全 文 ： 中国现代应用药学 2014 年 7 月第 31 卷第 7 期 Chin J Mod Appl Pharm, 2014 July, Vol.31 No.7 ·777·
·论 著·

醉香含笑树皮提取物诱导 HepG2细胞凋亡的作用机制

宋晓凯 1，曹志凌 1，郭雷 1，李志华 1,2(1.淮海工学院，江苏 连云港 222005；2.中国矿业大学，江苏 徐州 221116)

摘要：目的 探讨醉香含笑树皮提取物(extrat of barks of Michelia macclurei Dandy.，EBMMD)诱导人肝癌细胞 HepG2凋
亡的作用及相关机理。方法 采用倒置生物显微镜、流式细胞仪、Western-blotting 等技术，考察 EBMMD 对 HepG2 细
胞凋亡及 COX-2 蛋白表达的影响。结果 流式细胞术分析可见，EBMMD 能明显诱导 HepG2 细胞凋亡，且呈浓度依赖
关系；倒置生物显微镜观察可见细胞凋亡的形态学改变；随 EBMMD浓度增高，细胞内 COX-2蛋白的表达逐渐减少，且
当 EBMMD浓度达 25.00 μg·mL−1时，能明显抑制 COX-2蛋白表达。结论 EBMMD可以明显诱导 HepG2细胞凋亡，其
作用机理可能与下调细胞内 COX-2蛋白表达进而诱导其凋亡有关。
关键词：醉香含笑树皮提取物；人肝癌细胞 HepG2；凋亡诱导机制
中图分类号：R285.5 文献标志码：A 文章编号：1007-7693(2014)07-0777-04
DOI: 10.13748/j.cnki.issn1007-7693.2014.07.001

Effect and Possible Mechanism of the Extract of Barks of Michelia Macclurei Dandy. on
Apoptosis-inducing in HepG2 Cells

SONG Xiaokai1, CAO Zhiling1, GUO Lei1, LI Zhihua1,2(1.Huaihai Institute of Technology, Lianyungang 222005, China;
2.China University of Mining and Technology, Xuzhou 221116, China)

ABSTRACT: OBJECTIVE To explore the effect and possible mechanism of the extract of barks of Michelia macclurei
Dandy.(EBMMD) on apoptosis-inducing in HepG2 cell lines in vitro. METHODS The effect of apoptosis-inducing of
EBMMD on HepG2 cell lines and expression of COX-2 protein were explored by inverted microscope and flow cytometry assay
as well as Western-blotting assay. RESULTS The apoptosis-inducing of EBMMD on HepG2 cells was observed in
concerntration-dependent manner by flow cytometry, and the cell morphology change was observed by inverted microscope.
EBMMD showed growing inhibitory effects on the expressions of COX-2 protein in concerntration-dependent manner and
significant inhibitory effect on the expression of COX-2 protein at a high concentration(25.00 μg·mL−1) . CONCLUSION
EBMMD can significantly induce HepG2 cells apoptosis, the possible mechanism may relate to downregulate the expression of
COX-2 protein to induce apoptosis.
KEY WORDS: extrat of barks of Michelia macclurei Dandy.; HepG2 cells; apoptosis-inducing mechanism


