全 文 ：中药新药与临床药理 2013年 7月第 24卷第 4期
多年临床经验精心研制而成，其制方严谨，配伍精
妙，经多年临床验证，疗效确切。方由肉苁蓉、北
芪、王不留行、泽兰组成。方中君药肉苁蓉味甘咸
温，入肾、大肠经，具温肾阳、益精血、润肠通便
之效；臣以北芪，味甘、微温，入脾、肺、肝、肾
经，为补气健脾之要药，有益气固表、敛汗固脱、
托疮生肌、利水消肿之功；王不留行味苦平，入肝、
胃经，善于行血通经、消肿止痛；泽兰性苦辛、微
温，归肝、脾经，善于活血化瘀，利水消肿，尤宜
治水瘀互结之证，与王不留行相须为用，共为佐药。
4药合用，攻补兼施，共奏益肾活血通瘀散结之功。
动物实验研究发现益肾通方具有一定的抗炎、抑制
腺上皮增生的作用[7]。
在代表组织炎症程度的 IL8 的表达方面，
CNP-YST组明显低于CNP组（P＜0.01），说明益肾通
抑制前列腺炎效果明显；而BPH-YST组与BPH组比
较，无明显变化（P＞0.01），CNP+BPH-YST组却明显
低于CNP+BPH组（P＜0.01），进一步说明益肾通对前
列腺增生的抑制效果是通过抑制前列腺炎而获得的。
在代表细胞增殖程度的Ki67的表达方面，也有力的
说明了这一点。BPH-YST组Ki67-LI与BPH组比较，
差异无统计学意义（P＞0.01）；而 CNP+BPH-YST组
Ki67-LI明显低于CNP+BPH组（P＜0.01）。
本研究表明，慢性前列腺炎（CNP）能加速良性前
列腺增生（BPH）的疾病进程，益肾通胶囊可通过抑制
前列腺的炎性组织学改变而抑制前列腺的增生。
参考文献：
[1] Emberton M，Andriole GL，de la Rosette J，et al. Benign prostatic
hyperplasia：a progressive disease of aging men[J]. Urology，2003，61
（2）：267-268.
[2] Dimitrakov J，Diembr T，Ludwig M，et al. Recent developments in
diagnosis and therapy of the prostatitis syndromes[J]. Curr Opin Urol，
2001，11：87-91.
[3] 吴自余，马松，王洪兵，等. 组织学前列腺炎对前列腺增生临床进
展的影响因素分析[J]. 医学临床研究，2011，28（8）：1460-1462.
[4] Collins MM，Meigs JB，Barry MJ，et al. Prevalence and correlates of
prostatitis in the health professionals follow-up study cohort[J]. J Urol，
2002，167：1363-1366.
[5] NickelJ，DowneyJ，YoungI，etal. Asymptomaticinflammationand/or
infection in benign prostatic hyperplasia[J]. Rr J Urol Int，1999，84：
976-98l.
[6] TurnerHE，NagyZ，GatterKC，etal．Proliferation，bcl-2expression
and angiogenesis in pituitary adenomas：relationship to tumor behaviour
[J]．BrJCancer，2000，82（8）：1441．
[7] 徐发彬，李洪杰，崔学教，等. 益肾通方对大鼠前列腺增生模型的
影响[J]. 新中医，2004，36（10）：75-76.
