全 文 ：中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 45 卷 第 15 期 2014 年 8 月

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正交试验结合指纹图谱优选补骨脂-肉豆蔻药对醇提工艺
杨晓旭 1，高家荣 1, 2*，韩燕全 1, 2，庄星星 1，魏良兵 2
1. 安徽中医药大学药学院，安徽 合肥 230038
2. 安徽中医药大学第一附属医院，国家中医药管理局中药制剂三级实验室，安徽 合肥 230031
摘 要：目的 优选补骨脂-肉豆蔻药对醇提的最佳工艺条件。方法 通过 L9(34) 正交试验设计，考察乙醇体积分数、乙醇
用量、提取时间、提取次数对提取工艺的影响，以 HPLC 指纹图谱特征峰总面积与补骨脂素、异补骨脂素、去氢二异丁香
酚的量以及干浸膏得率为综合评判指标。结果 最佳醇提工艺为乙醇体积分数 50%，乙醇 6 倍用量，每次提取 2 h，提取 3
次。结论 本法为补骨脂-肉豆蔻药对醇提工艺的确定提供了依据。
关键词：补骨脂-肉豆蔻药对；醇提工艺；正交试验；HPLC；指纹图谱；特征峰总面积；补骨脂素；异补骨脂素；去氢二异
丁香酚
中图分类号：R284.2 文献标志码：A 文章编号：0253 - 2670(2014)15 - 2178 - 06
DOI: 10.7501/j.issn.0253-2670.2014.15.011
Optimization of ethanol extraction process of Psoraleae Fructus-Myristicae
Semen drug pair by orthogonal test combined with fingerprint
YANG Xiao-xu1, GAO Jia-rong1, 2, HAN Yan-quan1, 2, ZHUANG Xing-xing1, WEI Liang-bing2
1. College of Pharmacy, Anhui University of Chinese Medicine, Hefei 230038, China
2. State Administration of Chinese Medicine Preparation Three Laboratories First Affiliated Hospital of Anhui University of
Chinese Medicine, Hefei 230031, China
Abstract: Objective To optimize the ethanol extraction process of Psoraleae Fructus-Myristicae Semen (psoralen-nutmeg) drug
pair. Methods Using L9(34) orthogonal design, the effects of ethanol concentration, ethanol amount, extraction time, and extraction
times on the extraction process were investigated. The contents of psoralen, isopsoralen, and dehydrodiisoeugenol, dry extract yield,
and total area of HPLC fingerprint characteristic peaks were used as comprehensive evaluation indexes. Results The optimum
process conditions were as follows: 50% ethanol, six times of the ethanol volume, extracted for three times, each time for 2 h.
Conclusion The method provides the basis for the determination of ethanol extraction process of Psoraleae Fructus-Myristicae
Semen drug pair.
Key words: Psoraleae Fructus-Myristicae Semen drug pair; ethanol extraction process; orthogonal test; HPLC; fingerprint; total area
of characteristic peak; psoralen; isopsoralen; dehydrodiisoeugenol

补骨脂与肉豆蔻作为温肾暖脾，涩肠止泻药对
配伍，最早出自宋•许叔微的《普济本事方》，时称
“二神丸”（补骨脂、肉豆蔻 2 药为主，大枣、生姜
为辅）[1]。补骨脂、肉豆蔻药对自建方始，其主证
为全不进食，病位在脾肾二脏，病因病机为“肾气
怯弱，真元衰劣，自是不能消化饮食……”。中药是
典型的复杂体系，具有多组分与多靶点的特点，在
目前对其临床疗效了解较多而作用机制尚未完全明
了的情况下，单独依靠一两个指标化合物的定量测
定来评价中药的提取工艺是不全面的，中药指纹图
谱是目前公认的一种综合的、可量化的质量控制手
段，可用于掌握中药多成分的信息。补骨脂素、异
补骨脂素均为补骨脂的有效成分，去氢二异丁香酚
为肉豆蔻的有效成分。参考相关文献资料[2-4]，本研
究以 HPLC 指纹图谱特征峰面积、补骨脂素、异补
骨脂素及去氢二异丁香酚的量以及干浸膏得率为指

