全 文 ：豆薯种子中一种具有抗植物病毒活性的
蛋白质的初步晶体学研究①
蔡建华　林玉娟＊　叶晓明　陈明晃　宋立军
(结构化学国家重点实验室 中国科学院福建物质结构研究所 福州 350002
中国科技大学生物系结构生物学开放实验室 合肥 230027)
从豆科植物豆薯(Pachy rrhizus erosus , Leguminosae)的种子中分离纯化了一种具有抗植物
病毒活性的蛋白质 ,分子量约为 15kD 。在 20%(w/v)PEG6000 ,0.1mol/L 磷酸盐缓冲液(pH
7.4)条件下得到了可供衍射用的单晶 ,在 MarResearch IP 上进行了衍射数据收集 ,其衍射能
力达 2.3 • 。经 MarDenzo 软件包处理 ,确定其空间群为 P212121 , 晶胞参数为:a=28.808 ,
b=32.840 , c=140.397 • 。根据 Matthew s常数估算 ,每个不对称单元含 1个分子。
关键词:豆薯种子 , 抗植物病毒活性 , 晶体生长 , 初步晶体学
　　植物大多受到细菌 、真菌 、昆虫和病毒的入侵。
对于这些病害的防治 ,相对而言 ,病毒所造成的病
害尤其难以防治 ,主要原因是病毒变异频繁 ,繁殖
迅速 ,而且具有活体寄生性 ,它的复制与寄主细胞
代谢密切相关 ,已有的防治方法大多伤及植物本
身[ 1] 。然而 ,植物本身为抵抗这些病原的侵害已发
展许多防卫机构 ,这些防卫机构通过自身含有的各
类蛋白 、糖蛋白 、多糖和酚类等抗病毒物质起作用
或是通过病毒侵染后诱导产生对病毒具有抗性的
抗植物病毒物质起作用。人们对其中蛋白类的抗
植物病毒物质 ,即所谓抗病毒蛋白特别感兴趣。
抗植物病毒蛋白根据其来源方式可以分为两
类 ,一类是内源的抗植物病毒蛋白质(endogenous
antiviral proteins),另一类是被诱导的抗植物病毒
蛋白(induced antiviral proteins)[ 2] 。内源的抗植
物病毒蛋白包括一些具有抗植物病毒活性的核糖
体失活蛋白以及一些能诱导植物对病毒感染产生
局部的或系统的抗性的蛋白;被诱导的抗植物病
毒蛋白是植物受到病毒感染后被诱导产生的抗植
物病毒蛋白 ,包括病毒复制抑制剂 、抗病毒因子 、
来自“绿岛”的抑制剂及病原相关蛋白。尽管人们
在抗植物病毒蛋白的研究上已经取得了一些进
展 ,然而 ,对于它的抗植物病毒作用机理至今仍未
完全阐明。近几年 ,已成功地通过植物基因工程
方法获得抗病新植株[ 1 ,3] ,这将为植物病毒的防
治带来新希望 。本文报导从豆薯种子中分离得到
的一种抗植物病毒蛋白的初步结晶学研究。
1　材料和方法
1.1　材料
豆薯种子购自福建省漳州市种子公司 , SP-
Sepharose Fast Flow(SP-SFF A), CM-Sephrose
Fast F low (CM-SFF)和 Sephacryl S-200为Amer-
sham Pharmacia公司产品 ,其它试剂均为分析纯。
1.2　方法
1.2.1　蛋白的分离纯化　整个操作在 4℃下进
行 ,称取 200g 豆薯种子 , 经粉碎后 , 加入适量
pH6.0 , 5mmol/L 磷酸盐缓冲液(PB)进行匀浆 ,
静置过夜 ,将粗提液过滤 ,滤液用 50%HAc调酸
至 pH4.0 ,静置 2h后 ,离心(18 ,000r/min)30min 。
上清液上 SP-FF 柱(2.6cm ×15cm , 已用 HAc-
NaAc 缓冲液充分平衡)。上样后用 pH6.0 ,
5mmol/L 的磷酸盐缓冲液充分洗去杂蛋白 ,再用
含1mol/L NaCl的相同 PB作阶段洗脱 ,收集 SF
洗脱峰 ,先后对蒸馏水及 pH6.0 , 5mmol/ L PB透
析。将透析后的 SF 峰过滤后上预平衡的 CM-
SFF 柱(1.5cm×15cm)。洗去杂蛋白后 ,用含 0 ～
2000-11-15收到;2001-01-16接受　　　①结构化学国家重点实验室和福建省自然科学基金资助项目
20 卷 2 期 结　构　化　学 (JIEGOU HUAXUE) Vol.20 , No.2
2001.3. Chinese J .S truct.Chem . 149～ 150
DOI :10.14102/j.cnki.0254-5861.2001.02.016
0.3mol/L NaCl的平衡缓冲液 600mL 进行梯度洗
脱 ,收集洗脱峰 ,经过浓缩 、透析 、离心后 ,上预平
衡的 S-200 柱(2.0cm ×80cm),用平衡缓冲液进
行洗脱 ,得到目标蛋白。
1.2.2　抗植物病毒活性实验　采用半叶法接种
烟草花叶病毒(TMV)测定蛋白质的抗植物病毒
活性。抑制率=1-[(病毒溶液+蛋白溶液)的枯
斑数/对照(病毒溶液+蒸馏水)的枯斑数] 。
1.2.3　晶体生长　采用微量悬滴汽相扩散法 ,室
温培养。
2　结果与讨论
对纯化后的蛋白进行紫外扫描 ,在 λ=280nm
处有强吸收 ,在 λ=260nm 处有弱吸收 ,证明是蛋
白质 。经 IEF 和 SDS-PAGE 鉴定 ,均为单一纯 。
SDS-PAGE 显示其分子量约为 15kDa ,等电点呈
碱性 ,活性实验初步显示该蛋白具有抗植物病毒
活性 ,其抑制率约为 60%～ 70%(未发表)。
参考 Jancarik等[ 4]的 50个结晶配方和 Shieh
等[ 5]的 48个结晶配方作为设计晶体生长摸索方
案的基础 ,与此同时 ,我们注意到 PEG 是蛋白质
晶体培养中常用且重要的沉淀剂 ,因此 ,我们在探
索晶体生长条件时也同时采用了以 PEG 为主要
