 1.
第 3 期 闫娟等: 用 EST-SSR 标记分析中国北部和中部地区天蓝苜蓿的遗传多样性和遗传结构 265
表1 天蓝苜蓿的采样信息
Table 1 Sampling sites and sample size of Medicago lupulina
populations
居群
Population
经纬度
Locality
采样数目
Sample
size
新疆 Xinjiang
1 喀什 Kashi 39.44° N, 75.988° E 23
2 伊犁 Yili 43.88° N, 81.305° E 20
3 那拉提 Nalati 43.45° N, 83.283° E 20
4 库尔勒 Korla 41.75° N, 86.128° E 17
5 奇台 Qitai 43.70° N, 89.604° E 23
6 巴里坤 Balikun 43.58° N, 93.008° E 20
内蒙古 Inner Mongolia
7 海拉尔 Hailar 48.90° N, 119.837° E 18
8 白音敖包 Baiyinaobao 43.53° N, 117.236° E 21
9 兴和 Xinghe 40.89° N, 113.885° E 21
北京 Beijing
10 东灵山
Dongling Mountain
39.96° N, 115.439° E 12
山西 Shanxi
11 偏关 Pianguan 39.44° N, 111.461° E 22
陕西 Shaanxi
12 鱼河 Yuhe 37.98° N, 109.853° E 23
13 南泥湾 Nanniwan 36.32° N, 109.651° E 20
14 西安 Xi’an 34.28° N, 108.958° E 27
甘肃 Gansu
15 朱岔 Zhucha 36.94° N, 102.589° E 21
16 兴隆山
Xinglong Mountain
湖北 Hubei
35.78° N, 104.048° E 20
17 武汉 Wuhan 30.55° N, 114.415° E 26
总计 Total 354
采用紫外分光核酸测定仪(GENEQUANT, Eppen-
dorf, Germany)测定。用于微卫星分析时DNA浓度稀
释为5 ng/µL。
1.3 引物筛选、PCR扩增及产物检测
从已经发表的截叶苜蓿和紫花苜蓿的引物
(Julier et al., 2003; Flajoulot et al., 2005; Diwan et al.,
2000; Eujayl et al., 2004) (http://medicago.org/
genome/downloads.php)中挑选92对, 由上海英俊公
司合成。来自于相隔较远的4个居群(伊犁、海拉尔、
偏关、武汉)的16个个体的DNA用于筛选多态性引
物, 其中有9对EST-SSR标记用于扩增。
PCR扩增的反应体系如下: 总体积10 µL, 其中
包括10–50 ng的模板DNA, 1×reaction buffer, 1.5
mM MgCl2, 0.2 mM dNTP, 引物各0.5 µM, 0.5 U Taq
DNA酶 (invitrogen)。在Gene Amp PCR system 9700
(PE Applied Biosystems) PCR仪上进行扩增, 程序
和条件如下: 95°C 预变性5 min, 然后95°C下50 s,
50–60°C 45 s, 72°C 90 s，共30个循环; 最后72°C延
伸8 min终止反应。扩增产物采用变性聚丙烯酰胺凝
胶电泳银染检测: 加入3/4体积的变性剂(98%甲酰
胺, 10 mM pH 8.0 EDTA, 0.05%溴酚蓝和0.05%二
甲苯腈), 95°C变性5 min, 然后取2.7 µL样品在6%变
性聚丙烯酰胺凝胶上电泳, 电泳缓冲液为1×TBE。
电泳在六一电泳仪上进行, 功率恒定为55 W, 电泳
时间根据目的片段大小而定。用25 bp DNA Marker
(Promega, Madison, WI, USA)作产物片段大小的对
照标准。银染参照Sanguinetti等(1994)的程序, 略加
改动。
1.4 居群独立性检验
采用STRUCTURE 2.2 (Pritchard et al., 2000,
2007) 软件中完整的Bayesian聚类的方法检验居群
结构, 确定个体是否来自于预先人为划分的居群。
这个程序假设遗传标记是不连锁的或者在居群中
连锁平衡。因此我们用FSTAT 2.9.3软件(Goudet,
2001)分析了各个位点的连锁不平衡 , 并进行
Bonferroni多重比较 (Rice, 1989)。分组数目(K)一般
是从1或者2到居群数目加3 (Evanno et al., 2005)。因
此本实验分析设K = 1–20运行3次, burn-in和run
length分别为30,000和100,000。
1.5 居群遗传多样性、遗传分化和基因流分析
