全 文 ：［收稿日期］ 20110323(001)
［基金项目］ 国家重大新药创制项目(2009ZX09308-001-1-6)
［第一作者］ 王聪，硕士研究生，从事中药质量控制方法研究，
E-mail:wangcong1987． cool@ 163． com
［通讯作者］ * 张宏桂，教授，博士生导师，从事中药有效成分
及中 药 质 量 控 制 方 法 研 究，E-mail:bzy714
@ 163. com
* 张建伟，女，教授，从事天然产物合成，E-mail:
jwzhang2005@ 163． com
肉豆蔻对照品去氢二异丁香酚制备工艺
王聪1，孟晓伟1，刘永刚1，张建伟2* ，张宏桂1*
(1. 北京中医药大学 中药学院，北京 100102;
2. 首都医科大学 化学生物学及药学院，北京 100069)
［摘要］ 目的:优化制备去氢二异丁香酚中药化学对照品的工艺。方法:以去氢二异丁香酚提取率为考察指标，在单因
素试验的基础上，通过 L9(3
4) 正交试验确定最佳提取条件并放大到中试量。结果:采用 80%乙醇，料液比 10∶ 1回流提取药材
2 次，每次 2 h，提取物经无水乙醇、乙酸乙酯萃取后，经硅胶柱层析、重结晶，获得 9 g 对照品。结论:本工艺高效、简便、低成
本，适用于去氢二异丁香酚对照品的制备。
［关键词］ 去氢二异丁香酚; 对照品; 肉豆蔻
［中图分类号］ R284． 1 ［文献标识码］ A ［文章编号］ 1005-9903(2012)04-0074-05
Preparation Process of Dehydrodiisoeugenol in Myristica fragrans
WANG Cong1，MENG Xiao-wei1，LIU Yong-gang1，ZHANG Jian-wei2* ，ZHANG Hong-gui1*
(1. School of Chinsese Materia Medica，Beijing University of Chinese Medicine，Beijing 100102，China;
2. School of Chemical Biology and Pharmaceutical Sciences，Capital Medical University，Beijing 100069，China)
［Abstract］ Objective:To optimize the process of preparing dehydrodiisoeugenol chemical reference
substance． Method: Taking extract rate of dehydrodiisoeugenol as index， the best extraction condition of
dehydrodiisoeug-enol was determined by single factor test and orthogonal test L9(3
4) ，which was scaled up to pilot
volume． Result:Raw material was extracted with 80% ethanol at a 10∶ 1 solid-liquid ratio for twice and 2 h each
time，the yielded extract was first seperated by extraction with absolute ethyl alcohol、acetyl acetate． Afer this，by
the methods of silicagel column chromatography and recrystallization we produce 9 g of reference substance was
producued． Conclusion:The process is effective，simple and economic，and can meet the need of gram-size
preparation．
［Key words］ dehydrodiisoeugenol;reference substance;Myristica fragrans
