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收稿日期:2016-05-03; 修订日期:2016-08-31
基金项目:国家自然科学基金(No． 31260077);
湖南省高校创新平台开放项目(No． 11K053)
作者简介:王美蓉(1989-)，女(壮族)，湖南郴州人，云南中医学院助教，硕
士学位，主要从事中药资源开发与利用研究工作．
* 通讯作者简介:黄衡宇(1969-)，男(汉族)，江苏无锡人，云南中医学院
教授，博士学位，主要从事植物发育生物学研究工作．
民族药青叶胆 EST － SSＲ反应体系建立及引物筛选
王美蓉1，王元忠2，黄衡宇1*
(1．云南中医学院中药材优良种苗繁育工程研究中心，云南 昆明 650500;
2．云南省农业科学院药用植物研究所，云南 昆明 650200)
摘要:目的 采用 EST － SSＲ标记遗传多样性能研究。方法 以青叶胆叶片为材料，采用改良 CTAB 法提取 DNA，通过单
因素筛选法及 L16(4
5)正交试验对模板 DNA、dNTPs、引物、Taq酶及 Mg2 + 5 个因素进行优化试验。结果 最佳反应体系为
(20 μl):50 ng模板 DNA，150 μmol /L dNTPs，0． 1 μmol /L 引物，1． 5 U Taq酶，2． 5 μmol /L Mg2 +。从 52 对引物中初步筛
选出 10 对条带清晰、多态性好的引物。结论 本实验获得的优化体系能稳定用于青叶胆 EST － SSＲ 分子标记，为遗传多
样性、亲缘关系分析及遗传作图等研究工作奠定了重要基础。
关键词:青叶胆; EST － SSＲ; 正交设计; 体系优化; 引物筛选
DOI标识:doi:10． 3969 / j． issn． 1008-0805． 2016． 11． 093
中图分类号:Ｒ282． 2 文献标识码:A 文章编号:1008-0805(2016)11-2802-04
青叶胆是云南传统民族药用植物，被 1977 年后历版《中国药
典》［1］及《中国民族药志要》［2］所收载，为龙胆科(Gentianaceae)
獐芽菜属(Swertia)一年生草本植物 Swertia mileensis［3］，是我国特
有的一种珍稀药材，有清热解毒、利胆健胃等功效［4］。主要成分
有獐牙菜苦苷、龙胆苦苷和獐牙菜苷等［5］。Geng 和 Cao 等［6 ～ 11］
通过研究发现，青叶胆中提取的 15 种獐牙菜内酯(swertilactones
A － O)具有抗 HBV活性，特别是獐牙菜内酯 H － K 具有显著抑
制 HBV DNA复制活性。郗厚诚等［12］对獐牙菜亚族分子系统学
进行研究，发现与斜茎獐牙菜 Swertia patens 亲缘关系最近;李水
仙等［13］采用 ISSＲ对其遗传多样性进行了初步研究。总体来说，
国内学者对青叶胆的研究主要集中在化学成分及药理活性上，而
遗传多样性方面的研究仍十分匮乏。近年来由于民族药产业的
兴起，使得青叶胆市场需求量增大，导致人为毁灭性采挖，趋于渐
危状态。因此，对民族药青叶胆开展保护研究工作迫在眉睫。而
遗传多样性研究对其合理保护措施的制定起着重要作用。
EST － SSＲ(EST Simple Sequence Ｒepeat)分子标记技术因共
显性、可再生性、高多态性等优点，已被广泛应用于群体遗传结
构［14］、品种鉴定［15］、遗传图谱构建［16］、QTL 定位［17］及分子标记
辅助育种等研究领域。但是，对民族药的研究至今非常有限［18］，
大部分民族药 EST － SSＲ标记亟待开发。采用 EST － SSＲ标记研
究青叶胆实生群体遗传多样性和遗传结构，分析群体遗传变异和
分化程度，了解其遗传背景，为今后制定合理保护措施提供重要
依据。但 PCＲ反应涉及诸多因素，且各因素对其反应过程都会
