全 文 ：收稿日期:2012-06-26; 修订日期:2012-08-30
基金项目:国家自然科学基金( No． 30970300)
作者简介:唐先明( 1978-) ，男( 汉族) ，黑龙江嫩江人，现任哈尔滨市食品
药品检验检测中心主管药师，硕士学位，主要从事食品药品安全性检测与
研究工作．
* 通讯作者简介:王振月( 1956-) ，男( 汉族) ，黑龙江哈尔滨人，现任黑龙
江中医药大学教授，博士研究生导师，学士学位，主要从事中药资源开发
与生物技术研究工作．
毛脉酸模中二苯乙烯类成分
抗肿瘤作用的体外实验研究
唐先明1，2，王振月1* ，康毅华1，赵海鹏1，3，王宗权1，4
(1．黑龙江中医药大学药学院，黑龙江 哈尔滨 150040;
2．哈尔滨市食品药品检验检测中心，黑龙江 哈尔滨 150525 ;
3．鲁南制药集团股份有限公司，山东 临沂 276005;
4．河北以领医药集团 医药研究院，河北 石家庄 050035)
摘要:目的 观察毛脉酸模中二苯乙烯类成分对肿瘤细胞体外增殖的抑制作用。方法 采用四唑盐比色试验 ( MTT法) ，
以半数抑制浓度( IC50 ) 为评价抗肿瘤活性强度的指标，分别对 HepG2 人肝癌细胞、Hela人宫颈癌细胞、MCF － 7 人乳腺癌
细胞 3 种常见的人恶性肿瘤细胞进行抗肿瘤活性的筛选。结果 毛脉酸模中二苯乙烯类成分对 HepG2、Hela 和 MCF － 7
增殖有抑制作用，且抑制作用与药物浓度有相关性，其 IC50分别为 336． 64，416． 88，361． 00 μg /ml。结论 毛脉酸模中二
苯乙烯类成分对以上三种肿瘤细胞的体外生长具有抑制作用。
关键词:毛脉酸模; 二苯乙烯; 体外抗肿瘤; MTT法
DOI标识:doi: 10． 3969 / j． issn． 1008-0805． 2012． 11． 005
中图分类号:R962 文献标识码:A 文章编号:1008-0805( 2012) 11-2677-02
Experimental Study on Antitumor Effect of Chrysophenine from Rumex gmelini Turcz in
vitro
TANG Xian-ming1，2，WANG Zhen-yue1* ，KANG Yi-hua1，ZHAO Hai-peng1，3，WANG Zong-quan1，4
( 1． College of Pharmacology，Heilongjiang University of Traditional Chinese Medicine，Harbin 150040，China;
2． Harbin Food and Drug Inspection Center，Harbin 150525，China; ． 3． Lunan Pharmaceutical Group Corpora-
tion，Linyi，276005，China; 4． Hebei Yiling Pharmaceutical Group，Medicine Institute，Shijiazhuang 050035，Chi-
na)
Abstract: Objective To observe the antitumor effects of chrysophenine from Rumex gmelini Turcz in vitro．Methods MTT assay
was employed to test the anti － tumor of chrysophenine in HepG2、Hela and MCF － 7 tumor cell lines，with IC50 applied to evalu-
ate the degree of anti － tumor activity． Results The chrysophenine inhibited the HepG2、Hela and MCF － 7 cell growth in concen-
tration － dependent manners and the IC50 were 336． 64、416． 88、361． 00μg /ml． Conclusion The chrysophenine can inhibit the
proliferation of HepG2、Hela /MCF － 7 in vitro．
Key words: Rumex gmelini Turcz; Chrysophenine; Anti － tumor in vitro; MTT
二苯乙烯类化合物是毛脉酸膜、大黄和虎杖等常用中药的主
要活性成分，具有抗菌、消炎、抗肿瘤、降脂等多种药理活性［1 ～ 3］。
