全 文 ：【研究原著】
利用生物条形码技术对相思子毒素进行微量检测
张立营1 ,冯玉奎1 ,孙英姿1 ,孙宇2 ,高波1
基金项目:本课题获青岛市公共领域科技支撑计划项目(编号:09-1-1-
28-nsh)
作者单位:1.济南军区青岛第二疗养院检验科 , 山东 青岛 266071;2.
北京 305医院检验科 , 北京 100050
作者简介:张立营(1979-), 男 ,山东陵县人 , 主管技师 ,理学博士。 研
究方向:免疫生化检测。
　　【摘要】　目的　建立相思子毒素的高灵敏检测方法。方法　利用相思子毒素的多抗及特异 DNA 链标记的
金纳米颗粒 NP 探针和相思子毒素单抗标记的磁性微球 MM P 探针 , 形成 M MP-相思子毒素-NP 三明治复合物后
再利用去杂交将 NP 探针上标记的 DNA 链释放出来 , 通过 PCR方法或芯片检测方法鉴定这些释放的 DNA 链就
可确定相思子毒素的存在。结果　建立了相思子毒素的生物条形码检测体系 ,检测灵敏度可达 1 fg/ ml。 和临床
上常规的检测方法相比 , 其检测灵敏度可达常规 ELISA 的 106 倍。结论　本资料为发展高灵敏度的相思子毒素的
生物条形码检测试剂盒鉴定了基础。
【主题词】　鸡骨草/化学;毒素类 , 生物学/分析;自动数据处理;生物学鉴定法
【中图分类号】　R284.1　　　【文献标识码】　A　　　【文章编号】　1009-6647(2010)16-3784-03
Bio-bar Codes Assay(BCA)in Ultrasensitive Detection of Abrin　Z H ANG Li-y ing , FE NG Yu-kui , SUN
Y ing-z i , et al.The 2nd S anatori um of J inan Military Command , Qingdao 26607 , China
　　【Abstract】　Objective　 To establish a highly sensitive method in detecting abrin.Method　NPs(nanopar ticle
probes)that w ere encoded with DNA w as unique to Abrin and poly clonal antibodies agaist abrin and MMPs(mag-
ne tic micropar ticle probes)w ith monoclonal antibodies that specifically bind Abrin we re prepa red.Af te r forming
MMP-Abrin-NP sandwich complex , dehybridization of the o lig onucleotides on the nanopa rticle probe sur face allow ed
the de te rmination o f the pr esence o f Abrin by identifying the olig onucleo tide sequence re leased from the nanopar ticle
probe through PCR o r chip-based detection.Result　The Bio-bar Codes Assay system fo r detecting Abrin w as es-
tablished , and the sensitivity limit w as about 1fg/m L , Comparable clinically accepted conventional EL ISA assay s fo r
de tec ting the same ta rge , six o rders of magnitude less sensitive than w hat wa s obser ved with this method.Conclu-
sion　This study lays a founda tion for e stablishing highly sensitive Abrin Bio-bar Codes Assay kit.
【MeSH】　ABRUS CANTONIENSIS/ chemistr y;Tox ins , Biolog ical/ ana ly sis;Automatic Data P rocessing;Bi-
olog ical A ssay
　　相思子毒素(abrin)是存在于豆科植物相思
(Abrus precatorius)种子中的一种毒蛋白 ,与蓖麻毒
素(ricin)同为 Ⅱ型核糖体失活蛋白(RIP)家族成员 ,
是迄今为止所发现的毒性最强的植物毒素之一 ,毒性
是普通化学武器的几百倍。从第一次世界大战起 ,经
美 、英 、加 、法等国的研究 ,相思子毒素已经成为一个成
功的天然毒素战剂[ 1 , 2] 。本实验应用相思子毒素多抗
和单抗建立了相思子毒素的生物条形码检测体系 ,为
发展高灵敏度的相思子毒素检测试剂盒鉴定了基础。