收稿日期：2014-03-10
基金项目：国家中医药重点学科临床中药学建设项目（国中医药人教发 [2012] 32 号）
作者简介：杨晓旭（1989—），女，安徽合肥人，硕士研究生，从事中药新药研发。Tel: 13485710609 E-mail: 983801319@qq.com
*通信作者 高家荣 E-mail: zyfygjr2006@163.com
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标，采用正交试验法优选补骨脂-肉豆蔻药对的醇提
工艺。
1 仪器与材料
Agilent 1260 高效液相色谱仪，DAD 检测器，
二元高压梯度泵，柱温箱，美国安捷伦公司；RE—
852 旋转蒸发器，巩义市峪予华仪器厂；HH—S 型
电热恒温水浴锅，江苏省医疗器械厂；TF—18 通风
橱；KMD 型调温电热套，金坛市荣华仪器制造有
限公司；BP211D 电子分析天平，德国赛多利斯公
司；D2F—6020 真空干燥箱，上海博讯医疗设备厂；
KQ3200B 型超声波清洗器，昆山市超声仪器厂；
101A—S1 型数显电热鼓风干燥箱，上海浦东荣丰
科学仪器有限公司。
对照品补骨脂素（批号 110739-201115）、异补
骨脂素（批号 110738-201012）、去氢二异丁香酚（批
号 111838-201001）均购于中国食品药品检定研究
院，上述对照品质量分数均≥99.3%，均为定量测
定用；中药饮片均由安徽中医药大学第一附属医院
中药房提供，经安徽中医药大学第一附属医院李立
华主任药师鉴定，分别为豆科植物补骨脂 Psoralea
corylifolia L. 的干燥成熟果实、肉豆蔻科植物肉豆
蔻 Myristica fragrans Houtt. 的干燥种仁。0.22 μm
微孔滤膜，上海陆纳生物科技有限公司；甲醇，色
谱纯，美国 Tedia 公司；水为屈臣氏蒸馏水；其余
试剂均为分析纯。
2 方法与结果
2.1 供试品溶液的制备
称取本药对药材 9 份，每份称取补骨脂 24 g、
肉豆蔻 12 g，按表 1 所列条件制备样品，所得提取
液浓缩定容至 50 mL 量瓶中，精密吸取醇提浓缩液
各 5 mL 分别置蒸发皿中，水浴蒸干，残渣加甲醇
溶解，分别转移至 10 mL 量瓶中，甲醇定容，超声
30 min，分别编号为供试品溶液 1～9 号，0.22 μm
微孔滤膜滤过，即得。
2.2 对照品溶液的制备
精密称取补骨脂素、异补骨脂素、去氢二异丁
香酚对照品适量，分别加甲醇配制成含补骨脂素
0.109 mg/mL、异补骨脂素 0.112 mg/mL、去氢二异
丁香酚 0.042 mg/mL 的对照品溶液。
2.3 补骨脂素、异补骨脂素定量测定
2.3.1 色谱条件 Welch material Inc C18 色谱柱
（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相为甲醇-水（50∶
50）；体积流量 1.0 mL/min；柱温 30 ℃；检测波长
为 246 nm[7]。HPLC 色谱图见图 1。
2.3.2 阴性对照溶液的制备 根据药对组成，取肉
豆蔻药材，按“2.2”项下方法制得阴性对照溶液。
2.3.3 线性关系的考察 自动进样对照品溶液各
1、2、4、8、12、16 μL，以色谱峰峰面积为纵坐标
（Y），进样量为横坐标（X），绘制标准曲线并进行
线性回归。补骨脂素回归方程 Y＝767.94 X－13.07，
r＝0.999 9；异补骨脂素回归方程 Y＝831.23 X－
21.87，r＝0.999 9；结果表明，补骨脂素、异补骨
脂素分别在 0.109～1.744、0.112～1.792 μg 呈良好
的线性关系。
2.3.4 样品测定 分别精密吸取对照品溶液、供试
品溶液各 5 μL，注入高效液相色谱仪进行测定，计
算补骨脂素、异补骨脂素的量。
2.4 去氢二异丁香酚的测定
2.4.1 色谱条件 Agilent Edipse Plus C18 色谱柱
（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相为甲醇-水（75∶
25）；体积流量 1.0 mL/min；柱温 30 ℃；检测波长
为 274 nm。HPLC 色谱图见图 2。