（编辑：邓响潮）
收稿日期：2013-02-28
作者简介：吴军，男，博士研究生，讲师，研究方向：中药复方抗炎、抗肿瘤免疫研究。Email：wjmsn@hotmail.com。通讯作者：周春祥，博士，
教授，博士生导师，研究方向：中药复方抗炎、抗肿瘤免疫研究。Email：zhaofengming0117@sina.com。
基金项目：江苏省研究生科研创新计划项目（2010）。
麻黄连轺赤小豆汤三方对H2O2诱导损伤的L-O2人肝细胞的保护作用
吴 军，周春祥，赵凤鸣，周 韬（南京中医药大学基础医学院，江苏 南京 210046）
摘要：目的 研究麻黄连轺赤小豆汤三种组方（简称“三方”）对体外肝细胞损伤的保护作用及其机制。方法 培
养 L-O2人肝细胞，采用 H2O2（100 μmol·L-1）体外诱导肝细胞损伤，检测细胞上清中天门冬氨酸转换酶（AST）和
丙氨酸氨基转换酶（ALT）、丙二醛（MDA）的含量及超氧化物歧化酶（SOD）活力，cck-8法检测细胞活性。结果
与阴性对照组比较，H2O2（100 μmol·L-1）可抑制肝细胞活性，增加 MDA的生成和 ALT、AST 的水平，降低
SOD的活力（P＜0.01，P＜0.05）；与模型组比较，麻黄连轺赤小豆汤三方均可拮抗 H2O2对肝细胞的损伤作用，
可促进细胞增殖，显著降低细胞上清 ALT（除楸树皮方低剂量组）和 AST水平（除楸树皮方高剂量组）及 MDA含
量（除梓白皮方低剂量组），明显提升 SOD活力（P＜0.01，P＜0.05）。结论 麻黄连轺赤小豆汤三方对体外肝
细胞损伤均有直接保护作用，该作用可能与其抗氧化作用有关。
关键词：麻黄连轺赤小豆汤；L-O2肝细胞；过氧化氢；抗氧化作用
中图分类号：R285.5文献标志码：A 文章编号：1003-9783（2013）04-0367-04
doi：10.3969/j.issn.1003-9783.2013.04.011
367· ·
C M Y K
Traditional Chinese Drug Research ＆ Clinical Pharmacology，2013 July，Vol． 24 No． 4
麻黄连轺赤小豆汤乃《伤寒论》治疗阳明病瘀热
在里之经典方，临床应用非常广泛，但是针对麻黄
连轺赤小豆汤的实验研究，国内外研究甚少。然囿
于梓白皮药源不清或药房未备等因素，临床应用多
以其他药物（桑白皮、楸树皮）取而代之。为了确认
后世桑白皮、楸树皮替代梓白皮的合理性，课题组
用桑白皮、楸树皮分别代替麻黄连轺赤小豆汤中梓
白皮组成三种方剂简称“三方”，旨在治疗不同机制
的肝损伤模型。以往研究发现[1]三方对CCl4和 BCG+
LPS所致化学性肝损伤有保护作用，本研究进一步观
察了三方对体外肝细胞损伤的保护作用，以探索三
方的药效和作用机制。
1 材料与方法
1.1 药材 麻黄连轺赤小豆汤由麻黄、连轺、杏仁、
赤小豆、大枣、梓白皮（楸树皮、桑白皮）、生姜、炙
甘草组成。麻黄， 南京鹿江中药饮片厂，批号：
20091206；杏仁，徐州彭祖中药饮片有限公司，批
号：20100319；桑白皮，安徽神州中药饮片公司，
批号：20101101；梓白皮、楸树 ，周口市楸树良
种繁育基地，批号：20110601；其他药材均购于本
校国医堂门诊部，批号：20111023。
1.2 试剂 谷草转氨酶（AST）、谷丙转氨酶（ALT）、超
氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）试剂盒，南京建成
生物工程研究所，批号分别为：20120217、 0120209、
20120418、20120424；过氧化氢（H2O2），批号：
201101212，上海凌峰化学试剂有限公司；DMEM培
养基，批号：20120220，美国 Gibco 公司；胰蛋白
酶，批号：20111125，美国Sigma公司；胎牛血清，
批号：20111012，杭州四季青公司。
1.3 细胞 L-O2人肝细胞株，批号：20111205，上海
细胞所。
1.4 方法
1.4.1 药液制备 麻黄连轺赤小豆汤组成：麻黄10 g、
连轺10 g、杏仁5 g、赤小豆50 g、大枣4枚（15 g）、
梓白皮（桑白皮、楸白皮）15 g、生姜 10 g、炙甘草
10 g。取麻黄连轺赤小豆方125 g浸泡30 min，煎煮
30 min，收集第1次滤液；剩余药液再加水煎煮 30
min，收集第 2 次滤液；合并 2 次滤液浓缩至 66.67
mL，浓度为1.877 g·mL-1，4℃保存备用。将原液
（1.877 g·mL-1）稀释 550 倍（3400μg·mL-1）作为高
剂量组，再稀释 10 倍（340μg·mL-1）作为低剂量
组。
1.4.2 L-O2 细胞培养 取 L-O2 细胞置 37℃，5 %
CO2培养箱中培养，细胞生长至单层致密状时，用
0.25 ％胰蛋白酶消化后以1∶3传代，待细胞长满后
再次传代。
1.4.3 筛选H2O2浓度 取处于指数生长期的细胞，加
入适量 0.25 %胰蛋白酶消化约 5 min。用 DMEM 培
养基配成2×105/mL细胞悬液，加入96孔板。阴性
对照组含细胞悬液 160μL，生理盐水 40μL；模型
组含细胞悬液 160μL，浓度分别为 100，200，
Protective Effect of Three Kinds of Mahuang Lianqian Chixiaodou Decoction on L -O2 Hepatocyte Injury
Induced by H2O2
WU Jun，ZHOU Chunxiang，ZHAO Fengming，ZHOU Tao（Praclinical Medicine School of Nanjing University of
Chinese Medicine，Nanjing 210046 Jiangsu，China）
Abstract：Objective ToobservetheprotectiveeffectofMahuang Lianqian Chixiaodou Decoction（MLCD），including
the original recipe，and two kinds of variation recipes withSangbaipi （Cortex Mori），Qiushupi（Co tex Catalpae
Gungei）taking the place ofZibaipi（Cortx Catalpae Ovatae Radicis），on L-O2 hepatocyte injury induced by H2O2and
to reveal the mechanism.Methods L-O2 hepatocytes were incubated，and then injured by H2O2. The levels of
aspartate aminotransferase（AST），alanine aminotransferase（ALT），and malondialdehyde（MDA），and superoxide
dismutase（SOD）activity in the supernatant were detected. Cell proliferation was assayed by cck-8 reduction method.
