全 文 ：第 32卷　第 2期
2008年 3月
　南京林业大学学报(自然科学版)
　JournalofNanjingForestryUniversity(NaturalSciencesEdition)
Vol.32, No.2
Mar., 2008
杞柳和簸箕柳候选杂交亲本 SSR指纹分析
王源秀 1, 2 ,徐立安 1 ,黄敏仁 1
(1.南京林业大学 ,林木遗传与生物技术省部共建教育部重点实验室 ,江苏　南京　210037;
2.安徽师范大学生命科学学院 ,安徽　芜湖　 241000)
摘要:利用微卫星(SSR)分子标记技术对杞柳(SalixintegraThunb)和簸箕柳(SalixsuchowensisCheng)的杂交亲
本进行 DNA指纹图谱分析。从 496对杨树(Populus)SSR标记中筛选出 23对多态性较丰富的标记 , 共检测到
101个等位基因位点 ,平均有效等位基因数为 2.2199。引物 ORNL-312、ORNL-308、ORNL-464在指纹图谱分
析中的效率较高。利用 16对核心引物的指纹组合可将所有 78个杞柳和 19个簸箕柳杂交亲本完全区分开来 ,
并据此绘制了杞柳和簸箕柳杂交亲本的 SSR-DNA指纹图谱 , 同时利用 9、5和 7对引物分别构建了杞柳 1 ～ 27、
杞柳 28 ～ 78及 19个簸箕柳的指纹图谱。
关键词:SSR指纹分析;杞柳;簸箕柳;指纹图谱
中图分类号:S722　　　　文献标识码:A　　　　文章编号:1000-2006(2008)02-0001-05
AnalysisoffingerprintingofSalixintagraThunb.andSalixsuchowensis
Chengusingmicrosatelite(SSR)markers
WANGYuan-xiu1, 2 , XULi-an1 , HUANGMin-ren1
(1.NanjingForestryUniversity, KeyLaboratoryofForestGeneticsandBiotechnologyMinistryofEducation, Nanjing
210037, China;2.ColegeofLifeSciencesAnhuiNormalUniversity, Wuhu241000, China)
Abstract:Inthispaper, DNAfingerprintsofSalixintagraandS.suchowensisChenghybridparentswereanalyzedusing
microsatelite(SSR)markers.ThesamplesfromS.intagraandS.suchowensiswereamplifiedandanalysizedwith23
pairsofpolymorphicmicrosatelitelociand101 alelesscreenedfrom 496 pairsofprimersfromPopulus.Theprimers
ORNL-312, ORNL-308andORNL-464hadhigherefficiencyinidentifyingsampleswithfingerprint.Thecombination
ofthefingerprintfrom16 corepairsofprimerscouldbeusedtoidentifyalS.intagraandS.suchowensisChenghybrid
parents.ThentheSSR-DNAfingerprintof97 hibridparentswasconstructed.ThefingerprintsofS.intagra1— 27, S.
intagra28— 78 and19 S.suchowensiswereseparatelymadeupwith9, 5and7 pairsofSSRprimers.Andthisstudy
couldprovidetheoreticalproofformatingandbreedingofS.intagraandS.suchowensis.
Keywords:Simplesequencerepeat(SSR);SalixintegraThunb.;SalixsuchowensisCheng;Fingerprint
　　收稿日期:2007-01-29　　　　修回日期:2007-09-18
　　基金项目:国家自然科学基金资助项目(30471406)
　　作者简介:王源秀(1976—),女 ,博士生。 ＊通讯作者:徐立安 ,男 ,教授 ,主要研究方向为林木遗传学 , laxu@njfu.edu.cn。
　　引文格式:王源秀,徐立安,黄敏仁.杞柳和簸箕柳候选杂交亲本SSR指纹分析 [ J].南京林业大学学报:自然科学版 , 2008, 32(2):1-5.