肉豆蔻为肉豆蔻科植物肉豆蔻除去假种皮的成
熟干燥种仁，分布于马来西亚、印度尼西亚、西印度
群岛和斯里兰卡等地，我国台湾、广东、云南等地引
种栽培［1］。肉豆蔻具有温中行气，涩肠止泻之功。
2010 年版《中国药典》一部［2］，在“肉豆蔻”项下新
增了去氢二异丁香酚的含量作为评价肉豆蔻质量的
标准之一，规定肉豆蔻原药材按“干燥品计算，含去
氢二异丁香酚(C20H22 O4) 不得少于0. 10%”。因而
去氢二异丁香酚就成为新增的含量测定用中药化学
对照品，但是关于该成分的提取工艺研究尚未见报
道，制备工艺虽有文献报道，但都基于系统分离，针
对性不强。本文从提取和分离工艺上，对去氢二异
丁香酚克级制备工艺进行了研究。
1 材料
1. 1 仪器 (Waters 1525 Binary HPLC Pump，Waters
2489UV /Visible Detector，WatersBreeze 2 systerm，25 μL
微量进样针(SGE 公司) ;B-220 型恒温水浴锅( 上
海亚荣生化仪器厂) ;KQ5200E 型超声仪( 昆山市超
声仪器有限公司) ;高速万能粉碎机( 天津泰斯特仪
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第 18 卷第 4 期
2012 年 2 月
中国实验方剂学杂志
Chinese Journal of Experimental Traditional Medical Formulae
Vol． 18，No． 4
Feb．，2012
DOI:10.13422/j.cnki.syfjx.2012.04.028
器有限公司) ;TN-200 提取罐( 浙江瑞安天众医药设
备有限责任公司) ;TD 低温微型提取浓缩机组( 瑞
安天众医药化工机械公司)。
1. 2 材料 药材肉豆蔻购自河北安国，经北京中
医药大学中药鉴定系张贵君教授鉴定为肉豆蔻科植
物肉豆蔻 Myristica fragrans Houtt． 除去假种皮的成
熟干燥种仁。去氢二异丁香酚对照品由北京大学药
学院杨秀伟教授友情提供。按 2010 年版《中国药
典》要求进行 HPLC 检测，在规定波长下，含量按峰
面 积 归 一 化 法 计 算 ＞ 98. 0%。色 谱 纯 甲 醇
(CALIPURE 进口分装) ，娃哈哈纯净水 ( 杭州娃哈
哈集团) ，乙醇、石油醚、乙酸乙酯、丙酮等试剂均为
分析纯。
2 方法和结果
2. 1 含量测定方法的建立 本研究需制备 10 g 左
右的去氢二异丁香酚，药材需求量大，实验室中的小
型提取装置无法满足要求，因而本文使用了中试规
模的 TD 型中药提取装置 ( 单批最大处理量20 kg)
提取药材。相应地，样品的处理也尽量模拟中试的
提取条件，以更准确地评价不同提取工艺优劣。
2. 1. 1 色 谱 条 件 COSMOSIL Packed Column
l5C18 -AR-Ⅱ(4. 6 mm × 250 mm，5 μm) ，流动相为
甲醇-0. 05%磷酸(70∶ 30) ，检测波长为274 nm，柱
温为 30 ℃，流速为 1. 0 mL·min － 1，进样量 20 μL，
见图 1。
1. 去氢二异丁香酚
图 1 去氢二异丁香酚(A) 和样品(B)HPLC
2. 1. 2 供试品溶液的制备 取肉豆蔻粉末( 过20
目筛)10 g，精密称定，置 250 mL 圆底烧瓶中，精密
加入乙醇 100 mL，称定质量，加热回流 1 h，取出，称
定质量，用乙醇补足减失的质量，摇匀，滤过，精密
量取续滤液 10 mL，置 50 mL 量瓶中，甲醇定容至 50
mL，过 0. 45 μm 滤膜，即得供试品溶液。
2. 1. 3 线性关系的考察 精密称定去氢二异丁香
酚对照品 10. 22 mg，置于 50 mL 量瓶中，加甲醇稀
释至刻度，摇匀，制备 204. 4 mg·L － 1的对照品贮备
液。用甲醇配制浓度分别为 102. 2，51. 1，25. 55，
12. 775，6. 387 5 mg·L － 1的对照品溶液。通过高效
液相色谱仪测定，以峰面积为纵坐标，去氢二异丁
香酚浓度为横坐标，绘制标准曲线，求得回归方程
Y = 651 47X + 745 39(r = 0. 999 5) ，线性范围6. 4 ～