Results Compared with negative control group，H2O2 at 100μmol·L-1inhibited the activity of L-O2 hepatocytes，
increased MDA，ALT and AST levels，and decreased SOD activities. AndMahuang Lianqian Chixiaodou Deco on
counteracted the above changes（P＜0.05 orP＜0.01），except for ALT in middle-doseQiushupi-MLCD，AST in
high-doseQiushupi-MLCD，and MDA in middle-doseZibaipi-MLCD.Conclusion Mahuang Lianqian Chixiaodou
Decoction has protective effect on H2O2-induc d hepa cytes injury in vitro，and the mechanism might be associated
with its anti-oxidation activity.
Keywords：Mahuang Lianqian Chixiaodou Decoction；L-O2 hepatocytes；hydrogen peroxide（H2O2）；Anti-oxidation
activity
368· ·
C M Y K
中药新药与临床药理 2013年 7月第 24卷第 4期
400，600，800μmol·L-1 的 H2O220μL，生理盐水
20μL，在37℃，5 %CO2培养箱中孵育24 h后加入
10μL cck-8 溶液，37℃温育 1 h 后用酶标仪在
490 nm处测定每孔OD值。
1.4.4 细胞活性测定 取处于指数生长期的细胞，加
入适量 0.25 %胰蛋白酶消化 5 min。用 DMEM 培养
基配成2×105·mL-1细胞悬液，加入 96 孔板，阴性
对照组含细胞悬液 160μL，生理盐水 40μL；模型
组每孔含细胞悬液 160μL，H2O220μL，生理盐水
20μL；药物组：麻黄连轺赤小豆汤（含梓白皮）低、
高剂量组，以下简称梓白皮方；麻黄连轺赤小豆汤
（含楸树皮）低、高剂量组，以下简称楸树皮方；麻
黄连轺赤小豆汤（含桑白皮）低、高剂量组，以下简
称桑白皮方，含细胞悬液 160μL，H2O220μL，药
液20μL，在37℃，5 % CO2培养箱中孵育24 h后
加入10μL cck-8溶液，37℃温育1 h后用酶标仪在
490 nm处测定每孔OD值。
1.4.5 细胞形态观察 取处于指数生长期的细胞，加
入适量0.25 %胰蛋白酶消化5 min。用含 10 %小牛
血清的DMEM培养液配成细胞悬液，种入小细胞瓶，
24 h后，阴性对照组加2.4 mL培养基，0.6 mL生理
盐水，模型组加 2.4 mL培养基，0.3 mL生理盐水，
0.3 mL H2O2，药物组加2.4mL培养基，0.3 mL药液，
0.3 mL H2O2，于37℃，5 %CO2培养箱中培养24 h。
直接用倒置相差显微镜观察细胞的形态及生长状况，
并拍照。
1.4.6 赖氏法测定AST和ALT水平 按试剂盒说明检
测。
1.4.7 MDA含量和SOD活力测定 按试剂盒说明检
测。
1.5 统计学处理方法 应用SPSS 16.0统计软件，实
验数据以均数±标准差（x± s）表示，组间比较采用 t
检验，P < 0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 对 H2O2诱导损伤的 L-O2细胞活性的影响 见
表 1、表 2。表 1 显示，与阴性对照组比较，100 ~
800μmol·L-1的H2O2差异有统计学意义（P < 0.05，P
< 0.01），且存在着明显的量效关系，即随着H2O2浓
度的升高，对细胞活性的抑制作用明显增加。在参
考相关文献和实验结果的基础上，我们选择了 100
μmol·L-1作为模型组的造模浓度。表2显示，与阴性
对照组比较，模型组 L-O2 细胞活性差异有统计学
意义（P < 0.01）；与模型组比较，桑白皮方、梓白皮
方和楸树皮方高、低剂量组L-O2细胞活性差异均有
统计学意义（P < 0.05，P < 0.01），说明100μmol·L-1
