全 文 ：论著·基础研究
▲基金项目:广西医科大学青年科学基金项目(GXMUYSF09);实验室开放课题(02610212063)
作者简介 赖燕燕(1974 ～)，女，硕士，讲师，研究方向:肿瘤与天然药物的研究。
通信作者:李晓龙(1984 ～)，男，硕士，讲师，研究方向:肿瘤及肿瘤治疗，E-mail:xlonglee． chn@ outlook． com。
山竹果皮提取物对人肝癌细胞 HepG2 增殖及凋亡的影响▲
赖燕燕1 黄应雯2 黄丹玚3 伍兰岚3 罗彬尤3 李晓龙3
(1 广西卫生职业技术学院细胞生物学与遗传学教研室，南宁市 530021，E-mail:yanyanlai630@ outlook． com;
2 广西中医药大学第一附院医院办公室，南宁市 530021;3 广西医科大学，南宁市 530021)
【摘要】 目的 探讨山竹提取物对人肝癌细胞 HepG2增殖及凋亡的影响及其作用机制。方法 采用 MTT法检测不同
浓度山竹提取物对 HepG2细胞增殖的影响;分别应用 Annexin-V /PI双重染色、PI单染法检测山竹提取物对 HepG2 凋亡和细
胞周期的影响;天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-3(Caspase-3)试剂盒检测山竹提取物对HepG2细胞 Caspase-3酶活化的影响。
结果 不同浓度(100 μmol /L、200 μmol /L、400 μmol /L、600 μmol /L、800 μmol /L)山竹提取物均可抑制人肝癌细胞HepG2的增
殖活性，且随着山竹提取物浓度及其作用时间的增加，细胞抑制率升高(P ＜ 0． 05);山竹提取物浓度为 256． 67 μmol /L时可诱
导人肝癌细胞 HepG2出现早期凋亡，并且随着山竹提取物作用时间的增加，凋亡早期癌细胞的比率增高。细胞周期分析结果
显示随着山竹提取物的浓度升高(0 μmol /L、200 μmol /L、400 μmol /L、600 μmol /L、800 μmol /L)，G1 期 HepG2细胞比例升高，
而 S期细胞比例下降(P ＜0． 05)。与对照组(0 μmol /L)比较，各浓度(200 μmol /L、400 μmol /L、600 μmol /L、800 μmol /L)山竹
提取物组 HepG2细胞的 Caspase-3酶活性均升高(P ＜0． 05)，给药组的酶活力单位随给药浓度的增加而明显增加(P ＜ 0． 05)。
结论 山竹提取物对人肝癌细胞 HepG2有抑制增殖和促进凋亡的作用，其作用机制可能与抑制 HepG2 细胞进入 S期和激活
Caspase-3有关。
【关键词】 肝癌;人肝癌细胞 HepG2;山竹提取物;增殖;凋亡;细胞周期;天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-3
【中图分类号】 Ｒ 735． 7 【文献标识码】 A 【文章编号】 0253-4304(2016)04-0452-05
DOI:10． 11675 / j． issn． 0253-4304． 2016． 04． 02
Effects of mangosteen extract on proliferation and apoptosis of human hepatocellular carcinoma HepG2 cells
LAI Yan-yan1，HUANG Ying-wen2，HUANG Dan-yang3，WU Lan-lan3，LUO Bin-you3，LI Xiao-long3
(1 Department of Cytobiology and Genetics，Guangxi Medical College，Nanning 530021，China;2 Office of Hospital Affairs，the First Affiliated
Hospital of Guangxi University of Chinese Medicine，Nanning 530021，China;3 Guangxi Medical University，Nanning 530021，China)
【Abstract】 Objective To explore the effects of mangosteen extract on the proliferation and apoptosis of human hepatocellular carcinoma
