全 文 ：S l HZ IHE M NE DC I INE A M N DA TE RA ME D I IA CE S RE A C R H Z(X )7 O V L
.
18 NO
.
9 时珍国医国药 2 (X )7 年第 8 1卷第 9 期
令药理药化令
柱前衍生反相高效液相色谱法
测定毛脉酸模根中氨基酸的含量
岳云飞 ’ , 王振月 2 ` , 王谦博 , , 李瑞明 , , 王宗权 2 , 王 晶
( 1
. 黑龙江省药品检验所 , 黑龙江 哈尔滨 15 (x刃 l ;
2
. 黑龙江中医药大学 , 黑龙江 哈尔滨 巧加 4 0 ;
3
. 天士力集团 · 现代中药研究所 , 天津 3《XM 02)
摘要 : 目的 采用柱前衍生法测定毛脉酸模根 中氛基酸的含童 。 方法 利用柱前衍生反相高效液相 色讲 ( uI, 一 Hp LC )法测
定毛脉酸模根中 16 种氛基酸 。 采用 iD km ac :l 色语柱 ;流动相 : A为 0 . 05 m o F L 乙酸钠溶液中含 l% N , N一二甲基甲跳胺 ,
B 为 乙睛一水 ( :1 1 ) ,梯度洗脱 ;流速 1 . 0 m F m in ;检测波长 3 60 n m ; 柱温 40 ℃ 。 结果 氨基酸的摩尔浓度与峰面积成良好
的线性关系 , ; 均在 0 . 卯9 以上 ; 16 种氛基酸的回收率为 94 . 7 % 一 1 12 . 9% 。 结论 该方法准确 、 重现性好 , 可用于毛脉酸
模根中氮基酸的含圣测定 。
关键词 : 毛脉酸模 ; 氛基酸 ; 高效液相色谱法
中图分类号 : 2R 84 . 2 文献标识码 : A 文章编号 : 10 8习8O5( 2X() 7 ) 09 一06 9孤
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勿飞挤。 gn nU俪 sr itr of 几刃甘 , aH ibr n 巧加 4 0 , hC `an ;3 . hC ines o Me idc al eC nt er , asT ly R& D lsn 泳“ et , 肠inj n
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毛脉酸模 R u xme 邵 en l i
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. 为萝科 ( oP ly o n a e e a e )酸模属
多年生宿根草本植物 ,广泛分布于黑龙江省大小兴安岭及张广才
岭等地区 ,是黑龙江省 、 吉林长白山地区的重要药用资源植物 。
以根人药 ,味甘 ,性寒 ,有清热解毒 、 凉血止血 、 通便利尿之功 , 民
间以治疗癣病或止血著称 [ ’ .zJ 。 化学成分研究表明 , 毛脉酸模根
中含有白黎芦醇 、 白票芦醇昔 、 大黄素 、大黄酚 、大黄素甲醚及酸
模素等多种化合物〔’ 一 ’ ] ,具有抗真菌 、 抗肿瘤 、镇咳祛痰 、平喘降
压 、抗病毒和抗氧化等作用 〔6 一 吕〕。 因此 ,毛脉酸模有重要的开发
价值。
氨基酸是植物中的重要有效成分 。 研究表明 , 氨基酸有抗心
血管 、衍生物有抗肿瘤等作用 [ ’ 〕。 近年来开始对人参 、 田七等植
物药中的氨基酸进行了研究 [ ’ 。〕 ,但对毛脉酸模中的氨基酸的分
收稿日期 : 2 (x沁拼一 ; 修订日期 : 20 7刁 5一 12
` 金项目 : 国家自然科学基金项 目 ( No . 302 70 15 6)
作者简介 :击云飞 ( 19 74 一 ) , 女 ( 汉族 ) , 黑龙江哈 尔滨人 , 现任黑龙 江省药
品检脸所刹主任药师 , 硕士学位 ,主要从事药物分析研究工作 .
. 通讯作者简介 : 王振月 ( 19 56 一 ) , 男 ( 汉族 ) , 黑龙江哈 尔滨人 , 现任黑龙
江 中医药大学教授 , 学士学位 ,主要从事中药研究与开发 、 生物技术 、新药
开发工作 .
