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6 － BA 0． 50 mg /L处理的培养基有少数愈伤组织出现先分化
出根的现象，可能是由于 6 － BA /NAA 的比值较低，促使根器
官先发生。
本次试验采用的植物生长调节剂有 6 － BA、NAA、2，4 －
D 3 种。试验结果表明，在初代培养中，适当添加 6 － BA、
NAA、2，4 － D可以有效促进芽的萌动和愈伤组织的诱导。其
中 2，4 － D对愈伤组织的诱导有着明显的促进作用，但用量
过高会产生毒害作用，使形态畸变，诱导率降低。在继代培养
中 6 － BA对不定芽的增殖有较好的促进效果，但在试验观察
中发现高浓度的 6 － BA 培养基中长期培养会出现较多玻璃
化现象。在生根培养中，NAA 的运用有利于植株根系萌动，
当 NAA浓度较高时，形成的根粗壮，根毛较多;当 NAA 浓度
较低时，形成的根细长、数量较多、根毛较少。
在本试验中，出现了叶片诱导时出愈率较高，但愈伤组织
增殖系数不高、分化较少的现象，即使愈伤组织能分化出少量
芽，也会因培养时间过长无营养而生长缓慢甚至死掉。分析
原因，一方面可能是初代培养使用的激素浓度不当，虽然出愈
率较高，但所诱导的愈伤组织大多数是比较致密的愈伤组织，
很少有粗颗粒状突起，难以增殖分化成芽;另一方面可能是由
于植物本身的生理状态和遗传特性等因素造成的愈伤组织生
长情况不佳［6］;此外，光照、温度等培养条件不适宜都可能是
造成愈伤组织难分化成芽及分化的芽不易成活的因素。具体
的愈伤组织分化成苗较难的原因还有待于进一步深入研究。
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doi:10． 15889 / j． issn． 1002 － 1302． 2015． 11． 023
西藏砂生槐 EST － SSR引物开发及多态性检测
符亚茹，李少珂，姚卫杰，李慧娥
(西藏大学农牧学院，西藏林芝 860000)
摘要:砂生槐为青藏高原特有灌木种，具有重要生态价值。开发多态 EST － SSR 引物对其居群遗传多样性研究及
保护策略的制定具有重要意义。利用 SciRoKo v3． 4 软件对前期获得的砂生槐转录组中 146 943 个转录本进行扫描共
发现 9 428 个 SSR位点。转录本中的微卫星种类十分丰富，其中以三核苷酸和五核苷酸重复最多，分别占 SSR总位点
数的 33． 32% 和 21． 70%，重复次数主要集中在 3 ～ 9 次重复。其中(AG/CT)n、(GA/TC)n、(GAA/TTC)n、
(AAAAT /ATTTT)n 重复基序最多，占总重复基序的 4． 50%、4． 34%、3． 13%和 2． 44%。本研究中设计 130 对 EST －
SSR引物，有 80 对扩增出预期大小条带，经变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，最终有 11 对具有较高多态性，且对于 30
个模板得到的位点平均等位基因数为 2． 9;观测杂合度(HO)和期望杂合度(HE)平均值分别为 0． 423 9 和 0． 336 4。
关键词:砂生槐;转录本;EST － SSR;多态性;引物
中图分类号:S718． 43 文献标志码:A 文章编号:1002 － 1302(2015)11 － 0078 － 04
收稿日期:2014 － 12 － 19
基金项目:国家自然科学基金(编号:31260189) ;西藏特色农牧资源
研发协同创新中心建设———高原生态。
作者简介:符亚茹(1988—) ，女，陕西西安人，硕士研究生，主要从事
高原植物分子生态研究。E － mail:fuyaruxw@ 126． com。
通信作者:李慧娥，博士，副教授，主要从事高原植物分子生物学研
究。E － mail:lihuiesh@ 126． com。
砂生槐［Sophora moorcroftiana(Benth．)Benth． ex Baker］
为青藏高原特有豆科槐属矮灌木。主要分布在青藏高原海拔
2 800 ～ 4 400 m的西藏“一江两河(雅鲁藏布江、拉萨河、年楚
河)”河谷宽谷段的沙质地上，在雅鲁藏布江宽河谷形成大片
群落［1］。该树种为青藏高原干旱河谷半固定沙地上的先锋
灌丛植物［2］。由于其极强的抗旱、防风固沙特点，目前已成