HepG2 cells and its mechanism．Methods Methylthiazolyl tetrazolium(MTT)assay was used to assess the effect of mangosteen extract on the
proliferation and apoptosis of HepG2 cells with various concentrations． Annexin-V /PI double staining method and PI single staining method
were used to determine the effect of mangosteen extract on the apoptosis and cell cycle of HepG2 cells respectively． Cysteine-containing
aspartate-specific proteases-3(Caspase-3)kit was used to assess the effect of mangosteen extract on the Caspase-3 activation of HepG2
cells． Ｒesults The mangosteen extract with various concentrations(100 μmol /L，200 μmol /L，400 μmol /L，600 μmol /L and 800 μmol /L)
could inhibit the proliferative activity of HepG2 cells，and the inhibitory rate of the cells increased with the increasing concentration of drug
and duration of drug action(P ＜ 0． 05)． The mangosteen extract with the concentration of 256． 67 μmol /L could induce early apoptosis in
HepG2 cells，and the ratio of the cells in early apoptotic stage increased significantly with the increasing duration of drug action． Cell-cycle
analysis revealed that the ratio of HepG2 cells in the G1 phase increased and the ratio of the cells in the S phase reduced with the increasing
mangosteen extract concentration(0 μmol /L，200 μmol /L，400 μmol /L，600 μmol /L and 800 μmol /L)(P ＜0． 05)． Compared to the control group
(0 μmol /L)，the Caspase-3 activities of HepG2 cells in the groups with different mangosteen extract concentrations(200 μmol /L，400 μmol /L，
600 μmol /L and 800 μmol /L)increased(P ＜ 0． 05)，and the Caspase-3 activities of HepG2 cells increased with the increasing mangosteen
extract concentration(P ＜0． 05)．Conclusion Mangosteen extract can inhibit the proliferation and promote the apoptosis of human hepatocellular
carcinoma HepG2 cells． The mechanism may be related to the inhibition of HepG2 cells entrance into S phase and activation of Caspase-3．
【Key words】 Hepatocellular carcinoma，Human hepatocellular carcinoma HepG2 cells，Mangosteen extract，Proliferation，Apoptosis，Cell