1　材料与方法
1.1　材料来源　相思子毒素 、相思子毒素多抗 、单抗
由军事医学科学院微生物流行病研究所赠送 ,胶体金
购自 Sigma 公司 ,银染试剂购自 sigma 公司 ,磁性微球
购自 invi t ro gen 公司 ,检测使用的玻片购自 TEL 公
司。
1.2　NP 探针的制备及鉴定
1.2.1　DNA合成　根据文献 3设计合成下列寡核苷
酸链 , 由上海生工公司合成。互补 probe NP 链:
5-TACGAG TTGAGACCG TTAAGACGAGGCAAT
CA TGCAATCCTGAA TGCGA 10-(CH 2)6-SH-3;条
形码 DNA 链:5-CGCA TTCAGGA T TGCA TGA T T-
GCCTCGTCTTAACGG TCTCAACTCG TA-3;捕获
DNA 链:5-HS-(CH2)6-A10-TACGAG TTGAGAC-
CGT TAAGACGA-3;N P 标签链:5-GGCAATCA T-
GCAA TCCTGAA TGCGA 10-(CH 2)6-SH-3。
1.2.2　多抗标记胶体金　分别取 1 m l的胶体金和
100 μg 的相思子毒素多抗 ,用 0.1 mol/ L K 2CO 3 调节
至 9.0。在搅拌下将胶体金和抗体混合 , 10 min后再
加入 5%BSA ,使其最终浓度为 1%。
1.2.3　互补 probe NP 链修饰胶体金　将互补 probe
NP 链(终浓度为 2 μmol/L)加入多抗修饰的胶体金
中 ,静置40 h ,再以PBS 调整 pH 至 7.0 ,增强 NaCl浓
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度至 0.1 mol/ L ,10 000 g 离心 10 min得到含寡核苷
酸的胶体金。
1.2.4　barcode DNA 与互补 probe NP 链杂交　将
barcode DNA(终浓度为 2 μmol/ L)加入上面经修饰
的胶体金中 ,室温杂交 4 h ,10 000 g 离心得到 NP 探
针。
1.3　MMP 探针的制备及鉴定　MMP 探针的制备
包括磁性微球的激活和单抗的标记 ,具体过程参考其
产品说明书。
1.4　检测探针的制备　将 NP 标签链(终浓度为 2
μmol/L)加入胶体金中 ,静置 40 h ,再用 PBS 调整 pH
至 7.0 ,增强 NaCl浓度至 0.1 mol/ L , 10 000 g 离心
10 min得到含寡核苷酸的胶体金 ,即为检测探针。
1.5　生物条形码检测过程
1.5.1　三明治结构的形成　将 50μl MMP 探针(5
mg/ml)加入 10 μl已知浓度的相思子毒素溶液中 ,37
℃下剧烈震荡 1 h 。加上磁场固定 MMP 探针 ,用 PBS
溶液反复冲洗 ,除去未连结的相思子毒素及其他不相
关的蛋白 。加入 NP 探针 50 μl ,剧烈震荡 30 min ,形
成三明治结构。接着加上磁场 ,用磁铁固定 MMPs探
针 ,用 100 μl PBS 缓冲液反复冲洗 4次 ,除去未连接
的 NP 探针 。
1.5.2　条形码 DNA的获取　形成三明治结构后 ,接
着加上磁场 ,再用磁铁固定 MMPs探针(三明治结构)
的同时 ,用 100 μl PBS 缓冲液反复冲洗 4次 ,除去未
连接的N P 探针。加入 50μl超纯水到三明治结构中 ,
60 ℃剧烈震荡 30 min ,使条形码 DNA 去杂交 。三明
治复合物被磁性分离 ,收集上清液 ,内含条形码 DNA ,
用于定性定量检测。
1.5.3　条形码 DNA 的芯片检测　取 10 μl条形码
DNA 与 85 μl 0.6 mol/ L PBS 和 5 μl检测探针混合 ,
加到玻片的捕获DNA链处 , 42 ℃反应 2 h , 0.01 mol/
L 的 PBS洗脱 ,接着将银染液 A 液 1 ml和 B 液 1 m l
混匀 ,加在芯片的捕获 DNA 链处 ,静置 10 min ,平板
扫描仪记录结果 。
2　结果
2.1　NP 探针的 TEM 鉴定和 UV-vis鉴定　用支持
膜的镍网蘸取 NP 探针 ,滴加磷钨酸复染处理 ,直接在
TEM 放大观察(图 1),胶体金颗粒周围有明显的灰黑
色晕环 ,表明颗粒表面吸附有多抗蛋白。NP 探针以
0.3 mo l/L NaCl , 10 mmol/ L PBS 为空白对照 ,扫描
范围为 400 ～ 700 nm ,以 5 nm 为扫描精度。由本图可
以看出 , 最大吸收峰在 530 nm 处 , 最大吸光度为
0.968(图 2)。
2.2　MMP 探针鉴定结果　分光光度计检测其标记
前后的 OD值 ,利用下面公式检测标记效率:
[(A280pre-coupling solut ion×D)-(A280post-
coupling so lution)×D)] ×100%/(A280pre-coupling
solut ion×D)=0.603-0.10/0.603=0.794=79%≥
60%,符合要求 。
2.3　银染时间的优化　银染时间过短过长都不利于结
果的观察 ,我们对染色时间进行了优化实验。分别在染