1-补骨脂素 2-异补骨脂素
1-psoralen 2-isopsoralen

图 1 阴性对照 (A)、混合对照品 (B) 和补骨脂-肉豆蔻药对 (C) 的 HPLC 图
Fig. 1 HPLC of negative sample (A), mixed reference substances (B), and Psoraleae Fructus-Myristicae Semen drug pair (C)
1 2
1
2
A B C
0 5 10 15 20 0 5 10 15 20 0 5 10 15 20
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图 2 阴性对照 (A)、去氢二异丁香酚对照品 (B) 和补骨脂-肉豆蔻药对 (C) 的 HPLC 图
Fig. 2 HPLC of negative sample (A), dehydrodiisoeugenol reference substance (B),
and Psoraleae Fructus-Myristicae Semen drug pair (C)

2.4.2 阴性对照溶液的制备 根据药对的组成，
取补骨脂药材，按“2.2”项下方法制得阴性对照
溶液。
2.4.3 线性关系的考察 自动进样对照品溶液各 2、
4、8、16、24、28 μL，以色谱峰峰面积为纵坐标（Y），
进样量为横坐标（X），绘制标准曲线并进行线性回
归。去氢二异丁香酚回归方程 Y＝169.07 X＋18.85，
r＝0.999 9；结果表明，去氢二异丁香酚在 0.084～
1.176 μg 呈良好的线性关系。
2.4.4 样品测定 分别精密吸取对照品溶液、供试
品溶液各 5 μL，注入高效液相色谱仪进行测定，计
算去氢二异丁香酚的量。
2.5 指纹图谱
2.5.1 色谱条件 Welch material Inc C18 色谱柱
（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相为甲醇-水，采
用梯度洗脱：0～15 min，50%甲醇；15～85 min，
50%～90%甲醇；85～90 min，90%～50%甲醇；90～
95 min，50%甲醇；体积流量 1.0 mL/min；进样量 5
μL；柱温 30 ℃；检测波长为 234 nm。
2.5.2 方法学考察
（1）精密度试验：取 1 号供试品，分别按“2.6.1”
项下色谱条件连续进样 6 次，测得各共有峰相对保
留时间和相对峰面积的RSD分别在0.05%～0.32%、
0.63%～1.55%，均符合指纹图谱的技术要求，表明
仪器精密度良好。
（2）稳定性试验：取 1 号供试品分别按“2.6.1”
项下色谱条件在 0、4、8、12、24 h 进样测定，测
得各共有峰相对保留时间和相对峰面积的 RSD 分
别在 0.12%～0.60%、0.13%～2.02%，均符合指纹
图谱的技术要求，表明稳定性良好。
（3）重复性试验：取补骨脂、肉豆蔻药材，按
“2.2”项下方法平行制备 1 号供试品 6 份，分别按
“2.6.1”项下色谱条件操作，测得各共有峰相对保留
时间和相对峰面积的 RSD 分别在 0.41%～1.78%、
0.83%～2.45%，均符合指纹图谱的技术要求，表明
此方法重复性良好。
2.5.3 测定法 取“2.2”项下处理的 1～9 号供试
品液，按“2.5.1”项下色谱条件测定，记录色谱图。
2.6 干浸膏得率的测定
取正交试验提取液，摇匀，分别精密量取 1～9
号浓缩液 20 mL，置于对应干燥至恒定质量的蒸发
皿中，在水浴上蒸干后，于 105 ℃干燥 3 h，至干
燥器中冷却 30 min，迅速精密称定质量，计算提取
液的总浸膏量。
2.7 正交试验法
正交试验设计根据相关文献报道[5-6]和预试验。
以乙醇体积分数（A）、乙醇用量（B）、提取时间（C）、
提取次数（D）为考察因素，以 HPLC 指纹图谱特
征峰总面积和补骨脂素、异补骨脂素、去氢二异丁
香酚质量浓度以及干浸膏得率为指标，在平行操作
条件下，按 L9(34) 正交表进行试验，优选醇提最佳
工艺条件。各因素水平见表 1。试验安排及结果见
表 2。HPLC 指纹图谱见图 3，确定了 14 个特征峰。
将指纹图谱中的特征峰面积之和进行统计，结果见
表 3。

表 1 正交试验因素水平
Table 1 Factors and levels of orthogonal test
水平 A / % B / 倍 C / h D / 次
1 50 6 1.0 1
2 60 8 1.5 2
3 70 10 2.0 3