特别是近年来发现的可诱导细胞凋亡具抗肿瘤活性，受到抗癌药
物研究的广泛关注［4］。本实验对毛脉酸模中二苯乙烯类成分进
行了抗肿瘤作用的初步研究。现报道如下。
1 材料与设备
1． 1 药物 二苯乙烯类成分由本实验室分离、富集制得。实验时
取适量浸膏，用 DMSO助溶，其最终浓度小于 0． 05%。用 PBS配
成所需浓度，溶解后用 0． 22 μm的微孔滤膜过滤除杂除菌。
1． 2 细胞株 人肝癌细胞株 HepG － 2，人乳腺癌癌细胞株 MCF
－ 7，人宫颈癌细胞株 Hela均由哈尔滨医科大学肿瘤防治研究所
提供。
1． 3 试剂 RMPI － 1640 培养基干粉、胰蛋白酶(美国 GIBCO 公
司出品) ;胎牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司出品) ;
DMEM培养液 (美国 GIBCO 公司出品) ;二甲基亚砜(美国 AM-
RESCO公司) ;MTT (美国 Sigma公司) ;磷酸缓冲液(北京索莱宝
生物试剂有限公司) ;顺铂(齐鲁制药有限公司)。
1． 4 仪器设备 Mettler 电子天平(AE 240) ;净化工作台(SW －
CJ － 1F) ，倒置显微镜(Olympus CK40) ，COSTAR 细胞培养板(美
国 Corning 有限公司) ，Model450 Biorad 酶标仪(美国 Biorad 公
司) ，二氧化碳培养箱 (德国 HERAEUS公司) ，培养瓶(美国 Cor-
ning有限公司)。
2 方法
2． 1 肿瘤细胞培养 从液氮罐中取出细胞株，迅速置于 37℃的
水浴缸中解冻，用吸管吸净管中细胞悬浮液，转移至 10 ml 离心
管中。1 000 r /min 离心 5 min，弃上清液。加入约 4 ml 生理盐
水，吹打混匀，1 000 r /min离心 5 min，弃上清液。加入 2 ml含胎
牛血清 10%的 RPMI 1640 培养液或 DMEM 培养液，吹打混匀后
置入细胞培养瓶中，放入 37℃、5% CO2 孵箱中培养。待细胞生
长贴壁约 80%左右时传代，取对数生长期细胞用于实验。
2． 2 MTT 法测定二苯乙烯类成分对肿瘤细胞的杀伤作用［5，6］
取处于对数生长期的肿瘤细胞，用含有 10%胎牛血清的 RPMI
1640 培养液或 DMEM培养液稀释成 30 000 个细胞 /ml。在 96 孔
·7762·
LISHIZHEN MEDICINE AND MATERIA MEDICA RESEARCH 2012 VOL ． 23 NO． 11 时珍国医国药 2012 年第 23 卷第 11 期
板每孔中加入 180μl 细胞悬液，每空约含 5 000 ～ 8 000 个细胞，
置于 37℃、5% CO2 孵箱中培养 24 h。将药材粉末用 PBS 溶解，
DMSO助溶，用 0． 22μm的微空滤膜空滤除菌，每孔中加 20 μl 药
材溶液，设 6 个复孔，配成终浓度为 500，250，125，62． 5，31． 25
μg /ml 的 5 个梯度。阴性对照组加入含 DMSO为 1‰的 PBS。阳
性对照组加入终浓度为 5 μg /ml 的顺铂溶液。置于 37℃、5%
CO2 孵箱中分别培养。将加药后 72 h每孔中加入 20 μl MTT 溶
液，置于 37℃、5% CO2 孵箱中孵育 4 h。吸出上清，加入 150 μl
DMSO，用摇床摇匀。测定 OD490值。计算肿瘤细胞生长抑制率，
用对数回归方程求出半数抑制浓度(IC50) ，肿瘤细胞生长抑制率
按下式计算:
肿瘤细胞生长抑制率(%)=(1 －实验组平均 OD 值 /对照
组平均 OD值)× 100%
2． 3 实验数据处理 所有结果均采用 SPSS 13． 0 for Windows 软
件进行处理，结果以均值 珋x ± s表示。计算半数抑制浓度 IC50。
3 结果
不同浓度的二苯乙烯类成分作用于体外培养的 HepG － 2、
MCF － 7 和 Hela 三种肿瘤细胞株，采用 MTT 法测定其对肿瘤细
胞增殖的抑制率。结果显示，二苯乙烯类成分在浓度为 125 μg /
ml时对人肝癌细胞株 HepG － 2 有明显的抑制作用，浓度为
250ug /ml时对人乳腺癌癌细胞株 MCF － 7 和人宫颈癌细胞株
Hela有明显的抑制作用，抑制作用均随浓度的增加而增强，在一
定范围内存在剂量效应关系，其 IC50值分别为 336． 64，416． 88，
361． 00 μg /ml，说明毛脉酸模中二苯乙烯类成分在体外具有抑制
肿瘤细胞生长的作用。见表 1。
表 1 二苯乙烯类成分对 HepG － 2、MCF － 7、Hela细胞增殖的抑制作用
组别
药物浓度
C /μg·ml －1
HepG － 2
抑制率(%) IC50 /μg·ml －1
