全 文 ：HPLC法同时测定金鸡虎补丸中的去氢二异丁香酚、五味子甲素、染
料木素和芒柄花素
陈海燕
(广西卫生职业技术学院，广西 南宁 530023)
收稿日期:2014-07-27
作者简介:陈海燕 (1971—) ，女，硕士，讲师，主要从事药物检验分析和药物化学教研工作。Tel: (0771)5323196，E-mail:chen-
haiyanlunwen@ 163． com
摘要:目的 建立 HPLC法同时测定金鸡虎补丸中去氢二异丁香酚、五味子甲素、染料木素和芒柄花素 4 种成分。方
法 金鸡虎补丸 70%乙醇提取液的分析采用 C18色谱柱 (200 mm ×4. 6 mm，5 μm) ;流动相 A 为乙腈-甲醇 (3 ∶ 2) ，
流动相 B为 0. 1%H3PO4 溶液，梯度洗脱;体积流量为 0. 9 mL /min;去氢二异丁香酚检测波长为 270 nm，五味子甲
素、染料木素和芒柄花素均为 254 nm;柱温为 35 ℃;进样量 20 μL。结果 被测定的 4 组成分色谱峰均有良好的分离
度，方法精密度、重复性的 ＲSD 均小于 2. 0%;在室温条件下 24 h 内稳定;各组分线性范围较宽，线性关系良好
(r≥0. 999 4);平均加样回收率为 96. 8% ～ 98. 1%，ＲSD (n = 6)≤1. 4%。结论 金鸡虎补丸的提取方法和流动相
保证了分析方法的简单易行、重复性好、准确可靠。
关键词:金鸡虎补丸;去氢二异丁香酚;五味子甲素;染料木素;芒柄花素;黑老虎根;鸡血藤
中图分类号:Ｒ927. 2 文献标志码:A 文章编号:1001-1528(2015)03-0538-04
doi:10. 3969 / j． issn． 1001-1528. 2015. 03. 017
Determination of dehydrodiisoeugenol，deoxyschizandrin，genistein and form-
ononetin in Jinji Hubu Pills by HPLC
CHEN Hai-yan
(Guangxi Medical College，Nanning 530023，China)
ABSTＲACT:AIM To develop an HPLC method for simultaneously determining four components，such as de-
hydrodiisoeugenol，deoxyschizandrin，genistein and formononetin in Jinji Hubu Pills． METHODS The chroma-
tograhic separation of 70% ethanolic extract of Jinji Hubu Pills was performed on C18 column (200 mm ×4. 6 mm，
5 μm)． Mobile phase consisted of acetonitrile-methanol (3 ∶ 2) (A)and 0. 1% phosphoric acid solution (B)
were adopted at the flow rate of 0. 9 mL /min． The detection wavelengths were 270 nm for dehydrodiisoeugenol，254
nm for deoxyschizandrin，genistein and formononetin，respectively． The column temperature was 35 ℃ ． The injec-
tion volume was 20 μL． ＲESULTS The four compounds were well separated． The ＲSD values of precision and
reproducibility were all less than 2% ． The stability was good in 24 h． The linear relationship between the concen-
tration and peak areas of the four compounds was all greater than 0. 999 4． The recoveries were 96. 8% － 98. 1%
and ＲSD (n = 6)less than 1. 4% ． CONCLUSION The developed extraction and mobile phase were simple，