析还未见报道过 。 本实验以 2 年生和 3 年生毛脉酸模为研究对
象 ,采用高效液相色谱法对毛脉酸模根中的氨基酸进行测定 , 以
期为毛脉酸模的开发利用提供理论依据 。
1 仪器与材料
A igl en 卜 1 0 高效液相色谱仪 , 色谱柱为 iD klna C . 。 ( 20
m m x 4
.
6 m m
,
5 卿 ) , M e td e r 电子天平 A E 24 0 ( 瑞士 ) , D IKM A微孔滤膜 ( 0 . 45 林m ) , z K一Z B 型真空干燥箱 (上海市实验仪器总
厂 ) 。
门冬氨酸 ( sA p ) 、 谷氨酸 ( lG u) 、 丝氨酸 ( eS r ) 、精氨酸 ( A gr ) 、
甘氨酸 ( G ly ) 、 苏氨酸 ( hT r ) 、脯氨酸 (而 ) 、 丙氨酸 ( Al a ) 、 撷氨酸
( v al )
、 蛋氨酸 ( M e t ) 、 胧氨酸 ( C y s ) 、 异亮氨酸 ( Ile ) 、 亮氨酸
(跳 u ) 、赖氨酸 ( L y s ) 、 酪氨酸 (介r ) 、 色氨酸 ( T叮 )购于 A g ile n t 公
司 ;甲醇 、乙睛为美国 iD km a 公司产品 ,色谱纯 ;水为自制重蒸水 ;
其余均为分析纯。 样品于 2X( 抖一 10 刁 1 采自黑龙江中医药大学药
用植物园 (所有样品均由黑龙江中医药大学药学院中药资源与
开发教研室王振月教授鉴定 ) 。
2 方法与结果
2
.
1 色谱条件 色谱柱为 iD km aC : : 柱 ; 流动相 : A : 0 . 05 m 。沙 L 乙
酸钠溶液中含 1% N , N 一二甲基甲酞胺 , B : 乙睛 一水 ( :1 1 ) ,流动相
梯度洗脱程序见表 l ;柱温 40 ℃ ; 流速 1 . 0 m l/ m in ;检测波长 360
n m ;进样量 :对照品溶液进样 20 闪 ;供试品溶液进样 50 闪。
·
2 0 6 9
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时珍国医国药 2 (X ) 7年第 8 1卷第 9期 lH SZ IH EN M ED I C IN N D E A MA I,E RI A M E D IC A R五S E A R CH ZX() 7 V O L . 18 N 0 . 9
衰 1 流动相梯度洗脱程序
时间叮而 n B ( % )
2
.
2 供试品洛液的制备 将采集后的样品置 40 ℃干燥后 ,粉碎
成粉末 (过 80 目筛 ) ,精密称取粉末 0 . 2 9 ,置索氏提取器中 , 以
5 0% 乙醉为溶剂回流 4 卜,提取液回收至干 ,残渣用水溶解 ,过滤 ,
滤渣和滤器用水洗涤 ,将滤液和洗液合并 , 用水定容至 10 耐 ,作
为供试品溶液。
2
.
3 供试品的衍生 取供试品 1 . 0 耐 ,加人 0 . 5 mo F L 碳酸钠缓
冲液 ( 以 0 . 5 mo F L 碳酸钠调 0 . 5 m o F L碳酸氢钠置 p H 为 9 . 0)
1
.
0 时 和 1% 的 2 , 4 一 二硝基氟苯的乙睛溶液 1 . 0 耐 ,摇匀 , 60 ℃
水浴暗处放置 60 im n ,取出冷却后 ,加人磷酸盐缓冲液 ( p H7 . 0)
10 耐 ,摇匀 , 过 0 . 4 5 卜m 的滤膜。
2
.
4 对照品洛液的制备 取 A ig len t 公司提供的对照品溶液 ,分
别制备成浓度为 25 , 10 , 250 , 50 , l以X) pm o F闪 的对照品溶
液 ,按 2 . 3 项下衍生后进样 20 闪 , 以峰面积为横坐标 , 浓度为纵
坐标作曲线 (见表 2 ) 。 样品和标准品的色谱图见图 1 。
2
.