MCF － 7
抑制率(%) IC50 /μg·ml －1
Hela
抑制率(%) IC50 /μg·ml －1
细胞对照 － － － －
阳性对照 5 74． 51 67． 82 86． 52
给药 31． 25 5． 62 － 19． 00 5． 00
62． 5 － 3． 88 9． 50 0． 66
125 20． 00* 336． 64 30． 94 416． 88 14． 42 361． 00
250 26． 17* 38． 37* 26． 63*
500 61． 77* 53． 62* 58． 11*
与细胞对照组比较，* P ＜ 0． 05
4 讨论
体外抑瘤实验与体内抑瘤实验在抗肿瘤药物的研究中各有
特点，具有一定的互补性。其相对于体内抑瘤实验 MTT 法有众
多优点，被美国 NCI选作为体外抗癌药物筛选的常规方法。目前
以培养细胞株为筛选试验体系对抗癌药物的研究越来越多。采
用细胞培养的筛选体系可以在体外对人体癌细胞进行抗癌效力
测验，从而加快筛选速度，而且还可以从细胞水平和分子水平上
对抗癌机制进行研究。由于 MTT 比色法具有简单、快速、灵敏、
易接受的特点［7］，加之 96 孔培养板的应用，使得操作半自动化，
可以在短时间内进行大量标本的测定，故对大量筛选抗肿瘤药物
具有重要的意义。
但是，与体内抑瘤实验相比，体外抑瘤实验也有其局限性，主
要体现在:有些药物是通过机体的免疫功能发挥抗肿瘤作用，或
是某些药物进入机体后必须通过酶的代谢才能活化发挥抗肿瘤
作用，这些情况下体外实验可出现假阴性结果;细胞接种量与药
物的抑制率呈负相关，接种量较少时，易得到较高的抑制率;结晶
溶解差，在检查结果之前，要加 DMSO溶解甲臜颗粒，但往往溶解
不全。
为了尽量克服这些缺点在本实验中，所用的肿瘤细胞都是体
外培养的纯细胞系，筛选结果能准确反映肿瘤细胞的活力。为了
使实验结果接近真实结果，在使用 MTT法进行样品筛选时，一般
通过三次的平行实验将误差减小。取三次结果的平均值来决定
初筛样品在实验过程中细胞毒性的有效结果。这样的校正结果，
在针对已筛选出的材料的活性化合物跟踪中也不会引发出错误
的判断。因此，MTT法体外筛选出的具抗肿瘤活性样品的方法是
可靠且稳定的。
从结果中发现，二苯乙烯类成分对 HepG － 2、MCF － 7、Hela
三种肿瘤细胞有较明显的抑制作用，但是从 IC50值来看，不能直
接判断为样品在体外对肿瘤细胞有杀伤作用［8］。分析这个实验
结果我们可以初步得到以下几点结论:①二苯乙烯类成分对肿瘤
的抑制作用是有细胞选择性的，对某些肿瘤细胞有一定的抑制作
用而对某些肿瘤细胞作用不明显。②二苯乙烯类这个部位中在
低浓度时含有的某些细胞毒性成分因含量较低，活性被许多无活
性杂质所掩盖而未被检测到。③MTT 法是筛选是否具有细胞毒
性的一种检测手段，对活性物质的筛选具有一定的局限性，可能
因假阴性结果而导致漏筛。例如，对于一些本身无细胞毒作用，
但在体内代谢后可成为有效活性物质等类型的药物无法筛选出。
④二苯乙烯类成分的抗肿瘤作用不是或者不完全是通过细胞毒
作用而达到的。这一点和以往的二苯乙烯类成分抗肿瘤活性研
究所得到的结论是一致的。所以，本文进行粗筛后的结果可以为
以后的开发工作提供一个参考依据。
参考文献:
［1］ 王振月，陈金铭，王谦博，等．毛脉酸模的化学成分研究(Ⅳ) ［J］．中
草药，2009，40(9) :1352．
［2］ 王宗权，王振月，崔红花，等．基于 BP 神经网络的毛脉酸模根中白
藜芦醇的动态规律研究［J］．时珍国医国药，2008，19(11) :2582．
［3］ 贾玉梅，王君明，崔 瑛．基于二苯乙烯类为主要活性成分的虎杖
药理作用研究进展［J］．中国实验方剂学杂志，2011，17(9) :263．
［4］ Shay JW． The role of telomeres and telomerase in cancer［J］． Cancer
Res，2005，65(9) :3513．
［5］ 徐叔云，卞如濂，陈 修．药理实验方法学，第三版［M］． 北京:人民
卫生出版社，2005:1785．
［6］ 司徒镇强，吴军正．细胞培养(修订版) ［M］．西安:世界图书出版公
司，2005:250．
［7］ 张海霞，方 芸，葛卫红，等． 四氮唑盐法肿瘤药敏试验及应用
［J］．中国医院药学杂志，2005 ，25 (7) :663．
［8］ 韩 锐．抗癌药物研究与实验技术［M］．北京:北京医科大学、中国
协和医科大学联合出版社，1997:271．
·8762·
时珍国医国药 2012 年第 23 卷第 11 期 LISHIZHEN MEDICINE AND MATERIA MEDICA RESEARCH 2012 VOL． 23 NO． 11