为青藏高原人工造林先锋树种，具有重要的生态价值。但由
于砂生槐分布区的过度放牧及薪炭过度樵采等人为干扰，导
致青藏高原独有的砂生槐种群严重退化，甚至一些种群正逐
步消失，为此对砂生槐的保护迫在眉睫。
基于遗传学与分子生物学的植物遗传多样性研究为资源
保护提供了新的理论指导。分子标记是遗传多样性研究的重
要手段之一，常用 DNA分子标记中简单重复序列(simple se-
quence repeats，SSR)［3］又称微卫星(microsatellite)［4］，因其具
有共显性分离、重复性强、DNA样本用量少、位点专一且多态
性高等优点［5］，已广泛运用于植物遗传多样性分析中［6 － 9］。
本实验室前期已经获取了砂生槐的转录组数据(GenBank 登
录号:SRP041237)［10］，这为成功开发砂生槐多态EST － SSR
引物提供了前提，本研究则基于此转录组数据开发用于分析
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砂生槐遗传多样性的多态 EST － SSR引物。
1 材料与方法
1． 1 试验材料
来自于青藏高原不同分布区的共 30 个砂生槐单株用于
多态 SSR引物开发。
1． 2 总 DNA提取和检测
取砂生槐叶片 0． 3 g，采用改良无液氮 CTAB 法［11］提取
总 DNA。琼脂糖凝胶和微量紫外分光光度计(NanoDrop 2000
C，美国)对其浓度和纯度进行精确检测，－ 20 ℃保存备用。
1． 3 SSR引物来源及引物设计
用高通量 Illumina 2 代测序技术对砂生槐 RNA样本进行
测序，得到 clean data 数据。再利用 CLC Genomics Workbench
v6． 5(CLC Bio，Denmark)软件对高通量数据进行拼接分析，
最后用 SciRoKo 3． 4［12］软件对转录组所有转录本进行 SSR 位
点扫描。从中选取三重复基元最终设计并合成 130 对 SSR
引物用于多态引物筛选。
利用 Primer Premier 6． 0 软件，对含有 SSR位点的 EST序
列进行引物设计，设定标准为:GC 含量 40% ～ 60%，退火温
度 55 ～ 60 ℃，引物长度范围 17 ～ 25 bp，扩展片段长度 110 ～
200 bp。
1． 4 PCR扩增及电泳检测
PCR扩增体系为 20 μL:上下游引物各 1 μL，DNA 模板
3 μL (10 ng /μL) ，PCR扩增 Mix (康为世纪生物科技有限公
司，北京)10 μL，超纯水 5 μL。PCR 扩增条件为:94 ℃预变
性 4 min;95 ℃变性 30 s，退火 30 s，72 ℃延伸 40 s，35 个循
环;72 ℃延伸 5 min。
用浓度为 2%的琼脂糖凝胶对 PCR 产物进行检查，查看
是否有预期大小扩增产物。然后对能扩增出条带的产物进行
8%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测［13］，以 10 bp DNA maker
(广州东盛)作为分子量标准，电泳后银染［14］染色，在凝胶成
像系统(GBOX － F3 － E，英国)对条带进行扫描分析，并照相
保存。
1． 5 数据处理和分析
根据扩增产物条带的迁移率，对照分子量标准分别统计
每个位点等位基因片段长度，获得数据矩阵。用软件 Power-
Marker v3． 0［15］对每个位点等位基因数(NA)、观测杂合度
(HO)和期望杂合度(HE)、连锁平衡(LD)和哈温平衡(HWE)
进行检测及评价。
2 结果与分析
2． 1 砂生槐转录组 SSR位点扫描
用 SciRoKo 3． 4 软件默认参数对 146 943 个砂生槐转录
本进行扫描共发现 9 428 个 SSR 位点，其 SSR 数量、类型及频
率见表 1，SSR中主要重复基元的类型及频率见表 2。由表 1、
表 2 可知，SSR 种类丰富，且不同类型 SSR 出现频率不同，除
单核苷酸外，其他核苷酸重复所占总 SSR 比例从 12． 61%到
33． 32%;以三、五核苷酸重复为主，分别占 SSR 总数的
33． 32%和 21． 70%;其他类型所占比例相对较小，其中四核
苷酸最少;重复次数主要集中在 3 ～ 9 次重复。从不同 SSR
基元出现频率来看(表 2) ，二核苷酸中以(AG /CT)n 和(GA /