采用软件GenAlEx 6 (Peakall & Smouse, 2005)
计算以下居群遗传参数: 平均每个位点及居群的等
位基因数(分别为na、A), 有效等位基因数(ne)，预期
杂合度(HE), 观察杂合度(Ho), 近交系数(F), 自交
率(selfing rate)用公式s = 2F/(1+F) (Crow & Kimura,
1970)。用FSTAT 2.9.3软件 (Goudet, 2001)进行
Hardy-Weinberg平衡检验。居群间遗传分化系数
FST、RST也用此软件计算, 其中FST基于无限等位基
因模型(IAM), 而RST基于逐步突变模型(SMM)。遗
传分化系数FST根据公式Nm≈(1–FST)/4FST (Slatkin
& Barton, 1989) , 常用来估计居群的历史基因流。
用ARLEQUIN 3.0(Schneider et al., 2000)进行分子
方差(AMOVA)分析, 估测遗传变异在居群内和居
群间的分配情况。
266 生 物 多 样 性 Biodiversity Science 第 16 卷
1.6 遗传距离、地理居群的相关性分析
利用IBD软件(Bohonak, 2002)进行Mantel检验
(Mantel, 1967), 分析地理距离与遗传距离的相关
性。分析时设定10,000次数据随机选择。居群间的
遗传距离根据公式FST/(1–FST) (Rousset, 1997)计算,
地 理 距 离 根 据 采 样 点 的 经 纬 度 , 在
http://jan.ucc.nau.edu/∼cvm/latlongdist.html上计算居
群间的直线距离(km)。采用Populations 1.2.3 (Lan-
gella, 2000) 计算居群间Nei’s遗传距离 (Da)(Nei,
1983), 并且根据Da用TreeView (Page, 1996) 软件做
聚类分析。
2 结果
2.1 居群遗传多样性估测、Hardy-Weinberg平衡
与连锁不平衡检测
用9个EST-SSR标记分析了天蓝苜蓿17个自然
居群的354株个体(表2), 共检测到66个等位基因,
平均每个位点等位基因数(A)为7.333个。遗传多样
性(HE)最高的位点MTIC345 (0.320) 具有的等位基
因数 (8个 )不是最多。观察杂合度 (Ho)的范围是
0–0.085。
在17个野生居群中(表3), 各居群多态位点百分
率(PPL)均值为71.9%。每个居群的每位点的平均等
位基因数(na)为1.444–3.556, 其中新疆伊犁和甘肃
朱岔居群最高, 而陕西西安居群最低。有效等位基
因数(ne)偏低, 最高为新疆那拉提居群(1.868), 最低
是陕西西安居群(1.049); 这两个居群的遗传多样性
(HE)也分别是最高和最低 (朱岔 : 0.388, 西安 :
0.042)。观察杂合度(Ho)从0–0.056, 最低的居群在新
疆奇台、陕西南泥湾和甘肃兴隆山, 而最高在新疆
伊犁。近交系数(F)为0.716–1.000, 均值为0.888, 由
此计算的自交率(s)为93.8 %。有8个居群具有私有基
因, 其中新疆伊犁5个, 甘肃朱岔8个, 湖北武汉3
个, 新疆那拉提、库尔勒、内蒙古海拉尔、陕西鱼
河、陕西南泥湾各1个。
所有的居群位点显著偏离Hardy-Weinberg平衡
预期值(P<0.001)。所有居群中, 在0.05水平上, 有
0.14%的位点表现出连锁不平衡。
2.2 居群遗传分化和遗传结构
当K = 17时, ln P(D)得到最大值, 说明预先划
定的居群和按照遗传背景划分的居群相一致, 即它
们都是独立的居群(图2)。居群间的遗传分化系数
FST和RST(表2)的平均值分别为0.528和0.499。因为
FST和RST的结果相差不大 , 接下来的遗传距离
FST/(1-FST)和基因流Nm≈ (1–FST)/4FST计算只用
FST。天蓝苜蓿17个居群间的基因流(Nm)的平均值为
0.224。分子方差分析(AMOVA)结果表明, 59.02%的
变异分布在居群间(P<0.001), 37.26%的变异分布于
居群内个体间(P<0.001), 3.73%的变异分布在个体
内(P<0.001)。
2.3 地理距离和遗传距离的相关性
居群间遗传距离和地理距离呈显著的正相关
(r= 0.4141, P ≤ 0.0003)(图3)。根据Neis标准遗传距
离(Da)的聚类分析(NJ树)(图4)发现, 新疆居群（除了
表2 天蓝苜蓿9个EST-SSR位点的遗传多样性
Table 2 Genetic diversity in Medicago lupulina at nine EST-SSR loci
位点
Locus
等位基因数
A
预期杂合度
HE
观察杂合度
HO
遗传分化系数
FST
基因流
Nm
遗传分化系数
RST
MTIC189 10 0.256 0.017 0.555 0.201 0.478