基金项目：国家自然科学基金资助项目(20872110)
作者简介：宋晓凯，男，博士，教授 Tel: (0518)85895408 E-mail: sxk581214@163.com
醉香含笑(Michelia macclurei Dandy.)又称火
力楠，木兰科含笑属常绿乔木，系我国特有植物，
分布于我国福建、广西、广东及贵州等省。其花
可提炼芳香油，树皮、根、叶可作药用，有清热
解毒之功效，种子油可作燃料用油[1-2]。目前，除
本课题组先后报道的该植物树皮、根皮挥发性成
分组成和对人肝癌细胞 HepG2、小鼠成纤维细胞
NIH3T3 生长抑制作用研究结果[3-4]，及国内学者
关于醉香含笑叶挥发油化学成分方面的报道外[5]，
未见其他报道。
本研究在本课题组已证实醉香含笑树皮对人
肝癌细胞 HepG2 具有生长抑制作用及细胞形态学
改变作用等研究基础上[3]，进一步研究了该植物树
皮提取物诱导人肝癌细胞 HepG2 凋亡的相关机
理，尤其对 COX-2 蛋白表达的影响进行了研究，
为深入开发醉香含笑植物资源提供了科学依据。
1 仪器与试药
流式细胞仪(美国 Becton Dicknson 公司)；CO2
培养箱(日本 Sanyo 公司)；酶标定量测定仪(美国
Bio-Rad 公司 )；倒置显微镜 (Olympus 公司 )。
RPMI-1640 培养基(Gibco 公司)；小牛血清(杭州四
季青生物制品厂)；人肝癌细胞 HepG2(南京凯基生
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物科技有限公司)；Annexin V/PI 双标试剂盒(南京
凯基生物科技有限公司，批号：KGB510)。
醉香含笑全株植物于 2011 年 7 月采自浙江省
金华市金西花木场，经淮海工学院宋晓凯教授鉴
定 为 木 兰 科 含 笑 属 植 物 醉 香 含 笑 Michelia
macclurei Dandy.。
2 方法与结果
2.1 醉香含笑树皮提取物的制备及分组
醉香含笑树皮醇提取物的制备：称取醉香含
笑树皮 1.1 kg，自然晾干后，剪碎，先后分 4 批置
于 2 000 mL 圆底磨口烧瓶中，加入 1 000 mL 95%
乙醇，以玻璃塞封闭圆底烧瓶口，浸泡 48 h；接
回流提取装置，以恒温电热套加热至沸腾，开始
计时，沸腾持续 1.5 h 后，用 4 层纱布封住瓶口，
滤出各批提取液。再加入 95%乙醇，加入量以淹
过树皮为准，再加热提取 1 次，时间仍为 1.5 h。
合并 2 次粗提液，用中速定性滤纸、循环水式多
用真空泵抽滤，滤除粗提取液中的杂质颗粒，再
用旋转蒸发仪浓缩抽滤液，水浴烘干后，制成醉
香含笑树皮醇提取物(extrat of barks of Michelia
macclurei Dandy.，EBMMD)湿浸膏，放入烘箱烘
烤 8 h，制成干浸膏共 87.69 g，4 ℃冰箱冷藏备用。
精确称取醉香含笑树皮干浸膏 200.0 mg，用
100 mL 三蒸水稀释并以 DMSO 使其充分溶解，配
成 2 mg·mL−1 EBMMD，用 0.22 μm 的微孔滤膜滤
过除菌，作为母液置于 4 ℃冰箱备用。
实验组分别为各终浓度 EBMMD(6.25，12.50，
25.00 μg·mL−1，依次为低、中、高浓度组)，于 4 ℃
保存；阴性对照组培养液(未经 EBMMD 处理组)
为含 10%胎牛血清的 RPMI-1640 培养基，其中
DMSO 终浓度<0.1%。
2.2 细胞培养及细胞悬液的制备
人肝癌细胞 HepG2 培养于含 10%新生牛血清
的 DMEM 培养液中，置 37 ℃、5% CO2 的培养箱，
取对数生长期细胞用于实验。
2.3 流式细胞仪分析细胞凋亡
收集未处理及以不同浓度EBMMD处理 72 h后