　　杞柳(SalixintegraThunb)和簸箕柳(S.suchowensisCheng)属于杨柳科的柳属(Salix),是我国重要
的生态和经济树种。杞柳主要分布于我国东北的北部和东南部 ,河北燕山北部 ,朝鲜 、日本也有分布;簸
箕柳主要分布在北起辽宁中南部 ,南至长江流域 ,东自山东半岛 ,西至甘肃东南部 [ 1-4] 。杞柳和簸箕柳均
1年生时就能开花结实 ,是进行林木遗传学研究的好材料。由于柳属树种天然变异丰富 ,有性和无性繁
殖均容易 ,且种间易杂交 ,因而根据表型差异难以区分不同层次变异的遗传材料 。
SSR(SimpleSequenceRepeat,微卫星)标记是目前构建指纹图谱比较理想的分子标记[ 5] 。由于柳
树中目前能运用的 SSR标记数量少 ,不能满足研究的需要 ,因此采用从近缘属杨属(Populus)中筛选
SSR标记 ,对实验室收集的 、拟作为杂交亲本的 78个杞柳和 19个簸箕柳个体(无性系)进行指纹图谱的
构建与分析 ,旨在建立杞柳和簸箕柳的杂交亲本指纹档案 ,为后续遗传学研究奠定基础。
1　材料与方法
1.1　材料
试验材料包括两部分:(1)来自东北林业大学帽儿山实验林场的 78个杞柳个体(该材料采自帽儿
山杞柳自然群体 。分两批采集 ,第 1批共 27个个体即 1 ～ 27, 2000年冬采集于场部后山;第 2批共 51
个个体即杞柳 28 ～ 78, 2001年冬采集于进入场部的道路两侧)。 (2)来自江苏苏州 、徐州及山东临沂的
19个簸箕柳农家品种 ,其中苏州的 2个品种(P1、P2)由江苏林科院提供;徐州的 12个品种(S1 ～ S12)
和临沂的5个品种(L1 ～ L5)由实验室收集。所有研究材料均栽植在南京林业大学实验苗圃中 。
研究中使用的 SSR引物信息来源于 PopulusMolecularGeneticsCooperative(htp://www.ornl.gov/
sci/ipgc/ssr-resource.htm, USA),由上海博亚生物技术有限责任公司合成。
1.2　总 DNA的提取及 SSR-PCR扩增反应
采用改进的 CTAB裂解-硅珠吸附法从新鲜柳树叶片中提取总 DNA[ 6-7] 。
反应总体积为 10 μL,其中包括 20 ng左右的 DNA模板 、 25 mmol/LMgCl2、 200 μmol/LdNTP、
0.5μmol/LPrimer(R＆F)、1.0U(5U/μL)TaqDNA聚合酶(中国农业大学生产)、10×PCR缓冲液(Tris-
Cl100mmol/L, pH8.0, KCl500mmol/L,明胶 0.01%)和灭菌 ddH2O。
PCR反应程序:94℃ 30s, 60℃ 30s(以后每个循环降低 0.7℃), 72℃ 1min,共 15个循环 ,然后
94℃ 30s, 49.5℃ 30s, 72℃ 1min,共 14个循环 ,最后 72℃延伸 8min, 4℃保存 [ 8] 。扩增产物采用 8%变
性聚丙烯酰胺凝胶(PAGE)电泳 、银染 、拍照 。
1.3　数据统计与分析
用小源凝胶成像系统(上海小源科技有限公司)对所得的图片进行判读。以 POPGENE32[ 9]软件计
算观察等位基因数目(A)、有效等位基因数目(Ne)、Shannon多样性指数(I)。利用 MricrosoftVisio绘图
工具绘制指纹图谱。
2　结果与分析
2.1　引物筛选
对 496对由杨树中开发的 SSR引物进行初筛 ,从中选出 210对有产物 、主带明显的引物。引物的通
用性达 42.34%,与 Tuskan等认为杨树 SSR引物在柳树中的同源性在 30% ～ 50%的研究结论相符[ 10] 。
再经过复筛 ,共选出 23对多态性较好的引物。
引物适用概率很低 , 只有 4.64%, 低于李淑娴等将水稻 SSR引物应用于竹子的适用概率
(19.15%)[ 11] ,其主要原因可能是该研究的对象仅为 2个近缘种的部分个体 ,而李淑娴等研究了不同属
的多个竹种 。此次筛选出的 23对 SSR引物在所研究的杞柳中均扩增出多态条带 ,但在簸箕柳中却有 4
个 SSR标记未发现多态 。
2.2　指纹图谱的构建
2.2.1　不同 SSR标记的效率