TC)n 为主，所占其重复基元的比例分别为 33． 41% 和
32． 23%;三核苷酸种类丰富，其中以(GAA /TTC)n、(AAG /
CTT)n 和(AGA /TCT)n 最多，分别占其重复基元的 11． 94%、
7． 61%、7． 49%，其他较少;四核苷酸中以(AAAT /ATTT)n 最
多，占 13． 05%;另外五、六核苷酸分别以(AAAAT /ATTTT)n
和(AAAAAT /ATTTTT)n 最多;占总重复基元的主要重复基元
类型是 AG /CT (4． 50%)、GA /TC (4． 34%)、GAA /TTC
(3． 13%)和 AAAAT /ATTTT(2． 44%)。基于此扫描结果根据
SSR位点侧翼序列共设计并合成 130 对引物供筛选。
表 1 砂生槐 EST － SSR的类型、数量及分布频率
重复类型
重复次数
3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 ≥15
总计
百分比
(%)
二核苷酸 － － － － 362 263 280 228 79 7 21 29 1 269 17． 11
三核苷酸 － 849 705 491 223 80 50 33 14 11 3 12 2 471 33． 32
四核苷酸 538 257 96 18 15 4 2 5 － － － － 935 12． 61
五核苷酸 1 073 394 102 30 6 2 1 － － 1 － － － 1 609 21． 70
六核苷酸 586 407 97 24 10 3 2 1 1 1 － － － 1 132 15． 26
总计 1 659 1 339 1 305 855 525 605 350 333 267 95 18 24 41 7 416
百分比(%) 22． 37 18． 06 17． 60 11． 53 7． 08 8． 16 4． 72 4． 49 3． 60 1． 28 0． 24 0． 32 0． 55
注:二、三、四、五、六核苷酸重复类型的 EST － SSR最小重复次数标准分别是 8、5、4、3、3 次。
2． 2 扩增产物长度差异的 SSR引物
首先用 130 对引物对 2 个来自不同分布区的砂生槐
DNA模板进行 PCR 预扩增，2%琼脂糖凝胶电泳结果显示其
中 80 对引物扩增出预期大小条带(图 1)。用此 80 对引物对
30 个不同分布区的模板进行扩增的 PCR 产物经 8%变性聚
丙烯酰胺凝胶电泳检测(图 2) ，最终有 41 对引物对不同模板
的扩增显示出差异，其中有 19 对差异变化较大，其引物信息
见表 3。
2． 3 多态 SSR引物筛选
用 PowerMarker 3． 0 软件对表 3 中 19 个 SSR位点进行分
析，结果表明，其中 8个 SSR位点分析结果偏离哈温平衡达极
显著水平。因此，最终筛选 11个多态 SSR位点，其等位基因数
(NA)、观测杂合度(HO)和期望杂合度(HE)、连锁平衡及哈温
平衡分析结果见表 4。11 对引物对应 SSR 位点等位基因数从
2 (Sm69，Sm82，Sm101 和 Sm127)至 5 (Sm85) ，平均等位基因
数为每位点 2． 9。观测杂合度从 0． 212 8 (Sm122)至 0． 570 6
(Sm85) ，期望杂合度从 0． 133 3 (Sm122)至 0． 700 0 (Sm24) ，
平均值分别为 0． 423 9和 0． 336 4。对期望杂合度指标，按从小
到大顺序对各位点排序:Sm122 ＜ Sm85 ＜ Sm50 ＜ Sm82 ＜
Sm112 ＜ Sm127 ＜ Sm101 ＜ Sm95 ＜ Sm69 ＜ Sm77 ＜ Sm24。经过
—97—江苏农业科学 2015 年第 43 卷第 11 期
表 2 砂生槐 EST － SSR中主要重复基元的类型及频率
重复类型
主要重复
基元类型
占各类重复
基元比例(%)
占总重复基
元比例(%)
二核苷酸 AG /CT 33． 41 4． 50
GA /TC 32． 23 4． 34
三核苷酸 GAA /TTC 11． 94 3． 13
AAG /CTT 7． 61 1． 99
AGA /TCT 7． 49 1． 96
CAA /TTG 6． 03 1． 58
TCA /TGA 5． 63 1． 47
ATG /CAT 5． 00 1． 31
ATC /GAT 4． 65 1． 22
CCA /TGG 4． 65 1． 22