cycle，Cysteine-containing aspartate-specific proteases-3
254 Guangxi Medical Journal，Apr． 2016，Vol． 38，No． 4
肝癌在我国常见肿瘤中位居第 2 位，仅次于肺
癌［1］，而我国是全球肝癌发病率最高的国家，其发病率
比西方国家高 10 倍以上。据统计，目前我国肝癌发病
人数占全球发病人数的 55%，而死亡的人数约占全世界
肝癌死亡人数的 45%［2］。手术切除是目前治疗早期肝
癌唯一有效的方法，但大多数患者就诊时已为中晚期，
手术疗效有限，因而寻找新的治疗方法尤为重要。在天
然药物中寻找具有调控细胞增殖、凋亡的化合物单体或
前体化合物，是目前国内外抗肿瘤药物研发的热点。
山竹又称山竹子、莽吉柿或凤果，是藤黄科藤黄属
常绿乔木山竹的果实。山竹果皮性凉，味苦、涩，是泰
国、缅甸、印度等东南亚国家的传统医药，山竹果皮研为
细末内服，被广泛用于治疗腹痛、腹泻、痢疾、感染性创
伤、化脓、慢性溃疡等疾病［3 － 4］;外敷可起到消炎止痛的
作用，用于治疗皮肤病，水、火烫伤尤为显效［5］。山竹果
壳含有多种氧杂蒽酮衍生物，主要包括山竹提取物
(75% ～ 85%)和 γ-倒捻子素(5% ～ 15%)，其药理作用
成为了近年来的研究热点。近期有研究表明这些氧杂
蒽酮表现出抗炎、抗肿瘤、抗氧化等多种生物活性，对多
种细菌具有抗菌作用［6］。有学者通过研究发现山竹果
皮提取物具有抗菌活性、细胞和生物毒性、酶抑制活性、
抗病毒活性、杀伤癌细胞等作用［5，7 － 12］。但山竹提取物
对肝癌 HepG2 细胞的作用及抗肿瘤机制目前尚未见报
道。本研究通过探讨山竹提取物其对肝癌 HepG2 细胞
的作用及其可能的抗肿瘤机制，为进一步研究山竹提取
物的药用价值以及其抗肿瘤作用提供参考。
1 材料与方法
1． 1 材料与仪器 山竹果皮粉由广西中医药大学第一附
属医院提供，人肝癌细胞 HepG2 由广西医科大学实验中
提供;HyClone DMEM/高糖培养基［赛默飞世尔生物化学
制品(北京)有限公司，批号:NXM0766］，胰蛋白酶 －乙二
胺四乙酸(ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA)消化液
(北京索莱宝科技有限公司，批号:T1300-100)，磷酸缓冲
盐溶液(phosphate-buffered saline，PBS;武汉博士德生物工
程有 限 公 司，批 号:AＲ0030)，四 甲 基 偶 氮 唑 盐
(methylthiazolyl tetrazolium，MTT)细胞增殖及细胞毒性检
测试剂盒(碧云天生物技术研究所，批号:C0009)，二甲基
亚砜(dimethyl sulfoxide，DMSO;Amresco 公司，批号:
302A031)，四季青无支原体胎牛血清(L 浙江天杭生物科
技有限公司，批号:130407)，Annexin V-FITC /PI 双染细胞
凋亡检测试剂盒(L 联科生物科技有限公司，批号:
2100512)，细胞周期与细胞凋亡检测试剂盒(碧云天生物
技术研究所，批号:C1052)，天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋
白酶-3(cysteine-containing aspartate-specific proteases-3，
Caspase-3)活性检测试剂盒(碧云天生物技术研究所，批
号:C1115);酶标仪(Tecan．公司，型号:Sunrise) ，流式细胞
仪(BD公司，型号:InfluxTM)，显微镜(Olympus公司，型号:
IX-51) ，台式离心机(Eppendorf公司，型号:5424)。
1． 2 实验方法
1． 2． 1 山竹提取物的制备:取 50 g 的山竹果皮干燥粉
末，溶于 500 ml 的 85%乙醇，过夜(16 h)，过滤取上清
液;旋蒸至 10 ml，用乙酸乙酯萃取，取上清液;过硅胶
柱，用正己烷和乙酸乙酯(5 ∶ 1)洗脱;得到的液体烘干，
用 DMSO溶解，置于 － 20℃冰箱冷冻保存备用［13］。
1． 2． 2 细胞培养:对肝癌 HepG2 细胞进行体外培养，基
础培养基为 HyClone DMEM /高糖培养液，加入无支原体
胎牛血清配置成含 10%无支原体胎牛血清的培养液，在
37℃、5% CO2、饱和湿度培养箱中培养，取对数生长期
细胞用于实验。
1． 2． 3 MTT法检测山竹提取物对 HepG2 细胞的生长抑
制作用:取对数生长期的 HepG2 细胞，调整细胞悬液浓