的 HepG2 细胞(细胞数为 1.0×106个)，12 000 r·min1
离心 10 min，弃上清，以 PBS 缓冲液清洗 2 次。
用双蒸水 1∶4 稀释结合缓冲液，PBS 洗涤样
品细胞后，以稀释的结合缓冲液重悬细胞，并调
整细胞浓度为 2×105~5×105·mL−1。取 195 μL 细
胞悬液，加入 5 μL Annexin V 混匀，室温反应
10 min，PBS 洗细胞一次，再以 190 μL 稀释的结
合缓冲液重悬，按 Annexin V/PI 双标试剂盒说明
书操作，依次加入 RNA 酶和溴化乙啶(PI)染色，
室温避光放置 30 min，过 400 目筛网，用流式细
胞仪分析，激发波长 488 nm 测定细胞凋亡率，采
用 Cellquest 软件分析结果。
2.4 Western-blotting 考察 EBMMD 对 HepG2 细
胞 COX-2 蛋白表达的影响
取复苏后传代至第 2~3 代细胞接种于培养皿
中，待细胞长到 70%~80%时换无血清 DMEM 培
养 24 h。药物处理组分别为各终浓度 EBMMD
(6.25，12.50，25.00 μg·mL−1)，阴性对照组为含 10%
胎牛血清的 RPMI-1640 培养基。收集经 EBMMD
处理 72 h 的细胞，冰预冷 PBS 洗 2 次，加入 100 μL
细胞裂解液提取蛋白。以 10% SDS-聚丙烯酰胺凝
胶电泳分离蛋白。40 mA 电流强度电泳 120 min。
电泳后以 400 mA 转膜 3 h。5% TBS 脱脂奶粉封闭
液封闭 30 min，TBS 液清洗 1 次，每次 5 min；转
印至硝酸纤维素膜后，依次加小鼠抗人 COX-2 单
抗和辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠二抗孵育，ECL
显色(A 液 B∶ 液=1 1)∶ 。以 β-actin 作为内参照，
X 光片灰密度比值作为蛋白半定量相对值。试验
重复 3 次。
2.5 统计学处理
实验数据采用 sx  表示，应用 SPSS 17.0 软
件，采用方差分析，以 P<0.05 为差异有统计学意
义，P<0.01 为差异有显著统计学意义。
2.6 结果
2.6.1 EBMMD 对 HepG2 细胞形态的影响 在倒
置显微镜下，对照组 HepG2 细胞大小均匀，细胞
核呈圆形或椭圆形，细胞膜完整、轮廓明显，核
仁清晰，细胞间连接紧密，在普通光镜下透明度
强，结果见图 1A。经 EBMMD 处理后的细胞生长
状态较差，随 EBMMD 浓度增加及作用时间延长，
可见到明显细胞凋亡形态学改变。6.25 μg·mL−1
EBMMD 处理 HepG2 细胞 72 h，细胞间隙增宽，
底色模糊，结果见图 1B；12.50 μg·mL−1 的 EBMMD
处理 72 h 后细胞体积变小、变形，胞质颗粒增多，
见空泡，胞核浓缩，少许漂浮细胞，结果见图 1C；
25.00 μg·mL−1 EBMMD 处理 HepG2 细胞 72 h，大
部分贴壁细胞出现皱缩、变圆、脱落呈悬浮状，
存活细胞减少，出现大量细胞碎片，结果见图 1D。
2.6.2 EBMMD 对 HepG2 细胞凋亡的影响 流式
中国现代应用药学 2014 年 7 月第 31 卷第 7 期 Chin J Mod Appl Pharm, 2014 July, Vol.31 No.7 ·779·
细胞仪检测 HepG2 细胞凋亡率发现，经 EBMMD
(6.25~25.00 μg·mL−1)干预后，均可诱导 HepG2 细
胞发生凋亡，细胞凋亡率随作用时间的延长和
EBMMD 浓度加大而逐渐明显增加，6.25，12.5，
25.00 μg·mL−1 EBMMD 凋亡百分率分别为 10.60%，
44.70%，80.30%，结果见图 2。