指标数据进行加权评分方法，综合评分＝补骨
脂素质量分数评分＋异补骨脂素质量分数评分＋去
氢二异丁香酚质量分数评分＋干膏得率评分＋总峰
面积。
去氢二异丁香酚 去氢二异丁香酚
0 5 10 15 20 25 0 5 10 15 20 25 0 5 10 15 20 25
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补骨脂素质量分数评分＝补骨脂素质量分数/最大补骨
脂素质量分数×100×0.05
异补骨脂素质量分数评分＝异补骨脂素质量分数/最大
异补骨脂素质量分数×100×0.05
去氢二异丁香酚质量分数评分＝去氢二异丁香酚质量
分数/最大去氢二异丁香酚质量分数×100×0.05
干膏得率评分＝干膏得率 /最大干膏得率×100×
0.25
总峰面积评分＝总峰面积/最大总峰面积×100×0.6
2.8 正交试验结果的分析
以多指标实验公式法统计分析 P 值为考察指
标，由表 2 中极差 R 值大小显示，各因素作用主次
为 A＞D＞B＞C；由表 4 中方差分析结果表明：因
素 A 具有显著性差异，由表 4 可知 B、C、D 3 因
素差异无统计学意义，为降低乙醇消耗和指标成分
尽量提取充分，综合评判最佳提取工艺以 A1B1C3D3
组合为佳，即最佳工艺条件为乙醇体积分数 50%，
乙醇 6 倍用量，每次提取 2 h，提取 3 次。

表 2 正交试验各指标测定值及加权综合评分与极差分析结果
Table 2 Estimated values weighted composite score, and range analysis of each index in orthogonal test
质量浓度 / (mg·mL−1) 试验号 A B C D
补骨脂素 异补骨脂素 去氢二异丁香酚
干膏得率 / % 总峰面积 综合评分
1 1 1 1 1 0.204 5 0.150 7 0.118 7 9.94 99 080.93 68.24
2 1 2 2 2 0.198 3 0.147 6 0.136 1 11.86 99 496.75 71.07
3 1 3 3 3 0.253 4 0.191 9 0.227 4 19.46 99 896.95 100.00
4 2 1 2 3 0.196 4 0.157 2 0.159 9 13.53 105 862.35 76.82
5 2 2 3 1 0.149 3 0.120 8 0.098 9 10.27 73 336.18 54.66
6 2 3 1 2 0.193 5 0.145 7 0.144 0 10.01 106 627.50 71.88
7 3 1 3 2 0.135 5 0.095 3 0.047 7 6.52 72 216.09 47.30
8 3 2 1 3 0.123 5 0.093 3 0.088 3 10.72 51 297.23 43.83
9 3 3 2 1 0.039 6 0.030 5 0.029 8 12.58 23 287.07 28.95
K1 79.770 64.120 61.317 50.617
K2 67.787 56.520 58.947 63.417
K3 40.027 66.943 67.320 73.550