SSR标记在指纹图谱构建中的效率与其在研究对象中的多态性关系密切 ,一般多态性高的标记效
率较高 。 23对引物(表 1)可检测到 2 ～ 11个等位基因 ,平均 4.39个。其中用引物 ORNL-312检测到
11个等位基因 ,并在 18个杞柳个体具有特异谱带 ,可以将杞柳的 18个个体区分开来(图 1);用引物
ORNL-308扩增出 9个等位基因 ,在 5个杞柳个体和 1个簸箕柳品种中具有特异谱带 ,同时可以将不同
年份采集的杞柳材料(1 ～ 27与 28 ～ 78)区分开来;用引物 ORNL-464可区别簸箕柳的 4个品种并与其
他簸箕柳品种区分开来。有些品种的特异标记不止 1个 ,如簸箕柳 L1既可用 ORNL-282与其他个体
相区别 ,又可用 ORNL-409或 ORNL-410、ORNL-448、 ORNL-464、ORNL-149加以区分 。
2.2.2　柳树指纹图谱的核心标记
除来自徐州的 2个簸箕柳品种(S11和 S12)间不能区分外 , 23对引物能区分其他所有杞柳个体
(78个)和簸箕柳品种(18个)。其实 ,少于 23对引物也能区分它们 ,但至少从中选取 ORNL-308、ORNL-
312、ORNL-464等共 16对多态性较好的引物 ,才能有效地区分所有不同的个体(品种),构成扩增条带组
2 南 京 林 业 大 学 学 报 (自 然 科 学 版)　　　　　　　　　　　　第 32卷　
表 1　SSR引物序列
Table1　SequencesofSSRprimers
引物名称
Locus
name
引物序列(5 -3 )
Primerseq(5 -3 )
核心序列
SSRmotif
序列期望
长度 /bp
Expected
product
length
等位基
因 /bp
Alleles
size
range
等位基
因数目
No.of
alleles
引物名称
Locus
name
引物序列(5 -3 )
Primerseq(5 -3 )
核心序列
SSRmotif
序列期望
长度 /bp
Expected
product
length
等位基
因 /bp
Alleles
size
range
等位基
因数目
No.of
alleles
ORNL-063 F:TTCTTTCTGCCGATTACACTGAR:TACTCACATTTCCGGTGTGC [AT] 4 218 216 ～ 234 3
ORNL-068
F:CCAAAAAGCAAGGGATGAAC
R:GGGAAAGTGCCTAAAGCAAA [GA] 6 205 216 ～ 240 3
ORNL-085 F:AGTTGCTGTGGAGGAGATGGR:AATCGCTCTTCAGTCATCTTG [GA] 4+[GA] 4 194 199 ～ 216 2
ORNL-119 F:GGAATCCATCATTCTTTTCCAR:GGGCTGCAGTATCCCATATC [CTT] 5…[CA] 7 251 231 ～ 269 6
ORNL-122 F:CAAAACAAGAGAAGAGGTGGAAR:CAGATAAGGTCGGTGTTTTTGA [AT] 4＊ 188 198 ～ 220 3
ORNL-126
F:GCCGAAGTTGACGATAGCTC
R:GAGTTAAACCCACCCTGCAA [CT] 4CCT 201 188 ～ 230 4
ORNL-140 F:GAAGCTGGGTAAGAGCCAAAR:TAATGCCCGTAACCTTCGAG [CA] 4＊ 188 177 ～ 213 6
ORNL-146 F:CAAAGGAGCTCCAACTCCAAR:TGGATGGTCAGGTTGTCAAA [TG] 4[ GA] 4 204 220 ～ 242 3
ORNL-149
F:GTCTCTGCCACATGATCCAA
R:CCCGAAATGGATCAAACAAG [AT]…[ CT] 4 216 213 ～ 242 4
ORNL-166 F:TCATTGGAGCACAAGACACCR:GGAGAAGCCTGTTTCCTCAA [ CT] 5 200 214 ～ 242 2