102. 2 mg·L － 1。
2. 2 提取工艺研究
2. 2. 1 单因素考察
2. 2. 1. 1 溶剂量 取肉豆蔻样品粉末( 过20 目
筛)10 g，精密称定 12 份，分为 4 组，每组 3 份，样品
平行操作，以乙醇为提取溶剂，溶剂量分别为 6，8，
10，12 倍，回流提取 1 h，按照供试品溶液的制备方
法制备样品，进样，结果见表 1。
表 1 不同体积溶剂提取去氢二异丁香酚的含量测定 (n = 3)
No． 溶剂倍数 去氢二异丁香酚提取量 /mg 得率 /‰
1 6 18. 28 1. 828
2 8 18. 64 1. 864
3 10 19. 30 1. 930
4 12 19. 41 1. 941
结果表明目标化合物的提取率随溶剂体积增大
而增大，考虑中试设备操作中，料液比一般不超过
1∶ 10且当料液比为 1 ∶ 12 时去氢二异丁香酚提取率
较 1∶ 10 增幅较小。考虑到生产实际及成本，料液比
以 1∶ 10 为宜。
2. 2. 1. 2 提取时间 取肉豆蔻样品粉末( 过20 目
筛)10 g，精密称定 12 份，分为 4 组，每组 3 份，样
品平行操作，以乙醇为提取溶剂，同时固定料液比
(1∶ 10) ，提取时间分别为0. 5，1，2，3 h，按照供试品
溶液的制备方法制备样品，进样，结果见表 2。
表 2 提取不同时间去氢二异丁香酚的含量测定(n = 3)
No． 提取时间 / h 去氢二异丁香酚提取量 /mg 得率 /‰
1 0. 5 19. 12 1. 912
2 1 19. 30 1. 930
3 2 20. 22 2. 022
4 3 20. 45 2. 045
可见目标化合物的提取率随提取时间延长而增
大，2 h 后去氢二异丁香酚提取率增幅不大，考虑到
经济效益，回流提取时间不宜超过 2 h。
·57·
王聪，等:肉豆蔻对照品去氢二异丁香酚制备工艺
2. 2. 1. 3 提取溶剂 本文提取工艺考察的提取溶
剂为不同浓度的乙醇，它们是目前各中药制药厂中
使用最广泛的提取溶剂，因为其无毒且成本低。在
本文中，提取的目标———去氢二异丁香酚属于木脂
素类化合物，极性较小，易溶于甲、乙醇，几乎不溶于
水。因此本文主要考察不同浓度的乙醇对目标化合
物的提取效果。
取肉豆蔻样品粉末( 过20 目筛)10 g，精密称定
12 份，分为 4 组，每组 3 份，样品平行操作，以料液
比 1∶ 10，提取时间 1 h 为固定条件，乙醇浓度分别为
60%，70%，80%，95%，按照供试品溶液的制备方法
制备样品，进样，结果见表 3。
表 3 不同浓度乙醇提取去氢二异丁香酚的含量测定(n = 3)
No． 乙醇浓度 /% 去氢二异丁香酚提取量 /mg 得率 /%
1 60 19. 07 0. 190 7
2 70 19. 13 0. 191 3
3 80 19. 76 0. 197 6
4 95 19. 37 0. 193 7
结果表明乙醇溶液浓度过高或过低都不利于去
氢二异丁香酚的提取，乙醇浓度为 95%时可以把肉
豆蔻中极性较小的成分如脂肪酸和甘油酯类物质提
取出来，80%的乙醇可以将目标物较好的溶出，而极
性较小的干扰性成分相对溶出的较少。综合提取效
率和成本因素，80%乙醇为最佳选择。
2. 2. 1. 4 提取次数 取肉豆蔻样品粉末( 过20 目
筛)10 g，精密称定 3 份，样品平行操作，以 80% 乙
醇，料液比 1∶ 10，提取时间 1 h 为固定条件，提取次
数分别为 1，2，3 次。按照供试品溶液的制备方法制
备样品，进样，结果见表 4。
表 4 提取不同次数去氢二异丁香酚的含量测定(n = 3)
No． 提取次数 去氢二异丁香酚提取量 /mg 得率 /%
1 1 19. 74 0. 197 4
2 2 20. 03 0. 200 3
3 3 20. 10 0. 201 0
结果表明目标化合物的提取率随提取次数增大
而增大，提取 2 次后去氢二异丁香酚提取率基本上
不再增大，考虑到生产实际及成本，确定提取次数为
2 次。
2. 2. 2 正交试验 单因素考察结果表明影响提取
率的因素主要有乙醇浓度、溶剂倍数以及提取时间。
因此，选择以上 3 个因素，每个因素设置 3 个水平，
进行 L9(3
