全 文 ：毛细管电泳法分析贝类食品中的软骨藻酸
卫　锋1　王竹天2
(1.辽宁出入境检验检疫局 ,大连　116001;2.中国疾控中心营养与食品安全所 ,北京　100021)
摘　要:为监测贝类食品的食用安全 ,建立了毛细管电泳 紫外检测法定量测定贝类食品中软骨藻
酸的分析方法。结果表明:软骨藻酸在 0.2 ～ 50 μg mL 范围内具有良好的线性关系 ,相关系数 r=
0.9990;RSD=2.56%;方法检出限为 0.034 μg g 。在 3个水平上对实际样品进行标准添加 ,回收率
分别为96.80%、97.10%和 96.85%。该方法简单 、灵敏 、高效 、成本低 ,对记忆损失性贝类毒素的检
测和监控具有重要意义。
关键词:海生毒素类;软骨藻酸;电泳 ,毛细管
Analysis of Domoic Acid in Shellfish Samples by Capillary Electrophoresis
Wei Feng , et al.
(Liaoning Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau ,China ,Dalian　116001)
Abstract:A capillary electrophoresis with UV method for determination of domoic acid , a main kind of amne-
sic shellfish toxin was established.The calibration curve of domoic dacid showed good linearity in the range of
0.2 ～ 50μg mL with r=0.9990 and RSD =2.56%.The detection limit of the method was 0.0034 μg g.
Spike with domoic acid standard at three levels , the recoveries were 96.80%、97.10% and 96.85% respec-
tively.The method was simple , convenient , sensitive , low cost and suitable for monitoring of amnesic shellfish
toxin.
Key Words:Marine Toxins;Domoic acid;Electrophoresis ,Capillary
基金项目:国家科技部基金资助(社会公益项目)
作者简介:卫峰　男　主任技师　硕士
This work was supported by the Special Funds of Ministry of Science
and Technology , China.
　　记忆缺失性贝类毒素(Amnesic shellfish toxin简
称ASP)主要成分软骨藻酸(Domoic acid简称 DA)是
一种氨基酸类的生理活性物质(图 1),因最早从红
藻属的树枝软骨藻(Chondria armata)分离出来而被
命名为软骨藻酸 。自 1987年加拿大首次发生集体
贝类食品中毒事件后 ,人们从赤潮藻类中的硅藻属
(Diatom)的多列尖刺菱形藻(Nitzsch pungens f.multis-
eries)中检测到了 DA ,随后 ,美国 、加拿大 、北欧一些
国家 ,澳大利亚 、日本等国先后从紫贻贝(Myltilus
edulis)、扇贝(Pecten maximus)、文蛤(Callista chione)
等贝类体内以及 鱼 、鲭鱼和石蟹的内脏中检测到
了DA 。鱼 、贝通过滤食毒藻 ,将 DA富积在体内 ,人
类因食用被 DA污染的鱼 、贝而中毒 ,中毒症状包括
恶心 、呕吐 、腹痛 、腹泻等 ,同时有昏眩 、昏迷等类似
神经性中毒症状 ,永久性丧失部分记忆是此类中毒
的典型特征 ,因此它被称为记忆缺失性贝类毒素 ,美
国FDA将它确定为四种主要海洋生物毒素之一 。
加拿大首先制定了 DA 的安全剂量为 20 μg/g 贝
肉 , [ 1]随后 ,欧洲 、日本也相继将该种毒素列为贝类
常规检测项目 。
图 1　软骨藻酸的分子结构
小白鼠生物检测方法首先被应用于 ASP 的检
测 ,随后酶联免疫 、细胞毒性检测和受体检测等生物
检测法相继建立起来。[ 2] 近年来 ,仪器分析法因其灵
敏 、准确 、快速等特点而得到广泛应用 。常用的仪器
分析法有高效液相色谱法(HPLC)[ 3～ 5] 和毛细管电
泳法(CE)。[ 6 , 7]
在参考现有CE分离分析方法所采用的萃取技
术的基础上 ,本文采用水 、甲醇溶液作为提取液 ,结
合阴离子交换柱和阳离子交换柱的净化 ,避免了基
—107—毛细管电泳法分析贝类食品中的软骨藻酸———卫　锋　王竹天
DOI :10.13590/j.c jfh.2003.02.003
体中色氨酸的干扰 ,样品回收率得到较大的提高 。
同时通过对分离分析条件的优化 ,将 DA 分析的线
性范围由 1.5 ～ 8.0 μg/mL[ 7] 扩大到 0.2 ～ 50.0 μg/
mL ,为建立贝类体内 DA的微量 CE/UV常规分析提
供了可行性 。该方法简便 、灵敏 、成本低 ,是贝类体
内DA含量常规检测较理想的方法。
1　材料与方法
1.1　仪器与试剂
BioFocus 3000 全自动毛细管电泳仪 (Bio-Rad
Laboratories ,Hercules , CA , USA)配有紫外检测器;JZ
型组织匀浆器(铁道部电气化设计研究院四方电器
设备厂);TGL-16型台式高速离心机(上海医用分
析仪器厂);KQ-250型超声波清洗器(昆山市淀山
湖检测仪器厂);PHS-3C精密 pH 计。
软骨藻酸标准品(DA ,纯度 95%)购于 Sigma公
司 ,于-18℃保存至使用;MUS-1标准物质(贝类
组织参考物质 ,DA的质量比为 98μg/g ,购自 Nation-
al Research Council Canada);四硼酸钠(50 mmol L , pH
值9.3)分析纯;乙腈(色谱纯);甲醇(色谱纯);甲酸
(分析纯);实验用水为自制二次去离子水;3 mL阴
离子交换柱(SAX:part NO.1210 -2044 , lot NO.