产生较大影响［19］。因此，建立一套适合该物种的 EST － SSＲ 反
应体系至关重要。本研究以青叶胆植株为材料，对影响 EST －
SSＲ PCＲ反应体系的各因子参数进行优化，建立了 EST － SSＲ反
应优化体系，并对适合该反应的引物进行了初步筛选，为利用
EST － SSＲ技术对青叶胆居群的遗传多样性研究奠定基础。
1 材料
1． 1 试验材料 青叶胆药材采自云南弥勒市绿水村、习岗哨、猴
街、布龙坡及小苍窝，经云南中医学院钱子刚教授鉴定为青叶胆
Swertia mileensis T． N． Ho et W． L． Shi取健壮植株，采集鲜嫩幼
叶，硅胶干燥备用。
1． 2 主要试剂 10 × PCＲ Buffer、DNA Marker、Taq 酶、dNTPs 等
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时珍国医国药 2016 年第 27 卷第 11 期 LISHIZHEN MEDICINE AND MATEＲIA MEDICA ＲESEAＲCH 2016 VOL． 27 NO． 11
主要试剂购自北京全式金生物技术有限公司。EDTA、CTAB、异
丙醇、β －巯基乙醇、氯仿、异戊醇等常规试剂购自北京鼎国生物
技术有限责任公司。
1． 3 引物 采用自主设计的引物序列。先从 NCBI 网站数据库
下载龙胆科(Gentianaceae)和獐芽菜属(Swertia)EST 序列，利用
Sequence Seiners 1． 2 软件和 Primer 5 进行引物设计，委托赛音生
物技术有限公司合成，共 52 对。
2 方法
2． 1 基因组总 DNA 提取 取幼嫩叶片约 1 g，改良 CTAB 法［20］
提取基因组总 DNA。紫外分光光度计测定 DNA 质量和浓度并
采用 1． 0%琼脂糖凝胶电泳(AGE)检测，－ 20℃冰箱保存备用。
随机选取一份 DNA，用于单因素筛选和正交优化试验。
2． 2 EST － SSＲ PCＲ反应体系单因素筛选试验 对合成引物进
行 PCＲ 检测，取筛选出的 1 对引物对各因素进行筛选试验。
20μl反应体系:40ng 模板 DNA，200 μmol /L dNTPs，0． 2 μmol /L
引物，2． 0 U Taq DNA聚合酶，2． 0 μmol /L Mg2 +，10 × PCＲ Buffer
2 μL，剩余体积 ddH2O补足。PCＲ扩增程序:94℃预变性 5 min;
94℃变性 1 min，47 ～ 55℃退火 35 s，72℃延伸 35 s，共 35 个循环;
72℃再延伸 10 min，12℃保存。扩增产物采用 2% AGE 检测，于
紫外凝胶成像系统上拍照记录。在保持其他因素一致的条件下，
分别对反应体系各组分设计浓度梯度试验。各组分及其水平如
下:DNA浓度(10、20、30、40、50、60 ng /20μl)，dNTPs 浓度(100、
200、300、400、500、600 μmol /L)，引物浓度(0． 1、0． 2、0． 3、0． 4、
0． 5、0． 6 μmol /L)，Taq 酶用量(0． 5、1． 0、1． 5、2． 0、2． 5、3． 0 U)，
Mg2 +浓度(0． 5、1． 0、1． 5、2． 0、2． 5、3． 0 μmol /L)及循环数(25、
30、35 次)。
2． 3 EST － SSＲ PCＲ反应体系正交试验 在单因素筛选试验的
基础上，采用 L16(4
5)正交设计表，对 DNA模板浓度、dNTPs、引物
浓度、Taq酶用量及 Mg2 +浓度进行 5 因素 4 水平正交试验，正交
试验因素水平和正交设计见表 1 和表 2。反应体系总体积为 20
μl体系，包括 10 × PCＲ Buffer 2 μl，其余组分按表 2 加样，不足体