ORNL-191 F:GCAAGTTGTTAAACCTATAGCCAATR:TGTCAGAGGGAAGTTGGTGA [ AT] 17 177 260 ～ 293 3
ORNL-211
F:AGCTAAAAGCTTTGCGGTTG
R:GCAAAGTTGCACATGGAAGA [ CA] 4AT[ CA] 4 201 211 ～ 227 3
ORNL-216 F:CCTCACCTAGCTGAATCCAAAR:ACACGACTGGGACATTGTGA [CT] 4 196 190 ～ 202 5
ORNL-217
F:ATTGGCCACATACGGCTTAC
R:AGGCAAAATCAGGATCTCCA [TC] 6 201 301 ～ 389 7
ORNL-282 F:AGAACCCCTTGCTTTTTGGTR:GACTCTGGCCCATGCATTAT [ GA] 4 205 193 ～ 224 4
ORNL-301 F:CAAAGATGGTGACTGGATGCR:AGCCTATTGCTTCCGATCCT [CT] 5 201 200 ～ 257 7
ORNL-302 F:GATCGGAAGCAATAGGCTTGR:CTTCCAGTCCAATTGTGGAAA [TC] 4 185 173 ～ 200 5
ORNL-308
F:TCCCAATATGGTCCACCAAC
R:CCCCGGAATAGTGTCTTGTG [CTA] 4 198 182 ～ 237 9
ORNL-312 F:GTGGGGATCAATCCAAAAGAR:CCCATATCAAACCATTTGAAAAA [CCT] 6 194 185 ～ 236 11
ORNL-409 F:GCAGTTTGTGACACCCTCAAR:TGCCGGTATAGCTCTTCGTC [TG] 6 180 165 ～ 211 4
ORNL-410
F:TGCTTTCCATTCCTTTGCTT
R:TGAAGTCTTGTGAGCTGAAAGTG [ CCCT] 4 202 165 ～ 196 3
ORNL-448 F:CGGGCTGCAGATTTTGTTTAR:TCTGCAACTCCAACAAATGG [ GAA] 4 258 283 ～ 303 5
ORNL-464 F:GGGCTGCAGTATCCCATATCR:TCCTCCTCCCTCCCTCTCT [TG] 7 203 205 ～ 232 5
图 1　引物 ORNL-312对杞柳部分样本的扩增图谱
Fig.1　ThefingerprintofS.intagrawiththeprimerORNL-312
图中 6、8、 11、 14、15、16、 17、 20、21、22、 24、25、26、27、 30、38、45和 46共 18个杞柳个体具有特异谱带;M.Marker(bp)
合的指纹 ,这 16对引物可视为区分所有柳树个体的核心引物 。利用这 16对核心引物绘制的指纹图谱
建立了一份适用于杞柳和簸箕柳个体真实性鉴别的指纹档案 。
2.2.3　指纹图谱分析
(1)杞柳指纹图谱分析 。利用引物 ORNL-146可以进行杞柳和簸箕柳种间区分 , ORNL-308可以
进行杞柳种内的区分 ,可将杞柳分为两部分 ,即杞柳 1 ～ 27和杞柳 28 ～ 78,这恰好与采集的两批实验材
料相对应。 ORNL-119等 6对引物在杞柳 1 ～ 27中没有扩增出多态位点 ,没有鉴别能力。 ORNL-312、
ORNL-301等 9对引物可将杞柳 1 ～ 27完全区别开 ,为鉴别这 27个个体的核心引物 ,利用这 9对引物
可以绘制鉴别杞柳 1 ～ 27的指纹图;而 ORNL-312、 ORNL-308等 5对引物可将其余 51个杞柳个体(杞
柳 28 ～ 78)完全区分开 ,为鉴别这 51个个体的核心引物(图 2、表 2)。
3　第 2期　　　　　　　　　　　　王源秀 ,等:杞柳和簸箕柳候选杂交亲本 SSR指纹分析
图 2　51杞柳个体(28 ～ 78号)的 SSR-DNA指纹图谱
Fig.2　Thefingerprintingsof51 S.intagra(No.28 to78)
表 2　鉴别杞柳和簸箕柳的核心标记
　Table 2　 ThecoreSSR markersofS.intagraandS.