sensitive，accurate，and reproducible for Jinji Hubu Pills．
KEY WOＲDS:Jinji Hubu Pills;dehydrodiisoeugenol;deoxyschizandrin;genistein;formononetin;root of Kadsu-
rae Coccineae;Spatholobi caulis
金鸡虎补丸是部颁标准中药处方制剂第一册所
收载的品种，由黑老虎根、鸡血藤、狗脊、牛大
力、骨碎补、大枣、桑寄生 (盐酒制)、金樱子
(盐制)、千斤拔等九味中药加工制成，除去包衣
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显棕色;味甘，微苦涩。具有补气养血、舒筋活
络、健肾固精之功效，对水气凝滞、四肢麻痹、腰
膝酸痛、夜尿频数、梦遗滑精等症状的治疗效果明
显。目前，部颁标准仅对该制剂进行了简单的显微
和显色鉴别，没有对处方中所含药物的任何成分进
行定量分析，很难有效地控制产品的质量和疗
效［1-2］。黑老虎根和鸡血藤为处方中的主要药物，
去氢二异丁香酚和五味子甲素为黑老虎根的主要成
分，芒柄花素和染料木素为鸡血藤的专属性成分，
本实验采用 HPLC梯度洗脱法同时对金鸡虎补丸中
的去氢二异丁香酚、五味子甲素、染料木素［3］和
芒柄花素［3］进行定量测定方法研究，为完善该制
剂质量标准提供依据。
1 实验材料
1. 1 实验仪器 Agilent 1200 高效液相色谱仪、
G1311A 四元泵、G1330B 自动进样器恒温器、
G1322A脱气机、G1315B 可变波长检测器、Chem-
station色谱工作站;XP205 型梅特勒电子天平 (精
度 0. 01 mg)。
1. 2 试药与试剂 去氢二异丁香酚对照品 (批号
111838-201102，纯度 99. 4%)、五味子甲素对照品
(批号 110764-201312，纯度 99. 6%)、染料木素
(批号 111704-201302，纯度 99. 1%)、芒柄花素
(批号 111703-200603，纯度 100%)均购于中国食
品药品检定研究院;金鸡虎补丸 (水蜜丸，每瓶
装 60 g;批 号 分 别 为 201401003、201401004、
201401008)购于李时珍医药集团有限公司;甲
醇、乙腈 (色谱纯，天津市津东天正精细化学试剂
厂);磷酸 (分析纯，广州化学试剂二厂)。
2 试验方法与结果
2. 1 色谱条件 依利特 C18柱 (200 mm ×4. 6 mm，
5 μm) ;流动相 A为乙腈-甲醇 (3 ∶ 2) ，流动相 B
为 0. 1% H3PO4 溶液
［4-10］，梯度洗脱 (0 ～ 8 min，
75. 0%A;8 ～ 21 min，75. 0%→60. 0% A;21 ～ 43
min，60. 0%A;43 ～ 50 min，60. 0%→75. 0% A) ;
检测波长 (0 ～ 16 min，λ1 = 270 nm
［11-13］;16 ～ 50
min，λ2 = 254 nm
［14-15］) ;体积流量 0. 9 mL /min;
柱温为 35 ℃;进样量 20 μL。此系统条件下所测
组分与其他组分分离效果良好，理论塔板数按去氢
二异丁香酚、五味子甲素、染料木素和芒柄花素计
均不得低于 3 000，分离度均大于 1. 5。
2. 2 溶液的制备
2. 2. 1 混合对照品溶液配制 精密称取去氢二异
丁香酚、五味子甲素、染料木素和芒柄花素 4 种对
照品各适量，分别置于 4 个 20 mL 量瓶中，加
70%乙醇溶解并稀释至刻度，配制得去氢二异丁香
酚、五味子甲素、染料木素和芒柄花素质量浓度分
别为 1. 025、0. 698、0. 530、0. 595 mg /mL 的对照
品贮备溶液。再分别精密吸取上述对照品贮备溶液
8、5、1、6 mL置于同一个 50 mL量瓶中，加 70%
乙醇稀释至刻度，摇匀，即得去氢二异丁香酚、五
味子甲素、染料木素与芒柄花素质量浓度分别为
0. 164 0、0. 069 8、0. 010 6、0. 071 4 mg /mL 的混
合对照品溶液。
2. 2. 2 供试品溶液的制备 取本品适量，除去包
衣，研细，混匀，取 5. 0 g，精密称定，精密加入
70%乙醇 50 mL，称定质量，超声处理 30 min，取
出，放冷，再称定质量，用 70%乙醇补足减失的
质量，摇匀，过滤，取续滤液作为供试品溶液。
2. 2. 3 阴性对照溶液的制备 按金鸡虎补丸处方