4) 正交试验。每次投药量为 10 g，正交实
验因素水平见表 5，正交试验结果如表 6 所示。
表 5 去氢二异丁香酚提取工艺因素水平表
水平 A 溶剂倍数 /倍 B 乙醇浓度 /% C 提取时间 / h
1 6 70 0. 5
2 8 80 1
3 10 95 2
表 6 去氢二异丁香酚提取正交试验安排
试验号 A B C D DDIE 得率 /%
1 1 1 1 1 0. 181 1
2 1 2 2 2 0. 186 3
3 1 3 3 3 0. 192 8
4 2 1 2 3 0. 183 5
5 2 2 3 1 0. 195 9
6 2 3 1 2 0. 190 7
7 3 1 3 2 0. 189 2
8 3 2 1 3 0. 192 0
9 3 3 2 1 0. 193 0
K1 5. 602 5. 538 5. 638 5. 700
K2 5. 701 5. 742 5. 628 5. 662
K3 5. 742 5. 765 5. 779 5. 683
R 0. 140 0. 227 0. 151 0. 038
表 7 方差分析表
方差来源 SS f MS F P
A 0. 003 5 2 0. 001 7 14. 30 ＞ 0． 05
B 0. 010 4 2 0. 005 2 43. 09 ＜ 0． 05
C 0. 004 8 2 0. 002 4 19. 68 ＜ 0． 05
误差 e 0. 000 2 2 0. 000 1
注:F1-0. 05(2，2)= 19. 00，F1-0. 01(2，2)= 99. 00。
方差分析如表 7 所示，结果表明影响肉豆蔻中
去氢二异丁香酚提取率的主次因素依次为 B ＞ C ＞
A，乙醇浓度和提取时间对提取工艺有显著影响，溶
剂用量对提取工艺影响不显著，其中乙醇浓度 K2，
K3 相差极小，故从节约成本的角度考虑，最佳工艺组
合为 A3B2C3，即用 10 倍量 80%乙醇回流提取 2 h。
2. 2. 3 验证试验 称取肉豆蔻药材粉末 3 份，每份
约 10 g，按确定的最佳工艺提取，即 10 倍量 80 %乙
醇回流提取 2 h，结果去氢二异丁香酚的提取率分别
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中国实验方剂学杂志
Chinese Journal of Experimental Traditional Medical Formulae
Vol． 18，No． 4
Feb．，2012
为 0. 216%，0. 214 2%，0. 214 8%，均高于正交 9 份
样品的提取率，提示本工艺稳定、可行。
综合单因素及正交试验结果，本文在中试提取
中采取的工艺如下: 肉豆蔻药材30 kg，用粉碎机粉
碎，分 2 次装入 200 L 中药提取罐，每次 15 kg。加
入 150 L 80%乙醇，先浸泡 12 h，再在 90 ℃下回流
提取 2 次，每次 2 h。提取液抽入真空浓缩罐，在
50 ℃、真空度 0. 07 Mpa 下回收溶剂，得到流浸膏
10 kg。
2. 3 分离工艺研究
2. 3. 1 萃取 提取药材得到 10 kg 流浸膏，加入
4 ～ 5倍无水乙醇，超声 20 min，过滤分离，除去白色
不溶物( 文献［6］报道，主要为脂肪酸和甘油酯) ，再
加入适量无水乙醇洗涤白色不溶物至白色不溶物中
硅胶 GF 254 薄层板上检不出目标化合物斑点，合并
滤液。
肉豆蔻提取物醇沉后过滤所得到的乙醇溶液，
减压浓缩，得浸膏 6 kg。接着用 3 倍体积的乙酸乙
酯反复萃取，直至浸膏中 TLC 检测不出去氢二异丁
香酚斑点为止。萃取后合并有机相，减压回收溶剂，
得萃取物 2. 5 kg。
2. 3. 2 硅胶柱层析 得到的 2. 5 kg 萃取物，通过
硅胶柱层析分离出目标化合物。具体过程为 160 ～
200 目柱层析硅胶 2 kg，湿法装入 φ 15 cm × 80 cm
的玻璃层析柱中，在柱下端抽气减压将硅胶压实。
将萃取物分为 6 等份，每份与等质量的 160 ～ 200 目
硅胶拌匀、烘干后装入层析柱。梯度洗脱，石油醚-
乙酸乙酯(8∶ 1) 洗脱4 个柱体积后继以石油醚-乙酸
乙酯(4∶ 1) 洗脱，下端抽气减压抽出洗脱液，每4 L