积 ddH2O补足。扩增产物采用 8%聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)
检测。
表 1 青叶胆 EST － SSＲ反应体系正交设计因素水平表
水平
因素
DNA Template /
ng·(20μl)－ 1
dNTPs /
μmol·L －1
Taq DNA
Polymerase /U
Primer /
μmol·L －1
Mg2 + /
μmol·L －1
1 20 100 0． 5 0． 1 1． 0
2 30150 1． 0 0． 2 1． 5
3 40 200 1． 5 0． 3 2． 0
4 50 250 2． 0 0． 4 2． 5
2． 4 优化体系检测及引物筛选 选用上述实验确定的青叶胆
EST － SSＲ PCＲ最佳反应体系，以小苍窝居群 DNA(S1 ～ S14)为
模板，对 52 对引物进行筛选和稳定性检测。扩增产物用 8%
PAGE检测。
3 结果
3． 1 EST － SSＲ PCＲ反应体系的单因素筛选
3． 1． 1 模板 DNA浓度对 EST － SSＲ PCＲ的影响 从图 1 可以看
出，从 10 ng /20 μl至 50 ng /20 μl，扩增条带亮度随着 DNA 浓度
增加而增大;当浓度高达 60 ng /20μl 时，条带亮度减弱。结合图
示，选用 20 ～ 50 ng /20 μl的 DNA模板浓度进行下一步的正交优
化试验。
表 2 正交实验设计［L16(45)］
编号
因素
DNA Template /
ng·(20μl)－ 1
dNTPs /
μmol·L －1
Taq DNA
Polymerase /U
Primer /
μmol·L －1
Mg2 + /
μmol·L －1
1 20 100 0． 5 0． 1 1． 0
2 20 150 1． 0 0． 2 1． 5
3 20 200 1． 5 0． 3 2． 0
4 20 250 2． 0 0． 4 2． 5
5 30 100 1． 0 0． 3 2． 5
6 30 150 0． 5 0． 4 2． 0
7 30 150 2． 0 0． 1 1． 5
8 30 250 1． 5 0． 2 1． 0
9 40 100 1． 5 0． 4 1． 5
10 40 150 2． 0 0． 3 1． 0
11 40 200 0． 5 0． 2 2． 5
12 40 250 1． 0 0． 1 2． 0
13 50 100 2． 0 0． 2 2． 0
14 50 150 1． 5 0． 1 2． 5
15 50 200 1． 0 0． 4 1． 0
16 50 250 0． 5 0． 3 1． 5
M为 DL2000 Marker，下同。1 ～ 6 DNA浓度分别为
10、20、30、40、50、60 ng /20μl
图 1 不同浓度模板 DNA扩增图
3． 1． 2 dNTPs浓度对 EST － SSＲ PCＲ 的影响 dNTPs 是 PCＲ 反
应的原料，其不同浓度对 PCＲ 扩增的影响如图 2 示:dNTPs 浓度
从 100 μmol /L至 600 μmol /L，扩增条带清晰且各浓度间亮度差
异不大。结合扩增结果及节约试剂考虑，dNTPs 浓度选取 100 ～
250 μmol /L。
1 ～ 6 dNTPs浓度分别为 100、200、300、400、500、600 μmol /L
图 2 不同浓度 dNTPs扩增图
3． 1． 3 Mg2 +浓度对 EST － SSＲ PCＲ的影响 图 3 显示了不同浓
度 Mg2 +对扩增的影响。浓度为 0． 5 μmol /L，扩增条带无;当浓度
从 1． 0 μmol /L 升至 2． 5 μmol /L 时，扩增条带清晰且亮度增强;