R 39.743 10.423 8.373 22.933



1-补骨脂素 2-异补骨脂素 9-去氢二异丁香酚
1-psoralen 2-isopsoralen 9-dehydrodiisoeugenol

图 3 醇提制备工艺补骨脂-肉豆蔻药对 HPLC 指纹图谱
Fig. 3 HPLC fingerprint of Psoraleae Fructus-Myristicae Semen drug pair using ethanol extract preparation
1 2 3 4 5 6 7
8
9
10
0 13.77 27.54 41.31 55.08 68.85 82.63 96.40
t / min
11 1312
14
R
S9
S8
S7
S6
S5
S4
S3
S2
S1
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表 3 补骨脂-肉豆蔻药对不同提取物指纹图谱特征峰面积统计
Table 3 Area of characteristic peaks in fingerprint of different extracts in Psoraleae Fructus-Myristicae Semen drug pair
样品峰面积
共有峰
1 2 3 4 5 6 7 8 9
1 5 933.27 5 649.67 7 297.65 5 888.06 4 181.81 5 361.44 3 918.60 3 365.74 1 118.92
2 3 750.81 3 077.95 4 022.55 3 122.22 2 680.65 2 894.64 2 045.03 1 808.51 585.26
3 980.04 1 108.99 1 210.43 1 100.43 740.74 1 062.11 179.48 744.60 322.20
4 972.41 984.64 1 311.73 1 045.52 738.77 865.42 628.36 637.26 226.60
5 1 004.68 849.36 1 136.22 1 403.37 924.87 1 189.59 1 515.08 1 387.60 389.54
6 1 646.44 2 231.08 3 437.83 2 371.54 1 429.98 2 563.46 235.87 1 403.65 338.78
7 8 283.95 7 033.78 9 417.84 7 144.25 5 201.29 7 463.46 5 599.73 4 693.76 1 822.33
8 13 839.47 12 107.78 18 407.49 14 582.43 8 658.15 13 105.38 9 468.01 7 442.97 2 872.45
9 2 785.20 2 205.92 3 765.88 2 952.39 1 507.67 2 732.20 2 372.98 1 423.70 486.89
10 28 596.13 27 618.93 3 627.00 28 215.79 20 350.34 30 060.03 21 662.87 18 684.44 6 636.36
11 4 038.19 6 440.79 6 282.36 5 510.94 4 145.34 5 165.14 3 603.78 3 907.29 1 598.71
12 5 164.16 5 192.27 6 632.43 5 210.20 3 725.48 5 523.35 3 785.01 297.60 1 175.28
13 1 324.03 1 393.74 1 801.54 1 476.09 1 041.44 1 403.60 806.27 767.48 244.17
14 20 761.91 23 601.85 31 546.00 25 839.12 18 009.65 27 237.68 17 895.05 1 732.64 5 469.59
总峰面积 99 080.93 99 496.75 99 896.95 105 862.35 73 336.18 106 627.50 72 216.09 51 297.23 23 287.07

表 4 方差分析
Table 4 Analysis of variance
因素 偏差平方和 自由度 F 值 显著性
A 2 493.750 2 22.336 P＜0.05
B 174.377 2 1.560
C 111.770 2 1.000
D 792.462 2 7.096
误差 3 572.360 8
F0.05(2, 2) = 19.00 F0.01(2, 2) = 99.00
2.9 验证试验
为了验证上述结果的准确性，保证提取工艺的
合理可行，按已确定的最佳提取工艺条件进行 3 次
重复实验，结果提取液中补骨脂素质量浓度分别为
0.238 0、0.239 5、0.242 5 mg/mL；异补骨脂素质量
浓度分别为 0.184 0、0.190 2、0.182 6 mg/mL；去氢
二异丁香酚质量浓度分别为 0.213 4、0.210 9、0.226 0
mg/mL；干膏得率分别为 17.53%、17.40%、17.66%，
总峰面积分别为 130 085.80、129 855.70、129 625.60，
该工艺的综合评分为 95.6%。实验证明，优化的提
取工艺方法稳定可靠，合理可行，具重复性和可操
作性。
3 讨论
在多指标综合评定优化提取工艺过程中，根据
各指标在工艺提取选择中的地位，给予不同的加权
系数。处理数据采用加权综合评分法，由于补骨脂
素、异补骨脂素、去氢二异丁香酚在总面积峰中均
有体现，故采用较小的加权比重。
吸取上述药对样品溶液 5 μL 进样，利用 DAD
检测器进行全波段扫描检测分析，结果表明，该样
品分别在 225、234、265、274 nm 检测处都有比较
显著的特征色谱峰，其中又以 234 nm 为检测波长
时所得色谱图指纹信息最多，各色谱峰分离度较好，
色谱峰的形状也好。因此，本实验选取 234 nm 作
为检测波长。
本实验以总峰面积为指标既能体现中药复方多
成分、多靶点的特点，又能降低单一或多个成分作
为指标引起的实验误差。采用正交试验结合 HPLC
指纹图谱法优选补骨脂-肉豆蔻药对醇提工艺，从多
方面、多指标对醇提工艺进行整体评价，较单独正
交试验优选工艺更具科学性，但特征峰所对应成分
的药效作用尚未建立相关性联系，在未来工作中，
有待于结合先进的药效组分提取与检测手段及药效
学想法追踪该药对的药物活性成分，进一步确定该
药对的活性成分[8-9]。
药对是联系中药和方剂的桥梁，中药药对的现
代研究包括：药对功效的研究、药对成分的研究、
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药对剂量配比的研究、药对在全方中的作用研究。
本实验则为药对成分研究初步奠定基础。
参考文献
[1] 王 缙, 付庆会. 宋明期间二神丸和五味子散两方的
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