MTIC432 5 0.177 0.034 0.643 0.139 0.58
MTIC339 4 0.039 0.000 0.058 4.038 -0.004
MTIC345 8 0.320 0.085 0.463 0.290 0.447
MTIC210 10 0.267 0.005 0.564 0.193 0.636
MTIC14 6 0.180 0.000 0.604 0.164 0.703
MTIC188 11 0.247 0.014 0.612 0.159 0.619
MAA660870 5 0.157 0.003 0.605 0.163 0.508
MtSSRNFAL05 7 0.266 0.017 0.649 0.135 0.528
平均 Mean 7.333 0.212 0.020 0.528 0.224 0.499
A, Number of alleles across all populations; HO, Observed heterozygosity; HE, Expected heterozygosity; FST, RST, Differentiation among population;
Nm, Gene flow.
第 3 期 闫娟等: 用 EST-SSR 标记分析中国北部和中部地区天蓝苜蓿的遗传多样性和遗传结构 267
表3 天蓝苜蓿17个自然居群的遗传多样性参数检测
Table 3 Genetic variability estimates for 17 Medicago lupulina populations
居群
Population
平均等位
基因数na
有效等位
基因数ne
观察杂合度
Ho
预期杂合度
HE
近交系数
F
自交率
s
多态率
PPL (%)
私有基因数
Private alleles
1 喀什 Kashi 2.444 1.746 0.019 0.346 0.947 0.973 66.7 0
2 伊犁 Yili 3.556 1.717 0.056 0.342 0.845 0.916 100 5
3 那拉提 Nalati 2.667 1.868 0.028 0.388 0.932 0.965 88.9 1
4 库尔勒 Korla 2.222 1.779 0.007 0.348 0.982 0.991 77.8 1
5 奇台 Qitai 2.111 1.380 0.000 0.214 1.000 1.000 77.8 0
6 巴里坤 Balikun 1.667 1.196 0.034 0.118 0.725 0.841 33.3 0
7 海拉尔 Hailar 2.111 1.137 0.025 0.107 0.781 0.877 66.7 1
8 白音敖包 Baiyinaobao 1.778 1.196 0.011 0.145 0.93 0.964 66.7 0
9 兴和 Xinghe 1.889 1.223 0.011 0.153 0.931 0.964 77.8 0
10 东灵山 Dongling Mountain 2.111 1.467 0.009 0.270 0.968 0.984 77.8 0
11 偏关 Pianguan 2.000 1.183 0.035 0.137 0.752 0.858 88.9 0
12 鱼河 Yuhe 2.333 1.294 0.034 0.188 0.824 0.904 66.7 1
13 南泥湾 Nanniwan 1.667 1.246 0.000 0.152 1.000 1.000 55.6 1
14 西安 Xi’an 1.444 1.049 0.012 0.042 0.716 0.835 33.3 0
15 朱岔 Zhucha 3.556 1.448 0.042 0.252 0.840 0.913 77.8 8
16 兴隆山 Xinglongshan 2.333 1.576 0.000 0.302 1.000 1.000 66.7 0
17 武汉 Wuhan 2.333 1.122 0.009 0.104 0.921 0.959 100 3
平均 Mean 2.248 1.390 0.020 0.212 0.888 0.938 71.9 1
na, Observed number of allele; ne, Effective number of allele; Ho, Observed heterozygosity; HE, Expected heterozygosity; F, Inbreeding coefficient; s,
Selfing rate; PPL, Percentage of polymorphic loci.
表4 居群遗传结构的分子方差分析
Table 4 Molecular variance (AMOVA) analysis based on EST-SSR markers for Medicago lupulina
变异来源
Source of variation
自由度
d. f.