而当浓度达 3． 0 μmol /L 时，条带亮度减弱，且产生副带。因此，
Mg2 +浓度选取 1． 0 ～ 2． 5 μmol /L进行下一步正交优化试验。
3． 1． 4 Taq酶用量对 EST － SSＲ PCＲ 的影响 Taq 酶是 PCＲ 反
应中的重要影响因子。如图 4 示，从 0． 5 ～ 1． 5 U，随着酶用量增
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LISHIZHEN MEDICINE AND MATEＲIA MEDICA ＲESEAＲCH 2016 VOL． 27 NO． 11 时珍国医国药 2016 年第 27 卷第 11 期
大，扩增条带逐渐变亮;从 2． 0 ～ 2． 5 U时，扩增条带基本不变;而
当酶用量高达 3． 0 U 时，条带亮度减弱。综合实验结果和成本，
Taq酶用量宜采用 0． 5 ～ 2． 0 U。
1 ～ 6 Mg2 +浓度分别为 0． 5、1． 0、1． 5、2． 0、2． 5、3． 0 μmol /L
图 3 不同浓度 Mg2 +扩增结果
3． 1． 5 引物浓度及循环数对 EST － SSＲ PCＲ的影响 由图 5 知，
在 0． 1 ～ 0． 3 μmol /L范围内，扩增条带亮度随引物浓度增大而增
亮;引物浓度升至 0． 4 ～ 0． 6 μmol /L时，扩增条带亮度减弱、有效
产物量减少，且在 0． 6 μmol /L时出现了副带。7 ～ 9 泳道显示，循
环数为 25 或 30 次时无扩增带，当循环数增加到 35 次时，扩增带
清晰可见。因此，选择的引物浓度为 0． 1 ～ 0． 4 μmol /L，反应循环
数为 35 次。
1 ～ 6Taq酶用量分别为 0． 5、1． 0、1． 5、2． 0、2． 5、3． 0 U
图 4 不同 Taq酶用量扩增结果
1 ～ 6 引物浓度分别为 0． 1、0． 2、0． 3、0． 4、0． 5、0． 6 μmol /L，
7 ～ 9 循环数分别为 25、30、35
图 5 不同引物浓度及循环数扩增结果
3． 2 EST － SSＲ PCＲ反应体系的正交试验 正交设计 EST － SSＲ
反应体系的扩增结果如图 6 示。16 个不同组合中，模板 DNA、
dNTPs、Mg2 +、Taq酶用量及引物其浓度各不相同，扩增效果存在
明显差异。其中，8 号组合无扩增带;2、3、15、16 号组合扩增带较
弱且数量少;1、4、5、6、7 号组合条带较强且数量多但弥散现象严
重;9、10、11、12、13 号组合条带清晰、非特异性条带少但存在引
物二聚体;14 号组合条带清晰且基本无副带。表明第 14 号为最
佳组合，即青叶胆 EST － SSＲ PCＲ最优反应体系为:20 μl反应体
系中含有 50 ng模板 DNA、150 μmol /L dNTPs、0． 1 μmol /L引物、
1． 5 U Taq酶、2． 5 μmol /L Mg2 +及 10 × PCＲ Buffer 2 μl。
3． 3 优化体系检测及引物筛选 在建立了青叶胆 EST － SSＲ
PCＲ最优反应体系的基础上，以小苍窝居群 DNA(S1 ～ S14)为模
板，对 52 对引物进行筛选。有扩增产物的 38 对，其中 10 对条带
清晰、多态性良好，占所有引物的 19． 4%。以引物对 AS96 和 7S
为例，其扩增效果如图 7 所示，条带清晰、无杂带，显示该优化体
系及引物能稳定用于青叶胆 EST － SSＲ分子标记。
M为 DL500 DNA marker，下同。1 － 16 表 2 处理组合编号
图 6 正交设计 EST － SSＲ PCＲ反应体系扩增结果
S1 － S14 为 DNA样
图 7 引物对 As96(A)和引物对 7S(B)对小苍窝 S
亚居群部分个体的扩增图
4 讨论