5 精密度实脸 用氨基酸混合标准品溶液做 6 次平行实验 ,
结果 16 种氨基酸的月5刀均小于 5% 。 表明精密度良好 。
2
.
6 称定性实脸 取毛脉酸模根的粉末 0 . 2 9 1 份。 按 2 . 2 项 ,
2
.
3 项下制备供试品溶液 ,分别在 0 , 2 , 4 , 6 , 8 , 10 h 进样 ,结果 16
种氨基酸的 刀S D 均小于 5% 。 表明样品在 10 h 内稳定性良好 。
2
.
7 加样回收率实脸 采用单点和多点加人法将各氨基酸标
准品溶液定量加人样品溶液中 ,进行试验 ,结果各种氨基酸的回
收率为 94 . 7% 一 112 . 9% 。
2
.
8 样品洲定 按 2 . 2 , 2 . 3 项下制备供试品溶液 ,进样 50 闪。
16 种氨基酸含量测定结果见表 3 。 从表中可知 , 16 种氨基酸都
存在于毛脉酸模的样品中 ,精氨酸含量最高 ,而赖氨酸含量最低。
其余的氨基酸的含量都在 0 . 01 % 一 0 . 0 % 之间。 在 16 种氨基酸
中有 7 种是人体必需的氨基酸 ,其总量为 0 . 25 4 2% ,约占氨基酸
总量的 30 . 41 % 。
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0
.
0 1 1 8
0
.
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.
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.以 0 8
0
.
0 8 0 7
0
.
8 3 5 8
裹 2 16 种奴甚酸的标准曲线
氨基酸名称 标准曲线 相关系数 ;
A s P y 二 1
.
16 3 o x + 5
.
84 6 2 0
. 卯9 7
G lu y 二 1
.
5 54 4 x 一 13 . 7 5 6 0 . 9 9 1
eS r y 二 1
.
17 7 7 x + 0 7 3 9 8 0
.
9 9 9 9
A gr y 二 1
.
14 8 g x + 2
.
19 6 3 0
.
9 9 9
lG y 了二 1 . 1 89 o x 一 2 . 0 3 1 2 0 . 9 9 9
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r 了二 1 . 《义刃 g x + 10 . 9 9 1 0 . 9 9 7
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A la y 二 1
.
0 10 s x + 10
.
9 3 0
.
9 9 9 7
V al y 二 1
.
13 4 6 义 + 0
.
7 6 1 5 0
.
99 9
M e t y 二 1
.
38 3 s x + 3
.
2 3 6 6 0
.
9 99 9
Cy s y 二 0 . 6 90 3 x 一 1
.
5以 3 0 . 9 9 9 9
I le y 二 1
.
12 1 7 另 + 1 1
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8 18 0
.
9 9 7
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切 s y = 0 . 7 3 3 o x + 3 . 7 8 9 4 0 . 9 9 9 4
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T yr y 二 1
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2 4 7
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氨基酸名称 氨基酸含量 } 氨基酸名称 氨基酸含量
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` 人体必需氨基酸 ; 工 氨基酸总量 ; 艺 ’ 人体必需氛基酸总量
3 讨论
样品衍生时应严格控制衍生的时间 ,保证衍生时间的充足 ;
pH 值对衍生有重要的影响 ,衍生时也应严格控制衍生的 pH 值 ;
另外温度不可过低 ,否则将造成衍生不完全 。 本法流动相中含有
盐 ,应控制柱温 (最好为 40 ℃ ) ,柱温不可过低 , 过低将易导致流
动相中出现结晶 ,堵塞色谱柱 ,产生柱压过高等现象 。
氨基酸是植物中重要的有效成分 ,其中谷氨酸可促进人体内
消化液的分泌 ,具有预防贫血及解毒作用 ;精氨酸可控制体内细
胞的退化 ;胧氨酸是毛发的成分 ,具有促进毛发生长和防止皮肤
老化作用 ,也可用于抗过敏 、肝炎 、 白血球减少等症 ;苏氨酸在人
体内有转变氨基酸达到平衡的作用 。 正确地利用这些氨基酸 ,是
充分发挥毛脉酸模药用价值的重要因素之一 。
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圈 l 毛脉酸模样品 ( aj 和奴基酸混合标准溶液 ( b) 的 HLP C 图
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