A B C D
图 1 EBMMD对 HepG2细胞形态的影响(EBMMD处理 72 h)(400×)
A阴性对照组；BEBMMD 低浓度组；C EBMMD 中浓度组；DEBMMD 高浓度组
Fig. 1 Effects of EBMMD on morphology change of HepG2 cells (treatment of EBMMD for 72h) ( 400×)
Anegative control groupBEBMMD low concentration groupCEBMMD middle concentration groupDEBMMD high concentration group

图 2 不同浓度 EBMMD对 HepG2细胞凋亡的影响
A阴性对照组；BEBMMD 低浓度组；C EBMMD 中浓度组；DEBMMD 高浓度组
Fig. 2 Effects of different concentrations of EBMMD on apoptotic rate of HepG2 cells
Anegative control groupBEBMMD low concentration groupCEBMMD middle concentration groupDEBMMD high concentration group
2.6.3 EBMMD对 HepG2细胞 COX-2蛋白表达的
影响 Western-blotting 结果显示，不同浓度
EBMMD 对 HepG2 细胞作用 12，24，48 h 后，
COX-2 蛋白表达随着药物浓度和时间增加而减
弱，呈浓度和时间依赖性，25 µg·mL1 的 EBMMD
对 COX-2 蛋白表达有明显抑制作用，结果见图 3。

图 3 不同浓度 EBMMD对 HepG2细胞 COX-2蛋白表达
的影响
1阴性对照组；2紫杉醇组；3~5EBMMD 6.25 μg·mL1 处理 12，24，
48 h；6~8EBMMD 12.5 μg·mL1 处理 12，24，48 h；9~11EBMMD
25 μg·mL1 处理 12，24，48 h
Fig. 3 Effects of different concentrations of EBMMD on
the expression of COX-2 protein in HepG2 cells
1negative group; 2taxol group; 35EBMMD 6.25 μg·mL1 treated for
12, 24, 48 h; 68EBMMD 12.5 μg·mL1 treated for 12, 24, 48 h;
911EBMMD 25 μg·mL1 treated for 12, 24, 48 h
3 讨论
本课题组前期研究表明，EBMMD 可显著抑
制人肝癌细胞 HepG2 生长，其作用具有一定量效
关系 [3]。本次研究发现，不论是 EBMMD 诱导
HepG2 细胞凋亡，还是抑制 HepG2 细胞中 COX-2
蛋白表达，均呈现药物浓度和时间依赖性。即当
低浓度 EBMMD 处理时，诱导 HepG2 细胞凋亡和
抑制细胞中 COX-2 蛋白表达作用均不明显。随着
EBMMD 浓度逐渐升高，HepG2 细胞凋亡率呈上
升趋势，对 COX-2 蛋白表达的抑制作用也逐渐明
显，25 µg·mL1 EBMMD 能明显抑制 HepG2 细胞
中 COX-2 蛋白表达。由此表明，EBMMD 有可能
通过抑制COX-2蛋白表达途径诱导HepG2细胞凋
亡，提示 EBMMD 对人肝癌细胞 HepG2 的抑制作
用与 COX-2 途径有关，并推测 EBMMD 有可能是
通过诱导 HepG2 细胞凋亡而产生对细胞的生长抑
制作用。
致谢：文中部分实验内容由南京凯基生物科技发展有
限公司协助完成，在此致谢。
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Dandy. [J]. Guangxi Forest Sci(广西林业), 2005(4): 42-43.
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China [J]. J Cent South Forest Univ(中南林学院学报), 2004,
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inhibition on in vitro growth of HepG2 cells [J]. Chin Tradit
Herb Drugs(中草药), 2011, 42(11): 2213-2215.
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roots of Michelia Macclurei Dandy. and growth inhibition of
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[5] HUANG R Z, TAN D F, ZHENG Y S, et al. Chemical
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macclurei Dandy. [J]. J Trop Subtrop Bot(热带亚热带植物学
报), 2009, 17(4): 406-408.
收稿日期：2013-10-10



冰片鸦胆子油纳米乳的制备及对大鼠脑胶质瘤的抑瘤作用研究

吕长江 1，张蓉蓉 2，周军 2，李颖芳 2，王国伟 2，李范珠 2*(1.杭州市红十字会医院，杭州 310003；2.浙江中医药大学药学
院，杭州 310053)