离差平方和(SSD)
Sum of squares
方差分量
Variance components
方差分量比例(%)
Percentage of variation
P
居群间 Among populations 16 951.886 Va = 1.38653 59.02 P<0.001
居群内个体间 Within populations 337 619.494 Vb = 0.87535 37.26 P<0.001
个体内 Within individuals 354 31.000 Vc = 0.08757 3.73 P<0.001
总计 Total 707 1602.380 2.34945
图2 STRUCTURE分析得到的居群分组概率的对数值
(K=1–20)
Fig. 2 Estimated posterior probability of K (1–20) for Medi-
cago lupulina, where K represents the number of clusters.
新疆巴里坤）和内蒙古海拉尔聚在一起, 而新疆巴
里坤、内蒙古白音敖包和山西偏关聚到一起, 其他
的居群都是地理位置相近的聚在一起。
3 讨论
3.1 遗传多样性和繁育系统
物种的繁育系统对居群的遗传结构和遗传多
样性有很大的影响：一般自交种居群内遗传多样性
较低 , 而居群间遗传分化较高 ; 异交种则相反
(Loveless & Hamrick, 1984; Harmrick & Godt, 1996;
Stenøien et al., 2005; Clauss & Mitchell-Old, 2006;
Mable & Adam, 2007)。在本研究中, 天蓝苜蓿各居
群的遗传多样性(HE)的均值是0.212, 与其他自交、
草本植物相比处于中等水平。例如: 北欧的拟南芥
(Arabidopsis thaliana)HE平均值为0.06(StenØien et
al., 2005), 而法国地中海地区的截叶苜蓿的HE平均
值是0.58 (Bonnin et al., 2001)。天蓝苜蓿所有位点－
居群组合偏离H-W平衡, 观察杂和度(Ho)的均值是
268 生 物 多 样 性 Biodiversity Science 第 16 卷
图3 天蓝苜蓿遗传距离和地理距离的相关性
Fig. 3 Correlation between genetic distance and geographical
distance of all sampled populations of Medicago lupulina
图4 天蓝苜蓿17个居群的聚类分析图 (居群编码见表1)
Fig. 4 Unrooted neighbour-joining tree showing relationships
between the 17 Medicago lupulina populations. Population
codes are the same as in Table 1.
0.02, 所有采样居群的F均值是0.888, 由此可见该
物种杂合子缺失。根据居群的F值估算出天蓝苜蓿
的自交率高达93.8%。纯合子过量和H-W平衡偏离
可能缘于高水平的近交和自交(Fowler, 1965)。以往
的一些研究通过观察认为天蓝苜蓿是混和交配系
统(Lammerink, 1968), 也有一些学者认为主要是自
交(Sidhu, 1971), 但是缺乏具体的数据支持。
EST-SSR分布于编码区, 和传统的SSR引物相
比多态性较低, 这一观点在许多种的研究中已得到
证实, 例如水稻(Cho et al., 2000)、小麦(Gupta et al.,
2003)、截叶苜蓿(Eujayl et al., 2004)、大麦(Chabane
et al., 2005)、向日葵(Pashley et al., 2006)。但是在居
群遗传学研究中, 它也足以揭示居群遗传变异水平
(Ellis & Burke, 2007)。本研究中天蓝苜蓿的多态性
是33.3–100%, 均值是71.9%, 这与用EST-SSR分析
得出的截叶苜蓿具有较高多态性(70%)的结果一致
(Eujayl et al., 2004)。由此可推知天蓝苜蓿总体水平
的遗传多态性比较高。
天蓝苜蓿的遗传多样性在各居群间有所差异,
其中, 甘肃朱岔居群的遗传多样性最高，而陕西西
安最低。从等位基因多样性(na)来看, 新疆伊犁和甘
肃朱岔居群最高, 而陕西西安最低。遗传多样性和