AAC /GTT 4． 41 1． 16
AAT /ATT 4． 13 1． 08
四核苷酸 AAAT /ATTT 13． 05 1． 29
GAAA /TTTC 8． 13 0． 81
TAAA /TTTA 7． 91 0． 78
AAAG /CTTT 6． 63 0． 70
五核苷酸 AAAAT /ATTTT 14． 30 2． 44
TAAAA /TTTTA 5． 47 0． 93
AAAAG /CTTTT 4． 10 0． 70
ATAAA /TTTAT 3． 17 0． 54
六核苷酸 AAAAAT /ATTTTT 5． 48 0． 66
TAAAAA /TTTTTA 3． 27 0． 39
AAAATA /TATTTT 2． 74 0． 33
AAAAAG /CTTTTT 2． 12 0． 25
FDR检测［16］，其中 3 个位点 (Sm85、Sm95、Sm122)显示偏离
哈温平衡(不显著)。因此，这 11 对筛选出的多态 SRR 引物
可用于下一步砂生槐遗传多样性分析。
3 讨论与结论
对于缺乏基因组信息的物种来说，欲开发应用于遗传多
样性的多态 SSR引物成本高、耗时长。基于高通量转录组数
据开发多态 EST － SSR引物具有开发成本低、操作简便、信息
量大等优势而被广泛应用［17］。砂生槐因其分布范围狭窄、分
布地交通不便等原因一直没有相关基因组序列被公开报道，
本研究基于实验室前期获得的转录组数据，设计的SSR引物
表 3 砂生槐扩增产物长度差异的 EST － SSR引物
位点 引物序列(5→3) 重复基元
退火温度
(℃)
预期大小
(bp)
条带范围
(bp)
Sm2 F:CGGAAGCAGCGGTGGCT;R:GTTCTTGGATCCAGCTGGT (AAC)5 55 139 137 ～ 148
Sm8 F:GGGGATTCCTGTGTATCAG;R:GACATGGGATCCGCGAAG (ATC)5 55 162 152 ～ 162
Sm24 F:CCGGACGTCATAACGAGG;R:GGGCGCATCATATGGAGG (ATG)3、ACG(ATG)3 56 146 140 ～ 146
Sm25 F:GACTGATAACTCCCCAGAG;R:CATAGCCAAGAGTCCATAAC (AGG)6 55 173 172 ～ 181
Sm33 F:GACAAGGGAGGTGGGCG;R:GCAACGGCGATGGTTGTC (AGA)5 55 140 134 ～ 146
Sm39 F:CTGCTTCTGGTAAGAAATGG;R:GTGAACTATGGTCACGTCC (TGG)5 55 153 153 ～ 159
Sm50 F:GGTCATTTTAGTCCCTAGAC;R:CAACACAATACCCTTCTTCC (TTC)3、TTG(TTC)3 56 158 149 ～ 158
Sm69 F:CCTCTCCTAATATCCCTCC;R:CGGAATCTAGAATGATGAAAC (TCT)5 56 150 147 ～ 150
Sm72 F:CTCAGCGGACATACCAATC;R:CTGTCGCCACCAGCAGC (GCG)5 56 130 127 ～ 133
Sm77 F:GAATACTTGGTCGTGTTTGG;R:GGAGGCAGTGAGGGCTG (TTA)5 57 140 140 ～ 146
Sm82 F:GCAAAGGGTTGGGTGTGG;R:GATTTCCTCCACTTATGAGG (AGA)6 57 142 139 ～ 142
Sm85 F:CCCTTAACTAACTTATATCCC;R:CGACACTGGTTCCTACTAC (GAT)6 56 170 170 ～ 185
Sm95 F:CAAAAGGGTCACCAGCAAAA;R:GTAGCTCCCATTCTCTCTC (GAT)5 56 140 134 ～ 140
Sm97 F:GACACATAACCATTCCCTTC;R:GTTGATTATGTCTTTCTGAGG (ACA)5 55 137 134 ～ 140
Sm101 F:CTTCTTTGCCTTCCCATCC;R:GGGGAAATGGCCATGGTG (TAC)5 57 168 168 ～ 171
Sm110 F:CAGGTTCAATCCGCTGCC;R:CGGCGGAGGCAGGAGC (CCG)7 56 157 139 ～ 175