182639 ,Varian)和阳离子交换柱(SCX:part NO.1211
-3039 , lot NO.171069)。非涂渍石英毛细管柱(内
径50 μm ,检测窗口距出口端 4.5 cm ,柱 1的有效柱
长40 cm ,柱 2的有效柱长为 34.5 cm)河北永年光导
纤维厂生产。
1.2　试样的制备和分离分析
1.2.1　试样的萃取
4.0 g 贝类组织加入 16.0 mL 甲醇+水(1+1 ,
体积之比)匀浆 3min , 450 0 r/min离心10 min ,将上
清液通过 0.45 μm滤膜(Millex-HV)过滤后放入冰
箱储存备用。
1.2.2　试样的洗脱
参考Zhao[ 7] 等的方法进行改进　a:取 5.0 mL
上述粗提取液 ,移入依次经甲醇 、水和甲醇+水(1+
1 ,体积之比)预处理过的 SAX 柱 ,待液体以每秒一
滴的速度流出后 ,再依次用 5 mL乙腈+水(1+9 ,体
积之比)洗脱液以每秒 1滴的流出速度过柱 ,弃去流
出液 ,最后用 2 mL 甲酸洗脱液洗脱吸附在柱上的
DA 。b:将 a中得到的提取物移入预先依次经甲醇 、
水和 0.01 moL/L 甲酸 、 5 mL SAX洗脱液预处理的
SCX柱 ,柱子先分别用 5 mL 0.01 moL/L 甲酸和 0.5
mL 25 mmoL/L 的硼酸钠(pH 9.2)+乙腈(9+1 ,体
积之比)溶液冲洗 , 弃去流出液 , 再用 2 mL 25
mmoL/L的硼酸钠(pH 9.2)+乙腈(9+1 ,体积之比)
溶液分 3等份洗脱 , DA 在第三次洗脱液中开始出
现 ,取洗脱液进行 CE分析 。
1.2.3　DA的 CE-UV分析
非涂渍石英毛细管柱 ,检测波长 242 nm ,分离
电压 15.0 kV ,柱温 25 ℃,压力进样每秒 6 psi ,冲洗
及运行缓冲液为 25 mmoL/L硼砂溶液。
2　结果与讨论
2.1　提取溶剂的选择
常用 DA 萃取溶剂的选择是基于其水溶性特
点 ,用酸性水溶液提取 , [ 7] 实验表明 DA 在酸性条件
下易分解 ,本实验采用水 、甲醇溶液作为提取液 ,结
合 SAX和 SCX柱的净化 ,避免了基体中色氨酸的干
扰 ,得到了96.93%的回收率。
2.2　CE检测条件的优化
DA为ASP 的主要成分 ,它含有3个羧基和 1个
氨基基团 ,具有很强的电离能力(图 1)。根据溶液
pH值的不同 , DA 具有 5种荷电状态 ,其 pK a 值为
2.10 , 3.72 ,4.97 和 9.82 ,因此 ,我们可以采用不同
运行模式或电泳条件对其进行检测。
根据 Pineiro 等的研究 , [ 6] 硼酸是 DA 分析的最
适缓冲液 ,我们用不同浓度的缓冲液(12.5 、 25 、 50
mmoL/L)和不同的运行电压(18.0 、15.0 、12.0 kV)进
行 DA标准物质的检测 ,以便找到最佳分离效率和
分辨率的毛细管电泳条件 。当使用高浓度缓冲液
(50 mmoL/L)时 ,由于缓冲液中的高盐度 ,会出现电
流增大 、峰展宽的现象 ,毛细管中出现 Joule热效应 ,
这种效应会导致溶剂蒸发和电泳分离前试样的损
失 ,同时离子强度的增加会延长迁移时间 ,使 DA检
测时间延长。使用低浓度缓冲液(12.5 mmoL/L)时 ,
虽然 DA 的迁移时间缩短 ,但检测噪音增大 , 导致
DA检出限的降低 。而使用 25 mmoL/L的硼酸盐溶
液则可以克服上述两种缓冲液的不足 ,提高了电泳
的选择性和分辨率 ,同时峰形更尖锐 ,电泳分离效率
更高 ,因此 25 mmoL/L 的硼酸盐缓冲液是 CE 分离
DA的最佳缓冲液(图 2)。在选择电压时 ,使用较高
的分离电压(18.0 kV)可以使 DA迁移时间缩短 ,但
同样会出现电流增大和 Joule热效应等缺点 ,而低电
压(12.0 kV)又导致 DA 迁移时间延长 ,实验证明
15.0 kV的电压时电流不大且迁移时间在合适的范
网内 ,是毛细管电泳测定 DA 的最佳分离电压(图
3)。
2.3　线性关系
经优化后 ,分别配置 50 、35 、20 、10 、1 、0.4 、0.2
μg/mL的 DA 标准溶液 ,以 DA标准溶液为横坐标 ,
以各浓度 DA的峰面积(毛细管柱 2)为纵坐标(n =
3),结果表明 , DA在 0.2 ～ 50 μg/mL的浓度范围内
—108— 中国食品卫生杂志CHINESE JOURNAL OF FOOD HYGIENE 　　　 　　　　　2003 年第 15卷第2 期
其峰面积与浓度具有非常好的线性关系(r =
0.999 0),回归方程 y =555 31+102 414x 。其峰面积
的相对偏差(RSD)为 1.90%(日内)、3.60%(日间),