等位基因多样性最低的居群是采样个体最多的陕
西西安, 可能因为采样范围比较狭窄, 仅在一小块
地方发现天蓝苜蓿的分布, 采集到的个体同质性程
度高。
私有基因的存在也是遗传特异性的衡量标准
之一。本研究中发现新疆伊犁和甘肃朱岔居群的私
有基因数目较多。根据实验分析得出的天蓝苜蓿等
位基因的分布模式、私有基因和遗传变异的分布等
对于苜蓿属优良牧草品系的选育提供了重要的基
础。
3.2 遗传结构和基因流
遗传变异在个体内、个体间、居群内和居群间
的分布是居群遗传结构的基础(Wright, 1965)。而交
配系统和生活史对这一分布有很大的影响: 一般在
自交种中, 遗传分化系数比较高, 遗传变异主要存
在于居群间(Loveless & Hamrick, 1984; Harmrick &
Godt, 1996)。例如法国地中海地区的截叶苜蓿的生
殖 方 式 类 似 天 蓝 苜 蓿 , 它 的 FST 平 均 值 是
0.37(Bonnin et al., 2001); 挪威的拟南芥FST＝0.88,
而居群间遗传变异占76%(Stenøien et al., 2005)。日
本的野生大豆(Glycine soja)居群间的遗传分化FST
＝0.76 (Kuroda et al., 2006)。本研究结果与自交种所
预期的遗传分化结果是一致的。根据IAM和SMM计
算天蓝苜蓿17个居群间的遗传分化FST和RST值分别
为0.528和0.499, 高于微卫星标记在自交植物中遗
传分化的平均值(FST = 0.42)(Nybom, 2004)，说明天
蓝苜蓿居群间高度分化, 遗传变异主要存在于居群
间, 这与分子方差(AMOVA)分析得出的59.02%的
变异分布在居群间的结果一致, 同时也是对天蓝苜
蓿自交的生殖方式的一个佐证。
基因流的大小主要决定于花粉流或种子流
(Ennos, 1994)。居群遗传学研究中，基因流根据Nm
第 3 期 闫娟等: 用 EST-SSR 标记分析中国北部和中部地区天蓝苜蓿的遗传多样性和遗传结构 269
的大小划分为高(≥1.0)、中(0.250–0.99)、低(0.0–
0.249)三个等级水平(Govindaraju, 1988)。对广布种
来说, 居群间遗传分化比较小, 基因流频率比较高
(Loveless & Hamrick, 1984)。天蓝苜蓿在我国广布,
地理分布上基本是连续的; 此外, 根据资料记载,
天蓝苜蓿的种子和植株分别可以在水中漂浮5天和
12天 , 又因被当作牧草而传播范围得到扩大
(Turkington & Cavers, 1979), 因此理论上天蓝苜蓿
居群间应该有很高的基因流。但是, 本研究发现天
蓝苜蓿居群间基因流较小(Nm ＝ 0.224), 原因是受
到了自交的限制, 基因很难通过传粉转移到其他个
体中, 只有经过遗传漂变和自然选择固定下来。由
此可见, 繁育系统对居群遗传结构具有决定性的影
响。
3.3 空间遗传结构
常用Mantel检验来验证物种是否符合距离隔离
(IBD)模型(Stenøien et al., 2005; Clauss & Mitchell-
Olds, 2006; Moyle, 2006), 本研究中Mantel检验的
结果显示居群间遗传距离和地理距离有极显著的
相关性(r = 0.4141, P ≤ 0.0003), 这表明天蓝苜蓿居
群间的基因流受地理隔离的影响。同时, 根据Nei’s
标准遗传距离(Da)的聚类分析发现, 一般是地理距
离以及地形相近的聚到一起, 进一步证明了上述观
点。但也有一些例外情况, 比如新疆巴里坤居群由
于和新疆其他5个居群之间被天山阻隔，而与内蒙
古白音敖包居群聚在一起; 而内蒙古海拉尔居群和
新疆除巴里坤外的5个居群聚在一起, 这可能是因
为在海拉尔和新疆之间的蒙古构成了天蓝苜蓿的
一个自然生境廊道。这还需要进一步的研究证实。
总之, 通过对天蓝苜蓿遗传多样性和空间遗传
结构的分析, 验证了它具有很高的自交水平, 也可
能偶尔发生异交。遗传分化水平和基因流情况是对
天蓝苜蓿自交本质的一个佐证, 同时也有利于更深
入地认识它的空间遗传结构, 更好地了解它的适应
性基础和遗传信息, 同时也为苜蓿优良牧草资源的
保护利用和遗传育种提供科学依据。
致谢: 本研究曾得到康明、姚小洪、张金菊和张蕾
的帮助, 谨此致谢。
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(责任编委: 王艇 责任编辑: 时意专)