沉淀剂 ,然后改变 pH 条件的方法来探索该蛋白的
晶体生长条件。经过大约 6个月的摸索 ,最后 ,我
们采用的晶体生长条件为:池液是 0.8mL 20%
(w/v)PEG6000 , 0.1mol/L 磷酸盐缓冲液(pH
7.4),悬滴液是 4μL 池液加上等体积的 20mg/mL
蛋白溶液 。在室温条件下 , 1 周左右出现晶体 , 2
周后可生长出能用于衍射用的单晶 。晶体外形呈
长方体形 ,晶体的最大尺寸可达 1.0mm×0.6mm ×
0.5mm。
使用MarRsearch IP面探测器收集衍射数据 ,晶
体属于正交晶系 ,系统消光分析确定该晶体属于
P212121空间群 ,晶胞参数为:a=28.808 , b=32.840 ,
c=140.397• 。晶体的分辨率达 2.3•。所收独立衍
射点为 5963 个 , 完整度 92.5%, Rmerge 因子为
10.2%。Matthews系数[ 6]为 2.21•3/Dalton ,溶剂含
量为44%(v/v),晶胞中每个不对称单元中含有 1个
蛋白质分子。目前 ,结构测定工作正在进行之中。
致谢　感谢刘四九博士和龚为民博士在数据收集方面的帮助;感谢孙慧女士在活性实验方面的帮助。
参 考 文 献
1　麦君宇 ,刘进元.植物抗病毒基因工程研究进展及其问题.科技导报 , 1995 , 9:3～ 4
2　Zipf A.In:Antiviral Proteins in Higher Plants.Ed.by Chessin et a l., Paris , France:Tec &Doc-Lavoisier , 1995 , 133～ 146
3　朱国峰 , 瞿礼喜 , 顾红雅等.植物抗病毒基因的分子生物学研究进展.植物学报, 1997 , 39:565～ 569
4　Jancarik J , Kim S.Space Matrix S ampling Method for Crystallization of Protein.J.App l.Cryst., 1991 , 24:409～ 411
5　Shieh H S et a l.Using S ampling Techniques in Protein C rystallizat ion.Acta Cryst ., 1995 , D51:305～ 310
6　Mat thew s B W.Solvent Content of Protein Crys tals.J.Mol.Biol., 1968 , 33:491～ 497
Preliminary Crystallographic Study of a Protein with
Anti-plant Virus Activity from the Seeds of Pachyrrhizus Erosus
CAI Jian-Hua　LIN Yu-Juan　YE Xiao-M ing　CHEN Ming-Huang　SONG Li-Jun
(State Key Laboratory of S tructural Chemistry , Fujian Inst itute of Research on
the Structure of Matter , the Chinese Academy of Sciences , Fuzhou , Fujian 350002)
(Laboratory of Structural Biology , University of Science and Technology of China , Hefei , Anhui 230023)
Abstract
From the seeds of pachyrrhizus erosus , leguminosae , a protein wi th molecular weight of 15kD , which
possesses ant i-plant virus activity , has been isolated and purif ied.Single cry stals suitable fo r X-ray dif frac-
tion w ere obtained by 20% PEG6000 and 0.1mol/ L phosphate buffer.The diff raction data of the crystal
w ere collected on a MarResearch IP , and the data at 2.3 • resolution have been processed by using the
Denzo and Scalepack softw are packages.Space group w as determined as P212121 , w ith cell parameters a=
28.808 , b=32.840 and c=140.397 • .According to the estimation of M atthew s constants , there is one
molecule in an asymmetric unit.
Keywords:pachyrrhizus erosus, anti-plant virus , crystal growth , crystallography
150 结 构 化 学(J IEGOU HUAXUE)Chinese J.S truct.Chem . 2001　Vol.20