Sm112 F:GGCGAAGAGGATCTGAGG;R:GGCCACCAATAGGGTCTC (GTT)6 56 178 175 ～ 181
Sm122 F:CTGTGATGGCAATCTCCAC;R:CGGATCGGGAGATTGGAG (TTC)6 56 148 148 ～ 154
Sm127 F:GCTAACTTTGGTCTTCCCC;R:GCTTAGGGTTCTGCTCATC (TCC)5 56 140 140 ～ 143
中 61． 5%能在基因组 DNA 上扩增出预期大小条带，未成功
扩增的引物可能是由于:2 条引物被内含子隔开;引物位置恰
好位于内含子或外显子剪切点;EST 片段发生了变化等而导
致无法有效扩增。
砂生槐高通量转录组中微卫星的种类非常丰富，从单核
苷酸到六核苷酸都具有丰富的类型，其中以三核苷酸和五核
苷酸重复为主，分别占 SSR 总数的 33． 32%和 21． 70%，目前
在大多数物种如豌豆［18］、苹果［19］、红豆杉［20］、杜仲［21］等中，
研究发现二核苷酸和三核苷酸是最常见的转录组 SSR 重复
基序类型。主要重复基元的比较分析表明，二核苷酸中的
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表 4 11 对砂生槐多态 EST － SSR位点信息
位点 NA HO HE P(Seq － Bon)
Sm24 3 0． 509 4 0． 700 0 0． 039 0(0． 007 3)
Sm50 3 0． 235 0 0． 266 7 1． 000 0(0． 050 0)
Sm69 2 0． 444 4 0． 400 0 0． 702 0(0． 025 3)
Sm77 3 0． 539 4 0． 500 0 0． 144 0(0． 012 7)
Sm82 2 0． 497 8 0． 266 7 0． 007 0(0． 006 4)
Sm85 5 0． 570 6 0． 233 3 0． 000 0(0． 004 6)
Sm95 4 0． 501 7 0． 366 7 0． 002 0(0． 005 1)
Sm101 2 0． 432 8 0． 300 0 0． 097 0(0． 010 2)
Sm112 3 0． 399 4 0． 266 7 0． 087 0(0． 008 5)
Sm122 3 0． 212 8 0． 133 3 0． 004 0(0． 005 7)
Sm127 2 0． 320 0 0． 266 7 0． 303 0(0． 017 0)
Mean 2． 9 0． 423 9 0． 336 4
注:本表中所筛选的 11 个 SSR位点为表 3 中加粗位点。
AG /CT重复，三核苷酸中的 GAA /TTC 重复，四核苷酸中的
AAAT /ATTT重复和五核苷酸中的 AAAAT /ATTTT 重复在各
类重复基元中所占比例最大，六核苷酸各重复类型所占的比
例都较低，这与桑树［23］较为相似。EST － SSR 发生频率和密
度、重复基元类型在不同物种间存在较大差异，这可能与物种
基因组组成、转录组测序方法、数据量大小、微卫星搜索标准
等不同有较大的关系。物种三核苷酸基序数量较多可能是对
自然选择机制的一种积极响应，这对物种的生存竞争具有重
要意义，且三核苷酸基序的 SSR 位点具有转高的遗传变
异［22］，因此本研究主要选取三核苷酸基序的 SSR位点设计引
物进行分析。
对不同植物种类 SSR位点分析结果显示，每个 SSR 位点
的平均等位基因数约为 10． 0，期望杂合度约为 0． 61［24］，本研
究中，80 对砂生槐 EST － SSR 严格控制分析结果后，最终有
11 对引物显示出较高的多态性。在这 11 个位点中尽管
Sm24 和 Sm77 位点的遗传多样性相对于其他位点来说较高，
但多数位点平均等位基因数和期望杂合度都低于上述平均
值，这可能是因为文献所列这 2 项指标的平均值仅基于部分
物种所得引起的偏差及砂生槐分布范围狭窄所致。
综上，利用砂生槐转录组数据开发多态 EST － SSR 引物
是可行的，同时最终筛选出的这 11 对多态 EST － SSR 引物可
以用于后期砂生槐天然居群遗传多样性分析、核心种质库构
建、分子标记辅助育种、功能基因挖掘等研究中。
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