为一个流分。得到含有去氢二异丁香酚的流分，分
为合瓶Ⅰ( 主含有去氢二异丁香酚及以上斑点，杂
质较少，有晶体析出) 和合瓶Ⅱ( 含有去氢二异丁香
酚及以下的斑点，杂质较多)。
合瓶Ⅰ回收溶剂后，析出晶体，石油醚-乙酸乙
酯(8∶ 1) 反复洗涤至白色，拌硅胶上样，石油醚-丙酮
(6∶ 1) 洗脱，析出的晶体反复以石油醚-丙酮重结晶
可得。合瓶Ⅱ继续以石油醚-乙酸乙酯梯度洗脱，含
有目标化合物的流分合并，蒸干溶剂，石油醚-乙酸
乙酯(8∶ 1) 反复洗涤至白色，拌硅胶上样，石油醚-丙
酮(6∶ 1) 洗脱，并反复以石油醚-丙酮重结晶即得。
3 结论
通过硅胶柱层析及反复重结晶最终得到去氢二
异丁香酚白色结晶 9 g，并对该结晶进行了纯度检
测。在 TLC 中，以石油醚-丙酮(3 ∶ 1)、石油醚-乙酸
乙酯(4 ∶ 1)、二氯甲烷展开，两种显色剂(FeCl3，
10%硫酸-乙醇) 显色后均为单一斑点，RP-HPLC-紫
外检测器下，3 种样品浓度(2，1，0. 5 g·L － 1) ，4 种检
测波长(210，254，274，310 nm) 下去氢二异丁香酚
含量按峰面积归一化法计算 ＞ 98%，RP-HPLC-二极
管阵列检测器 190 ～ 400 nm 样品均呈现单一色谱
峰，不同波长下样品纯度均 ＞ 98%，NP-HPLC-紫外
检测器下样品呈现单一色谱峰，去氢二异丁香酚含
量按峰面积归一化法计算 ＞ 98%。实验结果说明样
品符合作为中药化学对照品的纯度要求。H1-
NMR，C13 -NMR ，UV，IR，MS 数据均与文献［3-5］报道
的去氢二异丁香酚波谱数据吻合。
4 讨论
本文在 2 个月的时间内，应用常规的提取分离
设备，从 30 kg 肉豆蔻中制备出 9 g 符合《中国药
典》标准的去氢二异丁香酚对照品。总结工作经
验，以下 4 点对于达到这一结果非常关键:
①肉豆蔻种仁中主要含有脂肪油 25% ～ 46%，
挥发油 8% ～ 15%［1］，因此如何除去这些干扰性成
分是关键问题。有文献［7］报道通过甲醇超声萃取
除去含量较大的脂肪酸和甘油酯，但甲醇毒性大，成
本高，本文通过实验发现无水乙醇除杂效果与甲醇
相当，最终选用无毒且成本较低的无水乙醇作为除
杂溶剂。
②有文献报道［4］肉豆蔻石油醚萃取物可分离
得到去氢二异丁香酚，也有文献报道［3］先通过石油
醚回流提取进行脱脂，接着用乙醇回流提取，乙醇提
取物经硅胶柱色谱分离可得到目标成分。本文比较
了石油醚、乙酸乙酯对目标成分的萃取率，发现 2 者
都可以将目标成分萃取出来，乙酸乙酯萃取率显著
高于石油醚，故选用乙酸乙酯进行萃取，以便除杂的
同时最大程度的保留目标成分。
③本文同时考察了不同的柱层析介质包括硅
胶、大孔树脂对目标成分的分离效果，发现大孔树脂
对目标从成分的分离效果较差，死吸附现象较严重，
因此本文选择廉价的硅胶作为分离介质。同时探索
了不同洗脱剂对目标成分的洗脱效果，结果表明石
油醚-乙酸乙酯梯度洗脱时除杂率高且节省时间和
溶剂。
④本文中试放大后的目标化合物产率(0. 033
3%) 仍显著低于在实验室中的提取率(0. 19% 以
上) ，这一方面是由于硅胶柱层析步骤中仍有大量
目标物溶于未析出结晶的流分中尚未分离，另一方
面萃取及柱层析过程中样品也会部分损失，如何进
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王聪，等:肉豆蔻对照品去氢二异丁香酚制备工艺
檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶
一步提高产率，是今后研究的方向。
［参考文献］
［1］ 《中华本草》编辑委员会 ． 中华本草( 第七卷) ［M］． 上
海:科学技术出版社，1999，12:1599．
［2］ 中国药典 ．一部［S］． 2010:126．
［3］ 李秀芳，吴立军 ． 肉豆蔻的化学成分［J］． 沈阳药科大
学学报，2006，23(11) :698，734．
［4］ 张蕾，徐云峰 ． 肉豆蔻的化学成分研究［J］． 中国现代
中药，2010，12(6) :16．
［5］ 杨秀伟，高继山 ． 肉豆蔻化学成分研究［J］． 中成药，
1994，16(5) :38．
［6］ 杨秀伟，黄鑫 ． 肉豆蔻中新的新木脂素类化合物［J］．