H2O2可以抑制细胞L-02活性，而各用药组均能拮抗
此抑制作用。
表 1 H2O2对 L-O2细胞活性的影响（x± s，n=8）
Table 1 Effects on the proliferation of H2O2-treated L-O2 cells
culture
注：与阴性对照组比较，*P < 0.05，**P < 0.01。
表 2 对L-O2细胞活性的影响（x± s，n=8）
Table 2 Effects of medication on the proliferation of L-O2
注：与阴性对照组比较，#P < 0.01；与模型组比较，*P < 0.05，**P <
0.01。
2.2 对H2O2诱导损伤的 L-O2 细胞形态的影响 见
图1。阴性对照组细胞生长状态良好，贴壁较牢，细
胞间连接紧密、边界清楚，大小均匀；模型组细胞
数量明显减少，细胞边界不清，甚至损伤破裂，有
组别
阴性对照组
模型组1
模型组2
模型组3
模型组4
模型组5
H2O2/μmol·L-1
0
100
200
400
600
800
OD值
0.511±0.014
0.407± .032*
0.411±0.022*
0.348±0.019**
0.310±0.009**
0.284±0.012**
组别
阴性对照组
模型组
桑白皮方高剂量组
桑白皮方低剂量组
梓白皮方高剂量组
梓白皮方低剂量组
楸树皮方高剂量组
楸树皮方低剂量组
剂量/μg·mL-1
-
-
3400
340
3400
340
3400
340
OD值
0.701± .089
0.475±0.033#
0.554±0.045*
0.615±0.097*
0.552±0.021**
0.613±0.067**
0.544±0.046*
0.634±0.045**
模型组 阴性对照组 桑白皮方组 楸树皮方组 梓白皮方组
图 1 对 L-O2细胞形态的影响（×100）
Figure 1 The morphological observation of L-O2 cells
369· ·
C M Y K
Traditional Chinese Drug Research ＆ Clinical Pharmacology，2013 July，Vol． 24 No． 4
组别
阴性对照组
模型组
桑白皮方高剂量组
桑白皮方低剂量组
梓白皮方高剂量组
梓白皮方低剂量组
楸树皮方高剂量组
楸树皮方低剂量组
剂量/μg·mL-1
-
-
3400
340
3400
340
3400
340
AST/U·L-1
13.03±1.77
31.62±3.64#
23.76±4.71**
18.55±2.41**
25.45± .50*
17.20±5.53**
39.43±9.55
18.66± .02**
ALT/U·L-1
2.70± .93
18.14± .09#
12.61±3.64*
6.93±1.83**
10.38±4.50**
9.04±2.33**
9.49±1.49**
16.95±4.04
细胞脱落；而各药物组细胞数量和形态与模型组比
较，得到明显改善，基本接近阴性对照组。
2.3 对 H2O2诱导损伤的 L-O2细胞 ALT和 AST水
平的影响 见表3。与阴性对照组比较，模型组ALT
和AST水平显著升高（P < 0.01）；与模型组比较，除
楸树皮高剂量组的AST、低剂量组 ALT外，各用药
组ALT和AST水平明显降低（P<0.05，P<0.01），表
明麻黄连轺赤小豆汤三方对L-02细胞有保护作用。
表 3 各组细胞上清 AST、ALT的水平（x± s，n=8）
Table 3 The levels of AST and ALT in different groups
注：与阴性对照组比较，#P < 0.01；与模型组比较，*P < 0.05，**P
< 0.01。
2.4 对 H2O2 诱导损伤的 L-O2 细胞 SOD 活力和
MDA 含量的影响 见表 4。L-02 肝细胞与 H2O2共
育24 h后，与阴性对照组比较，模型组SOD活力降
低、MDA含量升高，差异有统计学意义（P < 0.01）；
与模型组比较，除梓白皮方低剂量组MDA外，各用
药组SOD活力显著提高、MDA降低（P < 0.05，P <
0.01），显示其有良好的抗氧化作用。
表 4 各组细胞上清 SOD活力及 MDA水平（x± s，n=8）
Table 4 The activities of SOD and the level of MDA in different