度至 1 × 105 个 /ml，接种于 96 孔板中，每孔 100 μl，在
37℃、5% CO2、饱和湿度培养箱中培养 24 h，细胞贴壁
后［14］，药物处理组加入用培养液稀释的山竹提取物，使终
浓度 分 别 为 100 μmol /L、200 μmol /L、400 μmol /L、
600 μmol /L、800 μmol /L，每孔总量 100 μl。同时设置阴
性对照组(含有细胞的培养基、MTT溶液，不含药物)和空
白对照组(含 PBS及 MTT溶液，不含药物)。各个药物处
理组及阴性对照组每组设 6 个复孔。继续培养 24 h、
48 h、72 h后，每孔加入 1 mg /ml MTT溶液 20 μl，37℃孵育
4 h后弃培养基，每孔加入150 μl DMSO振荡10 min，使结晶
物充分溶解。用酶联免疫检测仪于 490 nm波长处测定吸
光度值(A值)。按下列公式计算抑制率:肿瘤细胞抑制率
(%)=(药物处理组 A 490 nm －空白组 A 490 nm)/(阴性
对照组 A 490 nm －空白组 A 490 nm)×100%。
1． 2． 4 Annexin V-PI 法检测山竹提取物对 HepG2 细胞
凋亡的影响:取对数生长期的 HepG2 细胞，调整细胞悬
液浓度 1 × 106 个 /ml，每孔加入 2 ml，均匀铺在 6 孔板
中，在 37℃、5% CO2、饱和湿度培养箱中培养 48 h后，加
入用培养液将山竹提取物稀释至 256． 67 μmol /L(即
IC50 浓度)，每孔 2 ml，分别培养 0 h、24 h、48 h及 72 h;
将 6 孔板中的各处理组 HepG2 细胞用 0． 25%胰蛋白
酶-EDTA消化液消化，1 000 r /min 离心 5 min 后 收集细
胞;用 PBS 洗涤细胞 2 次(1 000 r /min，10 min)，收集细
胞;加入 500 μl的结合缓冲液，吹打悬浮细胞;加入 5 μl
Annexin V-FITC 混匀后，加入 10 μl碘化丙啶(propidium
iodide，PI)，混匀;在室温、避光的条件下孵育 5 min;在
1 h内采用流式细胞仪进行检测细胞凋亡情况［15］。
1． 2． 5 PI单染法检测山竹提取物对细胞周期的影响:收
集对数期 HepG2细胞，调整细胞悬液浓度 1 × 106 个 /ml，
每孔加入 2 ml，均匀铺在 6 孔板;5% CO2、37℃细胞培养
箱内孵育，至细胞单层铺满孔底，小心吸去培养液，加入用
培养液稀释的不同浓度梯度的山竹提取物(0 μmol /L、
200 μmol /L、400 μmol /L、600 μmol /L、800 μmol /L)，每孔
2 ml，复孔 6个，培养 24 h;消化收集细胞(同 Annexin V-PI
法)，用 PBS洗 1次(1 000 r /min，4 min) ，用 100 μl PBS重
354广西医学 2016 年 4 月第 38 卷第 4 期
悬，滴入预冷的 75%乙醇 400 μl，固定过夜(16 h)。离心
弃液，用 PBS洗 1 次(1 000 r /min，4 min)，用 400 μl PBS
重悬细胞，加入 PI染色液 10 μl［碘化丙啶染色液配法:染
色缓冲液 3 ml +碘化丙啶染色液(20x)150 μl + ＲNase A
(L50x)60 μl］，室温黑暗孵育 10 min，1 h内上机检测细胞
周期。
1． 2． 6 Caspase-3 的活性检测:收集对数期 HepG2 细
胞，调整细胞悬液浓度 1 × 106 个 /ml，每孔加入 3 ml，均
匀铺在 6 孔板;5% CO2、37℃细胞培养箱内孵育，至细胞
单层铺满孔底，小心吸去培养液，加入用培养液稀释的
不同浓度梯度的山竹提取物(200 μmol /L、400 μmol /L、
600 μmol /L、800 μmol /L)，每孔 2 ml，复孔 6 个，培养
24 h;消化收集细胞，用 PBS洗 1 次(1 000 r /min，4 min)，
按每 200万细胞加入 100 μl 裂解液，重悬细胞，冰浴裂解
15 min，16 000 ～20 000 g /min离心 15 min，转移上清液至
冰浴预冷的试管;空白对照组(90 μl 检测缓冲液 + 10 μl
Ac-DEVD-pNA)，样品组(80 μl 检测缓冲液 + 10 μl
Ac-DEVD-pNA +10 μl 待测样品)，37℃孵育 2 h，颜色变
化明显后上酶标仪机检测样品中 Caspase 3 催化产生的
pNA产生的吸光度。
1． 3 统计学分析 采用 SPSS 17． 0 进行统计分析，计量