比例称取除黑老虎根的其余药味和除鸡血藤的其余
药味各一份，按金鸡虎补丸的制备工艺分别制成黑
老虎根空白样品和鸡血藤空白样品，按照
“2. 2. 2”项下供试品溶液的制备方法制成黑老虎
根空白溶液和鸡血藤空白溶液。
2. 3 专属性试验 分别精密吸取混合对照品溶液、
供试品溶液、黑老虎根空白溶液及鸡血藤空白溶液
各 20 μL，进行分析，结果见图 1。供试品溶液中
各待测成分色谱峰的分离度均大于 1. 5，而空白溶
液色谱图在相应位置处未见色谱峰。
2. 4 线性关系考察 分别精密吸取 “2. 2. 1”项
下各对照品贮备溶液 0. 1、0. 2、0. 5、1. 0、2. 0
mL，分别置于 5 个 10 mL 量瓶中，加 70%乙醇稀
释至刻度，摇匀。按 “2. 1”项下色谱条件进行分
析测定，以峰面积 Y 与对照品质量浓度 X 线性回
归，得去氢二异丁香酚回归方程为:Y = 2. 036 1 ×
104X － 311. 7，r = 0. 999 9，线性范围为 10. 25 ～
205. 00 μg /mL;五味子甲素 Y = 5. 974 2 × 103X +
233. 5，r = 0. 999 4，线性范围为 6. 98 ～ 139. 60
μg /mL;染料木素 Y = 8. 286 4 × 103X + 307. 7，r =
0. 999 5，线性范围为 5. 30 ～ 106. 00 μg /mL;芒柄
花素 Y = 1. 276 5 × 104X － 501. 4，r = 0. 999 7，线
性范围为 5. 95 ～ 119. 00 μg /mL。结果表明:去氢
二异丁香酚、五味子甲素、染料木素和芒柄花素在
各自的线性范围内，所测组分质量浓度与峰面积线
性关系良好。
2. 5 精密度试验 取混合对照品溶液，在 “2. 1”
项下色谱条件，连续进样 6 次，分别测得 4 种成分
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1． 去氢二异丁香酚 2． 五味子甲素 3． 染料木素 4． 芒柄花素 A． 对照品 B． 样品 C． 黑老虎根空白溶液 D． 鸡血藤空白溶液
1． dehydrodiisoeugenol 2． deoxyschizandrin 3． genistein 4． formononetin A． reference substance B． sample C． sample without radix of
Kadsurae Coccineae D． sample without Spatholobi Caulis
图 1 去氢二异丁香酚、五味子甲素、染料木素和芒柄花素的 HPLC
Fig． 1 HPLC of dehydrodiisoeμgenol，deoxyschizandrin，genistein and formononetin
的峰面积，计算各成分相对标准偏差，去氢二异丁
香酚、五味子甲素、染料木素和芒柄花素 ＲSD 分
别为 0. 6%、0. 8%、0. 9%、0. 4%。结果表明，
仪器精密度良好。
2. 6 重复性试验 称取同一批号供试品，按
“2. 2. 2”项下供试品溶液制备方法制备 6 份供试
品溶液，按照 “2. 1”项下色谱条件依法进样测
定，记录各组分峰面积，计算相对标准偏差，结果
去氢二异丁香酚、五味子甲素、染料木素和芒柄花
素的 ＲSD 分别为 0. 5%、0. 8%、0. 7%和 0. 4%。
表明本法测定重复性良好。
2. 7 溶液的稳定性试验 精密吸取同一供试品溶
液，在室温下放置 0、2、4、8、12、24 h 后，每
次进样 20 μL，测定其峰面积值，结果去氢二异丁
香酚、五味子甲素、染料木素和芒柄花素的 ＲSD
分别为 0. 7%、1. 0%、0. 8%、0. 6%。表明供试
品溶液 24 h内稳定性良好。
2. 8 加样回收率试验 取已知含有量的同一批金
鸡虎补丸 (去氢二异丁香酚为 1. 569 mg /g、五味
子甲素为 0. 681 mg /g，染料木素为 0. 132 mg /g，
芒柄花素为 0. 716 mg /g)2. 5 g，精密称定，精密
加入混合对照品溶液 25 mL、70%乙醇 25 mL，称
定质量，超声波超声处理 30 min，取出，放冷，再
称定质量，用 70%乙醇补足减失的质量，摇匀，
过滤，取续滤液作为加样供试品试液。按 “2. 1”
项下色谱条件进样测定，计算各组分回收率，结果
见表 1。
表 1 回收率试验结果
Tab. 1 Ｒesults of recovery tests
称样量 /
g
样品中量 /
mg
加入量 /
mg
测得量