摘要：目的 筛选和优化冰片鸦胆子油纳米乳处方，制备冰片鸦胆子油纳米乳，并初步考察其对大鼠脑胶质瘤的抑瘤作
用。方法 通过柱前衍生化处理，建立 GC测定鸦胆子油中油酸含量的分析方法；采用转相法制备冰片鸦胆子油纳米乳；
绘制伪三元相图，筛选最佳处方；透射电子显微镜观察外观形态、激光粒度仪测定粒径分布和 Zeta电位；构建大鼠脑胶
质瘤模型，以瘤重和瘤体积变化为指标，初步考察冰片鸦胆子油纳米乳对大鼠脑胶肿瘤的抑瘤作用。结果 建立了 GC
测定鸦胆子油中油酸含量的分析方法，筛选冰片鸦胆子油纳米乳最佳处方为油相肉豆蔻酸异丙酯 35%，鸦胆子油(含 1%
冰片)35%，乳化剂 Cremopher RH40 18%，Labrasol 12%，纳米乳外观呈圆整球形，平均粒径(47.60±0.57)nm，PDI 为
(0.22±0.01)，Zeta电位为(1.06±0.12)mV，载药量(0.424 1±0.005 6)mg·mL1。抑瘤实验显示，模型组、鸦胆子油注射剂组、
鸦胆子油纳米乳组和冰片鸦胆子油纳米乳组的瘤重分别为(1.32±0.19)，(0.84±0.08)，(0.76±0.06)和(0.57±0.10)g，肿瘤体积
分别为(72.2±9.4)，(44.2±5.1)，(42.3±4.9)和(27.9±2.5)mm3，鸦胆子油注射剂组、鸦胆子油纳米乳组和冰片鸦胆子油纳米
组的肿瘤抑制率分别为 36.49%，42.80%和 56.94%。结论 所筛选的最佳处方采用转相法制备冰片鸦胆子油纳米乳，粒
径分布均匀，油酸含量较高，稳定性较好。同时冰片鸦胆子油纳米乳对大鼠胶质瘤相对具有较强的抑瘤作用，初步推断
冰片可能促进鸦胆子油跨过血脑屏障来提高抑瘤作用。
关键词：鸦胆子油；冰片；纳米乳；伪三元相图；脑胶质瘤
中图分类号：R943；R965.2 文献标志码：A 文章编号：1007-7693(2014)07-0780-07
DOI: 10.13748/j.cnki.issn1007-7693.2014.07.002

Preparation of Borneol and Brucea Javanica Oil Nanoemulsion and Tumor Suppression Effect on
Glioma in Rats

LÜ Changjiang1, ZHANG Rongrong2, ZHOU Jun2, LI Yingfang2, WANG Guowei2, LI Fanzhu2(1.Hangzhou Red
Cross Hospital, Hangzhou 310003, China; 2.Zhejiang Chinese Medicine University, College of Pharmaceutical Science,
Hangzhou 310053, China)

ABSTRACT: OBJECTIVE To selecte and optimize the prescription of borneol and Brucea javanica oil nanoemulsion
(BBNE), and to prepare the BBNE, then to investigate its tumor suppression effect on glioma in rats. METHODS Establishing
the GC analysis methods to determinate BBNE content by pre-column derivatization; applying the techniques of phase inversion
to prepare BBNE; selecting and optimizing the prescription of BBNE by pseudo-ternary phase diagrams; using transmission
electron microscope and laser granulometer to investigate the appearance shape, determination of particle size distribution and
Zeta potential; building glioma tumor model in rats, and investigate BBNE tumor suppression effect by the index of tumor
weight and volume. RESULTS The GC analysis method to determinate BBNE content was established successfully, the best
prescription of BBNE was oil phase IPM 35%, Brucea javanica oil (containing 1% borneol) 35%, emulsifier Cremopher RH
18% and Labrasol 12%; the appearance of nanoemulsion was round and spherical, the average particle size was (47.60±0.57)nm,
the PDI was (0.22±0.01), the Zeta potential was (1.06±0.12)mV, and the drug loading capacity was (0.424 1±0.005 6)mg·mL1;

基金项目：国家自然科学基金资助项目(81274089)；浙江省自然科学基金资助项目(LZ13H280001)
作者简介：吕长江，女，副主任药师 Tel: 18958008970 E-mail: 106433093@qq.com 通信作者：李范珠，男，博士，教授，博导
Tel: (0571)86633030 E-mail: lifanzhu@zjtcm.net