资料以(x ± s)表示，多组间均数比较采用单因素方差分
析，组间两两比较采用 q 检验，以 P ＜ 0． 05 为差异有统
计学意义。
2 结 果
2． 1 山竹提取物对 HepG2 细胞的增殖抑制作用 不同
浓度药物处理组分别培养 24 h、48 h，72 h后，山竹提取物
对 HepG2细胞的增殖均具有抑制作用，且随着山竹提取
物浓度和作用时间的增加，细胞抑制率升高(P ＜ 0． 05);
山竹提取物对 HepG2细胞的生长有量 －效、时 －效关系。
见表1。24 h、48 h、72 h的 IC50值分别为 294． 90 μmol /L、
256． 67 μmol /L、178． 59 μmol /L。
2． 2 Annexin V-FITC/PI双染法检测细胞凋亡的结果 在
双变量流式细胞仪的散点图上，左下象限是活细胞，为
(FITC + /PI +);右上象限是非活细胞，即坏死细胞，为
(FITC － /PI +);而右下象限为凋亡细胞，显现(FITC + / I －)
在 HepG2 细胞组中，提示山竹提取物可引起肝癌细胞
HepG2 的凋亡。见图 1。加入用培养液稀释至浓度为
256． 67 μmol /L(IC50 浓度)的山竹提取物后，肝癌细胞
HepG2 出现明显早期凋亡;在 0 h、24 h、48 h、72 h 早期
细胞凋亡率分别为 0． 05%、11． 63%、55． 98%、73． 38%，
随着山竹提取物作用时间的增加凋亡早期癌细胞的比
率显著增高。
表 1 不同浓度山竹提取物作用下 HepG2 细胞生长抑制率的比较(x ± s，%)
山竹提取物浓度(μmol /L) n 培养 24 h后 培养 48 h后 培养 72 h后 F值 P值
100 6 21． 75 ± 5． 89* 26． 19 ± 3． 39* 30． 60 ± 1． 90＊● 17． 286 0． 003
200 6 31． 65 ± 3． 22* 44． 11 ± 5． 00* 48． 29 ± 1． 91* 34． 571 ＜ 0． 001
400 6 55． 46 ± 3． 40＊● 66． 90 ± 2． 02＊● 70． 86 ± 4． 04＊● 18． 008 0． 003
600 6 67． 85 ± 2． 61＊● 73． 27 ± 2． 50＊● 78． 69 ± 2． 37＊● 14． 154 0． 005
800 6 70． 36 ± 3． 45* 76． 17 ± 3． 82* 81． 12 ± 2． 85＊● 7． 541 0． 023
F值 94． 380 112． 661 190． 557
P值 ＜ 0． 001 ＜ 0． 001 ＜ 0． 001
注:相同时间点下不同浓度组间两两比较，* P ＜ 0． 05;相同浓度下不同时间点两组间两两比较，●P ＜ 0． 05。
A 0 h
B 24 h
C 48 h
D 72 h
图 1 山竹提取物作用人肝癌细胞 HepG2 的 AnnexinV-FITC /PI双染凋亡图
454 Guangxi Medical Journal，Apr． 2016，Vol． 38，No． 4
2． 3 山竹提取物对细胞周期的影响 与对照组(山竹
提取物浓度为 0 μM)比较，各浓度山竹提取物组 G1 期
细胞比例均升高，S期细胞比例均下降 (P ＜ 0． 05)，且随
着药物浓度的提高，G1 期细胞比例升高，同时 S 期细胞
比例下降(P ＜ 0． 05)。见表 2。
表 2 山竹提取物对 HepG2 细胞周期的影响(x ± s，%)
山竹提
取物浓度
G1 期细胞比例 S期细胞比例 G2期细胞比例
0 μM 24． 60 ± 1． 46* 59． 78 ± 1． 34● 15． 62 ± 1． 21
200 μM 33． 51 ± 1． 38* 51． 96 ± 2． 45● 14． 53 ± 1． 67
400 μM 43． 68 ± 0． 71* 42． 54 ± 1． 69● 13． 78 ± 1． 32
600 μM 58． 19 ± 0． 33* 28． 43 ± 1． 67● 13． 38 ± 2． 75
800 μM 66． 30 ± 0． 90* 21． 31 ± 3． 27● 12． 39 ± 1． 68
F值 808． 706 158． 584 1． 354
P值 ＜ 0． 001 ＜ 0． 001 0． 317
注:G1 期细胞组间两两比较，* P ＜ 0． 05;●S期细胞组间两两
比较，P ＜ 0． 05。
2． 4 Caspase-3 的活性 Caspase-3 的活性检测中吸光度
越大，产生的 pNA越多。Caspase 3 酶活力单位的定义:
即一个酶活力单位定义为当底物饱和时，在 37℃可以剪
切 1 nmol Ac-DEVD-pNA 产生 1 nmol pNA 的 Caspase 3
的酶量。故吸光度越大，Caspase 3 酶活力越强。随着药
物浓度的增加，405 nm的吸光度值越大，Caspase 3 酶活
力增强。与对照组(山竹提取物浓度为0 μM)酶活力单
位比较，各浓度山竹提取物组 HepG2 细胞的 Caspase-3
酶活性均升高(P ＜ 0． 05);给药组的酶活力单位随给药
浓度的增加而明显增加(P ＜ 0． 05)。见表 3。
表 3 山竹提取物对 HepG2
细胞 Caspase-3 活性的影响(x ± s)
山竹提取物
浓度(μM)
n Caspase-3 活性(U)
0 6 2． 50 ± 0． 16
200 6 5． 23 ± 0． 28＊●
400 6 8． 41 ± 1． 36＊●
600 6 12． 11 ± 2． 11＊●
800 6 16． 99 ± 1． 69＊●
F值 52． 762
P值 ＜ 0． 001
注:* 与对照组比较，P ＜ 0． 05，●不同浓度组间两两比较，
P ＜ 0． 05。
3 讨 论
肝癌是常见病和多发病，可分为原发性和继发性两
大类。由于肝脏是人体最大的实质性器官，具有重要代
谢功能，因此，肝脏一旦出现恶性肿瘤可危及生命。肝
脏具有丰富的血流供应，与人体的重要结构如下腔静
脉、门静脉、胆道系统等关系密切，而肝脏恶性肿瘤发病
隐匿，侵袭性生长快速，其治疗甚为困难。手术切除是
目前治疗早期肝癌唯一有效的方法，但大多数患者就诊
时已为中晚期，手术疗效有限，因而寻找新的治疗方法
尤为重要。在天然药物中寻找具有调控细胞增殖、凋亡
的化合物单体或前体化合物，是目前国内外抗肿瘤药物
研究的热点。国内外研究表明，山竹具有抗炎、抗肿瘤、
抗氧化活性等作用，但是对其药理机制的研究却远远落
后于对化学成分的研究。因此有必要对山竹及其有效
成分的药理和毒理作用进行进一步的深入研究。
本实验结果显示山竹提取物能抑制 HepG2 细胞增
殖并诱导其凋亡，随药物作用浓度的增大对细胞增殖抑
制的影响逐渐增加(P ＜ 0． 05)，具有明显的浓度依赖性，
且在一定浓度范围内具有时间依赖性。山竹提取物浓
度为 256． 67 μmol /L 时可诱导人肝癌细胞 HepG2 出现
明显早期凋亡，并且随着药物作用时间的增加凋亡早期
癌细胞的比率显著增高。以上结果说明了山竹提取物
能抑制肝癌 HepG2 细胞的增殖和促使其凋亡。对细胞
周期影响的分析结果显示，与对照组比较，随着药物浓
度的提高，G1 期细胞比例大幅升高，而同时 S 期细胞比
例明显下降(P ＜ 0． 05)，提示山竹提取物抑制细胞进入
S期从而导致 G1 期细胞比例大幅升高。
此外，对凋亡的执行者 Caspase-3 活性蛋白进行检
测的结果显示，与对照组相比，各浓度山竹提取物组
HepG2 细胞的 Caspase-3 酶活性均升高(P ＜ 0． 05)。提
示经山竹提取物处理的 HepG2 细胞 Caspase-3 蛋白活性
显著增加。细胞死亡主要有凋亡和坏死两种表现，两者
之间主要的区别是死亡过程中细胞本身是否主动参
与［16］，本研究表明加入药物处理后，细胞的死亡是通过
凋亡途径进行的。Caspase-3 是真核细胞中最常见的凋
亡蛋白，也是研究最为透彻的半胱氨酸蛋白酶家族成员
之一，大多数的细胞凋亡与其有关［17］。这些凋亡通路关
键酶的激活可能是山竹提取物诱导 HepG2 细胞凋亡的
重要原因。Caspase是一个含有半胱氨酸活性的胞浆蛋
白酶家族，迄今至少发现 14 个成员，其目前发现的
Caspase成员中与 ced-3 同源性最高的，是细胞凋亡过程
中激活的关键酶，也是细胞凋亡的主要效应分子［18］。
Caspase-3 在多因素诱导的肝癌细胞凋亡中激活，促进
Caspase-3 活化和活性，能够加速肝癌细胞凋亡。然而，
目前其活化分子机制尚不清楚，有待于进一步研究，从
而为以 Caspase-3 为靶点的药物治疗提供坚实的理论基
础［19］。
综上所述，山竹提取物对人肝癌细胞 HepG2 凋亡有
诱导作用，且对肝癌细胞增殖有抑制作用，对肝癌治疗
有一定价值;其作用机制可能与抑制 HepG2 细胞进入 S
期和激活 Caspase-3 有关，但尚需进一步的研究证实。
554广西医学 2016 年 4 月第 38 卷第 4 期
参 考 文 献
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654 Guangxi Medical Journal，Apr． 2016，Vol． 38，No． 4