发展民族医药产业有利于促进少数民族地区经济增长。青
叶胆作为云南特有传统民族药，近年来得到了大力推广，但因无
节制的开发，造成了野外资源匮乏。为保障该产业可持续发展，
保护研究工作势在必行。陈小勇［21］认为，遗传多样性是物种生
存和发展的前提，对濒危物种遗传多样性和群体遗传结构的研究
是揭示其适应潜力的基础，同时，也能确定种群保护与利用的优
先级，为濒危物种有效保护措施的制定提供可靠的依据。利用
EST － SSＲ标记能有效揭示青叶胆遗传多样性，而 EST － SSＲ
PCＲ反应优化体系的建立是高效利用 EST － SSＲ标记的前提。
与高素芳等［22］以单因素试验建立当归试管苗 ISSＲ － PCＲ
体系及唐辉等［23］采用正交设计优化地枫皮 ISSＲ － PCＲ 反应体
系不同，本研究采用单一因素试验和正交试验两种方法，对影响
青叶胆 EST － SSＲ反应体系的模板 DNA浓度、dNTPs 浓度、Mg2 +
浓度、Taq酶用量及引物浓度 5 个主要因素进行试验。利用单因
素试验能简单而准确地确定因素有效水平，及实行多因素联合优
化正交实验设计的均衡分散性和整齐可比性的优点［24］，最终确
立了青叶胆 EST － SSＲ PCＲ 反应的优化体系，并从 52 对引物中
筛选出了 10 对多态性良好的 EST － SSＲ引物。
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时珍国医国药 2016 年第 27 卷第 11 期 LISHIZHEN MEDICINE AND MATEＲIA MEDICA ＲESEAＲCH 2016 VOL． 27 NO． 11
相关研究显示，模板 DNA 及 dNTPs 浓度和 Taq 酶用量会影
响 EST － SSＲ扩增产物的质量和产量［25］。适宜的 DNA模板量是
保证特异性扩增的前提。本研究中 DNA浓度对扩增的影响与刁
松峰等［26］利用正交优化设计建立无患子 ISSＲ － PCＲ 体系得到
的结果不同。dNTPs是 PCＲ扩增的重要底物。本实验得出的最
适 dNTPs浓度为 150 μmol /L，这比张飞等［27］确立的光萼属植物
SSＲ反应体系所需的 200 μmol /L 低。与 dNTPs 不同，不足量的
Taq酶导致合成产物丰度低，而过量的 Taq酶则不利于有效扩增
产物的合成。姜静等［28］对桦树 ISSＲ － PCＲ 反应体系的优化也
得到相似的结果。
Mg2 +通过对 Taq酶活性的影响及与其余底物的结合而对扩
增产生影响:浓度过低，酶活力下降，扩增产物量少;浓度过高的
效应在本研究中并不明显。赵鹏等［25］优化美国黑核桃 SSＲ反应
体系的结果则显示出低浓度的 Mg2 +扩增效果较好。引物也是影
响 PCＲ的重要因素。浓度越大，产物越多，浓度过高则会增加形
成引物二聚体的几率，虽然此中这一现象并不明显，但在周凌瑜
等［29］对优化小苍兰 ISSＲ － PCＲ 反应体系的研究中得到验证。
同时，对循环数的试验结果表明，循环数直接决定 PCＲ 产量，循
环数过低，扩增量不足，这在唐辉等［23］的研究中也得到了很好的
体现。
本实验所建立的 EST － SSＲ PCＲ 反应优化体系为青叶胆遗
传多样性研究、亲缘关系分析及遗传作图等奠定了基础，为其合
理保护措施的制定提供了科学依据，为青叶胆产业的可持续发展
起到重要作用。同时，本研究将现代生物技术引入传统民族药研
究中，从 DNA分子水平为民族医药的研究提供科学依据，极大地
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LISHIZHEN MEDICINE AND MATEＲIA MEDICA ＲESEAＲCH 2016 VOL． 27 NO． 11 时珍国医国药 2016 年第 27 卷第 11 期