suchowensis
引物对
Locus
等位基因数 No.ofaleles 核心标记 CoreSSRmarkers
A A杞柳 A簸箕柳 杞柳1～ 27 杞柳28 ～ 78 杞柳1～ 78 簸箕柳
ORNL-63 2 2 ★ ★ORNL-68 3 3 2ORNL-85 2 2 2 ★ORNL-119 6 4 3
ORNL-122 3 3 2 ★ORNL-126 4 4 3 ★
ORNL-140 6 4 4 ★ ★ ★ORNL-146 3 3 ★ ★
ORNL-149 4 3 3 ★ ★ ★ORNL-166 2 2
ORNL-191 2 2ORNL-211 3 3 2 ★ ★
ORNL-216 3 2 2ORNL-217 7 7 2 ★ ★ ★
ORNL-282 4 4 3 ★ ★ORNL-301 7 6 3 ★ ★ ★
ORNL-302 4 3 3ORNL-308 9 8 2 ★ ★ORNL-312 11 11 3 ★ ★ ★ORNL-409 5 3 4 ★ORNL-410 3 3 3 ★ ★ORNL-448 3 2 3ORNL-464 5 4 5 ★
　　鉴别杞柳 1 ～ 27至少需要 9对 SSR引物 ,而杞柳 28 ～ 78只需 5对引物就可被区分 ,说明杞柳 1 ～ 27
实验材料个体之间的亲缘关系较近 ,不易区分 。而杞柳 28 ～ 78这批实验材料个体间的亲缘关系较远 ,
易于鉴别。 ORNL-312、 ORNL-301、ORNL-308等 11对引物可把所有 78个杞柳杂交亲本完全区分开 ,
为鉴别杞柳 78个杂交亲本的核心引物(表 2)。
(2)簸箕柳指纹图谱分析 。所筛选的 23对引物在杞柳中均具有多态性 ,而在簸箕柳中只有 19对引物
具有多态性 , ORNL-146、 ORNL-166等 4对引物
在簸箕柳中没有扩增出多态位点。 19个具多态
位点的引物中 ,仅需 ORNL-464、ORNL-140等 7
对引物便可将 19个簸箕柳个体区分开(表 2)。
临沂的 5个簸箕柳个体中有一个个体(L1)
所产生的 DNA指纹明显区别于其他 17个簸箕
柳个体 ,因此该样本最易区分。苏州的两个个体
可以通过引物 ORNL- 464产生的 DNA指纹与
其他簸箕柳相区分。临沂的其他 4个簸箕柳个
体和徐州的 12个簸箕柳个体产生的 DNA指纹
中 ,没有引物可以将它们一次性区分 ,说明临沂
的这 4个个体和徐州的 12个个体的亲缘关系比
较近 ,较难区别 。但 ORNL-464、ORNL- 140和
ORNL- 308 或 ORNL- 410 或 ORNL- 409 或
ORNL-312等 3对引物产生的指纹组合 ,可以将
其区分为两类。
鉴别 19个簸箕柳个体的 7对核心引物中 ,
ORNL- 140 、ORNL- 409、ORNL- 126、 ORNL-
122、 ORNL-85 、ORNL-149等 6对引物在区分
徐州的 12个个体时都必须用到 ,说明徐州的 12
个杂交亲本的亲缘关系很近 ,鉴别较困难 。
4 南 京 林 业 大 学 学 报 (自 然 科 学 版)　　　　　　　　　　　　第 32卷　
2.3　柳树杂交亲本的遗传多样性