迁移时间的相对标准偏差为 1.60%(日内)、 1.86%
(日间)。
图 2　不同浓度的硼酸缓冲液对 DA 响应的影响
条件:未涂渍柱 1 ,硼酸盐缓冲液(pH 9.3), 15 kV ,从正到负 ,压力
进样每秒 6 psi ,紫外检测 242 nm。
图 3　不同运行电压时 DA 响应的影响
条件:未涂渍柱 2 , 25mmol/ L硼酸盐缓冲液(pH 9.3),从正到负 ,
进样每秒 6 psi ,紫外检测 242 nm。
2.4　回收率 、精密度和最低检测限
本实验进行 3个添加水平的实验 ,分别加入 DA
标准品 5.00 、10.00和 20.00 μg/g ,空白试样加标后
同样按“1.2”节方法处理 ,每一水平测定 6次 ,平均
回收率为 96.93%, RSD 为 2.56%结果见表 1。本方
法的试样最低检出限为 0.034 μg/g(S N>3)。
表 1　方法的回收率和精密度(n=6)
添加量
μg g
测定值
μg g
平均回收率
%
RSD
%
5.00 4.84±0.14 96.80 2.91
10.00 9.71±0.25 97.10 2.65
20.00 19.37±0.39 96.85 2.13
平均值 96.93 2.56
2.5　试样检测
用该方法对参考标准物质(MUS-1)进行了分
析 ,分析结果见图 4。
图 4　毛细管电泳 紫外分析
条件:未涂渍柱 2;25 mmoL L硼酸盐缓冲液(pH9.3), 15 kV , 从正
向负运行 ,压力进样每秒 6 psi ,紫外检测 242 nm。
参考文献:
[ 1] 　Lawrence JF , Lau BP, Cleroux C , et al.Comparison of UV ab-
sorption and electrospray mass spectrometry for the high-per-
formance liquid chromatographic determination of domoic acid
in shellfish and biological samples[ J] .J Chromatogr A , 1994 ,
21;659(1):119—126.
[ 2] 　Grimmelt B , Nijjar MS , Brown J , et al.Relationship between
domoic acid levels in the blue mussel(Mytilus edulis)and
toxicity in mice[ J] .Toxicon , 1990 , 28(5):501—508.
[ 3] 　Lawrence JF , Charbonneau CF , Menard C.Liquid chromato-
graphic determination of domoic acid in mussels , using AOAC
paralytic shellfish poison extraction procedure:collaborative
study[ J] .J Assoc Off Anal Chem , 1991 , 74(1):68—72.
[ 4] 　Quilliam MA.Analy sis of diarrhetic shellfish poisoning toxins
in shellfish tissue by liquid chromatography with fluorometric
and mass spectrometric detection[ J] .J AOAC Int , 1995 , 78
(2):555—570.
[ 5] 　卫锋 ,程 ,宫静宏 , 等.高效液相色谱法测定贝类中丧
失记忆性贝毒素-软骨藻酸[ J] .色谱 , 2001 , 19(3):
248—250.
[ 6] 　N Piñeiro J M , Leão A , Gago Martiñez J A , et al.Analysis of
domoic acid in shellfish by Capillary Electrophoresis[ J] .J.
Chromatogr A , 1999 , 847(1 2):223—232.
[ 7] 　Zhao JY, Thibault P , Quilliam MA.Analy sis of domoic acid
and isomers in seafood by capillary electrophoresis[ J] .Elec-
trophoresis , 1997 , 18(2):268—276.
[ 收稿日期:2003-01-02]
—109—毛细管电泳法分析贝类食品中的软骨藻酸———卫　锋　王竹天