色后 5 、6 、7 、8 、9 、10 min用蒸馏水终止反应 ,进行扫描 。
结果显示反应后 0～ 8.5 min为检测点灰度明显增加阶
段 ,8 min后检测点灰度增加缓慢 ,而背景迅速加深 ,结
果见图 3 ,因此染色时间8 min时具有较好信噪比 。
图 3　染色时间对结果的影响
2.4　Cut-off 值的确定　计算 20个阴性结果的平均
值和标准差 ,以平均值加上 3倍的标准差作为本实验
中判定阳性样本的 Cut-off 值。如果待测样本的灰度
值大于 Cut-off 值 , 则判为阳性 , 反之为阴性。经计
算 ,本实验的 Cut-off 值为 114.1。
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2.5　条形码 DNA 芯片检测结果　去杂交获得的条
形码 DNA通过芯片进行鉴定 ,鉴定结果见图 4。
注:1～ 11 相思子毒素的浓度依次为 100 ng/ ml 、10 ng/ml 、1 ng/ ml 、100 pg/ml 、
10 pg/ml 、1 pg/ml、100 fg/ml、10 f g/ ml 、1 f g/ ml 、100 ag/ ml 、0μg/ml。
图 4　条形码 DNA 芯片检测结果
　　利用 arrayvision软件对各点的灰度值定量 ,依次
为 320.7 、309.4 、305.1 、278.4 、241.6 、192.3 、152.7 、
124.3 、110.9 、91.5 、84.8;芯片鉴定结果显示检测灵敏
度可达 10 fg/ml ,约是常规 ELISA 的 105倍 。
3　讨论
美国西北大学 Mirkin领导的课题组于 2003年首
次报道了生物条形码检测技术(Bio-bar Codes A ssay ,
BCA)。生物条形码检测技术的优点有:(1)检测灵敏
度高 ,比常规的 ELISA 方法高出六个数量级(100万
倍);(2)操作程序简单;(3)针对不同的目标蛋白设计
不同长度和序列的条形码 DNA ,可分析复杂样本中的
多个目标蛋白;(4)具有较高的特异性 ,只要使用高特
异的抗目标检物的单克隆抗体就能保证检测系统的高
特异性;(5)检测范围广 ,只要被检物具有单抗和多抗 ,
就可对其进行检测 ,这使得它在检测一些不适宜用
PCR技术检测的微量物质方面具有很大的优势[ 3-6] 。
现阶段根据相思子毒素具有的理化特性 、生化特
性和免疫原性发展出多种检测法 ,其中以免疫检测法
为主 。免疫检测法多是依赖于抗原抗体反应的免疫学
方法 ,包括多克隆和(或)单克隆抗体为基础的放射免
疫法或酶联免疫吸附法(ELISA)、免疫层析试验和电
化学发光生物传感器 ,其中 ELISA 法是国际规定的检
测相思子毒素的金标准。检测灵敏度最高只能达到 1
ng ,存在着灵敏度不高等问题 ,已经不能满足检验对
灵敏度的要求[ 7 , 8] 。
生物条形码检测技术的优点是具有极高的检测灵
敏度 ,这使得它在一些不能建立核酸检测体系的微量
物质检测 ,如蛋白 、肽 、氨基酸 、激素 、类固醇 、细胞因
子 、肿瘤标记物 、生物战剂 、毒素等物质的检测中有着
广泛的应用前景 。本资料为制备高灵敏度的相思子毒
素生物条形码检测试剂盒鉴定了基础。
【参考文献】
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收稿日期:2010-01-10;修回日期:2010-05-10　责任编辑:刘玮 许纬洲
胆囊蛔虫误诊为胆囊结石 1例 【病例报告】
张瑜　南京军区南京总医院汤山分院特诊科 , 江苏 南京 211131
【主题词】　蛔虫病/诊断;胆囊疾病/诊断;误诊;胆囊结石病/诊断;病例报告[ 文献类型] ;人类
【中图分类号】　R657.4　　　【文献标识码】　B　　　【文章编号】　1009-6647(2010)16-3786-01
1　病历摘要
女 , 40 岁。因既往有胆囊结石病史 , 反复右上腹痛再发 2 h
来院。超声显示:胆囊大小约 51 mm×19 mm , 腔内见数个强
回声团块 ,部分后伴弱声影 , 可移动 ,较大直径约 10 mm。超声
诊断胆囊结石 、胆囊炎。术后病理:胆囊蛔虫 ,胆囊结石。
2　讨论
胆囊蛔虫比较少见。但胆囊蛔虫是肠蛔虫症的常见并发
症 ,系肠蛔虫通过十二指肠乳头的开口 ,钻入胆道进入胆囊内。
胆囊蛔虫多表现为双线状强回声带 , 多呈弧形或蜷曲状 , 在胆
囊内合并多量结石时易漏诊[ 1] 。 本例蛔虫已死亡 , 形态不规
则 ,虫体回声较结石回声弱 , 后方声影亦不明显 , 但因其既往有
结石病史 ,本次检查时与结石混在一起 , 导致其被漏诊。并且
忽略了患者病程中曾有钻顶样疼痛 , 后自行缓解。超声检查对
鉴别胆结石与胆囊蛔虫有特异性。
【参考文献】
[ 1] 　周永昌 ,郭万学.超声医学[ M] .4版.北京:科学技术文献出版社 ,
2003:958-961 , 978-979.
收稿日期:2009-12-20;修回日期:2010-04-10　　责任编辑:朱建洲
·3786· 中国误诊学杂志 2010年 6月第 10卷第 16期　Chin J Misdiag n , Jun 2010 Vol 10 No.16