用 23对 SSR引物共检测到 101个等位基因 ,不同引物检测出的多样性差别很大 , Shannon多样性
指数从 0.137 1(ORNL-216)到 2.182 3(ORNL-312),平均为 1.830 8。说明不同的位点对基因多样度
的贡献不同 ,所以选择合适的 SSR引物进行多样度分析非常重要 ,同时应该用较多的 SSR位点进行分
析以减少误差。
杞柳中 23个 SSR多态位点共检测到 88个等位基因 ,每一位点的有效等位基因数为 1.039 2 ～
8.718 9,平均为 2.13,平均基因多样性为 0.772;而簸箕柳中 19个 SSR多态位点检测到的等位基因数
明显少于杞柳 ,只有 54个 ,仅为杞柳的 61.34%,每一位点的有效等位基因数为 1.110 8 ～ 2.464 2,平均
为 1.634 5;平均基因多样性为 0.554 1。从 78个杞柳个体中随机抽取 19个 ,其产生的单个 SSR多态位
点的平均有效等位基因数和平均基因多样性分别为 1.964 3和 0.697 7,两者都高于簸箕柳的 ,由此可见
杞柳种内遗传多样性高于簸箕柳。
3　讨　论
2个亲本群体的遗传变异水平存在差异 。杞柳每位点的有效等位基因数及遗传多样性均高于簸箕
柳 ,这是由于杞柳 78个个体都来自于有性繁殖的自然群体 ,而簸箕柳 19个品种均为无性系品种 ,是人
们在生产实践中选择优良个体无性繁殖形成的 ,在这些地区栽培的品种可能起源于亲缘关系较近的一
些个体 。亲本群体遗传变异的大小影响到亲本的选择 。遗传变异水平较高的杞柳亲本群体 ,为今后杂
交亲本的选择提供了较广阔的基础 ,而簸箕柳较低的遗传多样性使之作为亲本的选择有局限性 ,在今后
的工作中还应加强簸箕柳种质资源的收集 。
SSR标记具有丰富的多态性[ 12] 。尽管该研究的 2个亲本群体(尤其是簸箕柳)具有相似的遗传背
景 , SSR标记仍然可以检测到较高水平的多态性 。从杨树 SSR标记中筛选出 23对引物 ,共检测到 101
个等位基因 ,每对引物可以检测到 2 ～ 11个数目不等的等位基因 ,用 16对多态性好的引物就可以区分
所有的杞柳和簸箕柳杂交亲本 。来自徐州的 2个簸箕柳品种(S11和 S12)出现了相同的指纹 ,究其原
因 ,可能由于现有栽培的簸箕柳一般为农家品种 ,在民间传播推广 ,加之品种名称不规范 ,同一无性系也
会出现 2个或 2个以上品种名称 。当然 ,也不排除现有的 23个标记不能区分这两个品种的可能 。因此
可以增加新的 SSR标记来进一步检测 。
不同 SSR标记的效率有很大差异 ,有的标记可区分 2个种(ORNL-146),有的可区分杞柳的 2个群
体(ORNL-308),甚至 1个标记可区分 18个杞柳个体(ORNL-312),而大部分标记不存在多态。笔者
利用 16对核心标记能获得 2个亲本群体的指纹图谱 ,尤其 ORNL-312和 ORNL-308等标记是今后进
行杞柳和簸箕柳的遗传多样性 、指纹图谱 、遗传图谱 、基因定位等研究的较理想的标记 。
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(责任编辑　郑琰燚)
5　第 2期　　　　　　　　　　　　王源秀 ,等:杞柳和簸箕柳候选杂交亲本 SSR指纹分析