groups
注：与阴性对照组比较，#P < 0.01；与模型组比较，*P < 0.05，
**P < 0.01。
3 讨论
氧化应激是指由内源性的活性氧（ROS）所致的细
胞毒性损伤，细胞内氧化系统与抗氧化系统失衡，
氧化应激损伤是慢性病毒性肝炎、酒精性肝病
（ALD）、自身免疫性肝脏疾病（AILD）和非酒精性脂肪
肝（NASH）的共同病理学特征，在一定程度上可能与
肝细胞和肝脏其他类型细胞的功能障碍或死亡有关，
并导致疾病的发生和发展[3-5]。肝细胞受到氧化损伤
时，自由基及其过氧化反应产物破坏细胞膜和细胞
结构，导致细胞肿胀坏死，并可使细胞内清除自由
基酶的活性下降，导致其清除自由基能力下降，使
肝细胞损伤进一步加重，肝细胞内ALT和AST等酶
外逸，细胞肿胀死亡[6]。H2O2是一种重要的活性氧，
极易通过细胞膜与细胞内铁离子反应形成高活性
OH·损伤肝细胞[7]。
本实验显示，100μmol·L-1H2O2可诱导肝细胞损
伤，而麻黄连轺赤小豆汤三方均不同程度地减轻其
损伤，通过提高受抑的肝细胞活性，改善细胞生长
状态，降低ALT、AST水平及MDA含量，提升 SOD
活力，从而减少肝细胞坏死；减轻膜脂质过氧化和
细胞通透性的增加。由此推测，麻黄连轺赤小豆汤
三方是通过降低转氨酶、抗脂质过氧化、防止过氧
化损伤、减少过氧化脂质的生成等环节，起到抗
H2O2致肝细胞损伤的作用。
通过对三方的药效分析发现，三方对细胞增殖
的影响均存在量效关系，在降低AST水平方面，三
方的中剂量组要优于高剂量组；而桑白皮低剂量组
在降低ALT水平方面效果较为显著；但在提升SOD
活力和减少MDA生成方面，三方所表现的效应则近
似；总之，三方在改善受抑的肝细胞活性，提升
ALT、AST和SOD的表达以及降低MDA的生成方面
不存在明显的差异，并与前期动物实验结果基本一
致，提示桑白皮代用梓白皮的合理性，并为《伤寒论》
中药物的代用和弃用等现象研究提供了方法和思路。
参考文献：
[1] 赵娟.《伤寒论》麻黄连翘赤小豆汤之梓白皮研究[D]. 南京：南京中
医药大学，2011：16-24.
[2] 杨燕，陈敏珠. 黄芪总提物对体外肝细胞损伤的保护作[J]. 中国临
床药理学与治疗学，2000，5（4）：294-297.
[3] Medina J，Moreno-Otero R. Pathophysiological basis for antioxidant
therapy in chronic liver disease[J]. Drugs，2005，65：2445-2461.
[4] Tribble DL，Aw TY，Jones DP. The pathophysiological significance of
lipid peroxidation in xidative cell injury[J]. Hepatology，1987，7：
377-386.
[5] 顾伟，范昕建，吴疆，等. 胡黄连苷Ⅱ对H2O2损伤L-02细胞的保
护作用[J]. 世界华人消化杂志，2008，16（29）：3274-3278.
[6] Kalf FG，Pastgb，Snyder R. Sewent toxicology recen vances in the
toxicology of benzene，the glycolethers，and catetrachloride[J]. Ann
Rev Pharmocol Toxicol，1987，27：39.
[7] 曹艳，许自川，何小解，等. 儿茶素拮抗过氧化氢诱导的大鼠皮祖
细胞凋亡[J]. 中国当代儿科杂志，2009，11（1）：61-66.
（编辑：邓响潮）
组别
阴性对照组
模型组
桑白皮方高剂量组
桑白皮方低剂量组
梓白皮方高剂量组
梓白皮方低剂量组
楸树皮方高剂量组
楸树皮方低剂量组
剂量/μg·mL-1
-
-
3400
340
3400
340
3400
340
SOD/U·mL-1
16.51±3.42
8.12±1.03#
14.10± .38**
16.66± .12*
14.76±1.80**
15.37±5.24*
16.10±4.19*
14.41±1.67**
MDA/nmol· L-1
2.38±0.31
3.23±0.16#
2.43±0.02**
2.60± .47*
2.07±0.02**
3.05±0.89
1.40± .65**
2.82±0.13**
370· ·
C M Y K