/mg
回收率
/%
平均值
/%
ＲSD
/%
去氢二异
丁香酚
五味子甲
素
染料木素
芒柄花素
2. 501 6 3. 925 4. 100 7. 986 99. 1 98. 1 1. 3
2. 496 4 3. 917 4. 100 7. 892 97. 0
2. 498 7 3. 920 4. 100 8. 017 99. 9
2. 502 2 3. 926 4. 100 7. 882 96. 5
2. 503 1 3. 927 4. 100 7. 936 97. 8
2. 507 6 3. 934 4. 100 7. 969 98. 4
2. 501 6 1. 704 1. 745 3. 448 99. 9 97. 6 1. 4
2. 496 4 1. 700 1. 745 3. 391 96. 9
2. 498 7 1. 702 1. 745 3. 386 96. 5
2. 502 2 1. 704 1. 745 3. 422 98. 5
2. 503 1 1. 705 1. 745 3. 384 96. 2
2. 507 6 1. 708 1. 745 3. 412 97. 7
2. 501 6 0. 330 2 0. 265 0 0. 587 6 97. 1 96. 8 0. 8
2. 496 4 0. 329 5 0. 265 0 0. 584 1 96. 1
2. 498 7 0. 329 8 0. 265 0 0. 586 5 96. 9
2. 502 2 0. 330 3 0. 265 0 0. 590 4 98. 2
2. 503 1 0. 330 4 0. 265 0 0. 585 1 96. 1
2. 507 6 0. 331 0 0. 265 0 0. 587 2 96. 7
2. 501 6 1. 791 1. 785 3. 512 96. 4 97. 9 1. 1
2. 496 4 1. 787 1. 785 3. 534 97. 9
2. 498 7 1. 789 1. 785 3. 549 98. 6
2. 502 2 1. 792 1. 785 3. 522 96. 9
2. 503 1 1. 792 1. 785 3. 567 99. 4
2. 507 6 1. 795 1. 785 3. 551 98. 4
2. 9 样品测定 取 3 个批号的样品，按 “2. 2. 2”
项下供试品制备方法，按 “2. 1”项下色谱条件测
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定本品中去氢二异丁香酚、五味子甲素、染料木素
和芒柄花素，结果见表 2。
表 2 样品测定结果 (mg·g －1，x ± s，n =3)
Tab. 2 Ｒesults of content determination (mg·g －1，x ±
s，n =3)
批 号 去氢二异丁香酚 五味子甲素 染料木素 芒柄花素
201401003 1. 569 ± 0. 012 0. 681 ± 0. 005 0. 132 ± 0. 001 0. 716 ± 0. 007
201401004 1. 572 ± 0. 016 0. 697 ± 0. 007 0. 129 ± 0. 001 0. 707 ± 0. 004
201401008 1. 491 ± 0. 009 0. 674 ± 0. 003 0. 141 ± 0. 001 0. 725 ± 0. 006
3 讨论
3. 1 色谱条件的选择 本实验考察了流动相乙腈-
0. 1% H3PO4 溶液、甲醇-0. 1% H3PO4 溶液、乙腈-
甲醇 (3 ∶ 2)与 0. 1%H3PO4 溶液不同比例进行梯
度洗脱，结果以乙腈-0. 1% H3PO4 溶液为流动相梯
度洗脱时染料木素和芒柄花素峰型对称，但五味子
甲素与前一峰达不到分离;以甲醇-0. 1% H3PO4 溶
液为流动相梯度洗脱时染料木素峰型不对称，拖尾
现象严重;而以乙腈-甲醇 (3 ∶ 2)与 0. 1% H3PO4
溶液不同比例进行梯度洗脱时，所测 4 个组分均能
达到基线分离，各组分峰型对称。
3. 2 超声提取时间的选择 在供试品制备过程中，
曾分别考察超声提取 10 min、30 min、60 min，结
果表明超声提取 30 min 和超声提取 60 min，所测
得各组分的量差别不大，而超声提取 10 min 所测
得成分量明显较低。故选取超声提取 30 min 作为
供试品制备的超声提取时间。
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