中国中药杂志，2003，33(4) :397．
［责任编辑 蔡仲德］
［收稿日期］ 20110401(005)
［基金项目］ “十一五”国家科技支撑计划(2006BAI06A07-02)
［第一作者］ 刘文琴，实验师，学士，从事中药质量分析，Tel:0791-7118913，E-mail:liuwenqin324@ 163． com
［通讯作者］ * 谢一辉，教授，硕导，学士，从事中药活性成分分析，Tel:0791-7118913，E-mail:xieyh6152003@ yahoo． com． cn
·化学与分析·
基于指纹图谱探讨泽泻不同炮制饮片的成分差异
刘文琴，周丽姣，罗金龙，龚嘉华，谢一辉 *
( 江西中医学院，南昌 330004)
［摘要］ 目的:探讨泽泻不同炮制饮片成分差异。方法:建立泽泻及其炮制饮片的指纹图谱，用中药色谱指纹图谱相似
度评价系统提取各炮制饮片指纹图谱信息，用 SPSS 进行分析。结果:各炮制饮片与生品饮片之间指纹图谱有显著差异，其中
有 14 个峰为不同泽泻饮片的特征峰。结论:泽泻不同炮制饮片及生品饮片的特征成分有显著差异。
［关键词］ 泽泻; 炮制饮片指纹图谱; 成分分析
［中图分类号］ R284. 1 ［文献标识码］ A ［文章编号］ 1005-9903(2012)04-0078-04
A Study Based on Fingerprints of the Defference of
Components of Different Processed Alisma Pieces
LIU Wen-qin，ZHOU Li-jiao，LUO Jin-long，GONG Jia-hua，XIE Yi-hui*
(Traditional Chinese Medicine of Jiangxi university，Nanchang 330004，China)
［Abstract］ Objective:To study the difference of Alisma pieces which are processed in different way．
Method:Fingerprints of Rhzoma alismatics orientalitis and its processed pieces are developed． The information of
each processed Alisma pieces fingerprint is extracted with traditional Chinese medicine fingerprint similarity
evaluation system evaluation system，and analyzed by SPASS． Result:The fingerprint of cach processed pieces
Alisma pieces and raw Alisma pieces are significantly different，in which 14 peaks are characteristic peaks of
difference Alisma pieces． Conclusion:The difference between characteristic components of processed Alisma
pieces and raw Alisma pieces is significant．
［Key words］ Alisma;the fingerprint of processed Pieces;analysis of components
泽 泻 为 泽 泻 科 植 物 泽 泻 Alisma orientalis (Sam．)Juzep．的干燥块茎。性味甘、寒，归肾、膀胱
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第 18 卷第 4 期
2012 年 2 月
中国实验方剂学杂志
Chinese Journal of Experimental Traditional Medical Formulae
Vol． 18，No． 4
Feb．，2012