全 文 ：

中国现代应用药学 2017 年 1 月第 34 卷第 1 期 Chin J Mod Appl Pharm, 2017 January, Vol.34 No.1 ·57·
土圞儿总生物碱的提取和纯化工艺研究

胡轶娟，梁卫青，张宏建，程林，浦锦宝(浙江省中医药研究院，杭州 310007)

摘要：目的 确定土圞儿中总生物碱最佳的提取、纯化条件，为其开发和利用提供科学的理论依据。方法 采用 L9(34)
正交试验，加酸水加热回流提取，考察溶剂用量、提取时间、提取次数 3 个因素对土圞儿中总生物碱得率的影响。结合
静态和动态吸附实验，分别比较了 6种不同型号的大孔树脂(D101，H-30，LSD-001，HPD450，DM130，AB-8)对土圞儿
总生物碱的吸附和解吸性能，并以吸附量、洗脱量为考察指标，对大孔树脂纯化总生物碱的条件进行了筛选。以盐酸小
檗碱为对照品，采用紫外分光光度法测定土圞儿总生物碱的含量。结果 土圞儿中总生物碱的最佳提取工艺条件为 15倍
量酸水加热回流提取 2次，每次 1 h。HPD450型树脂具有最佳的吸附及洗脱参数，其最佳纯化条件：上样液总生物碱浓
度为 1.6 mg·mL1，pH 8.0，先以 5倍柱体积的水洗去杂质，再以 4倍柱体积 40%乙醇洗脱，最后用 4倍柱体积 90%乙醇
洗脱，得总生物碱量是纯化前总生物碱量 80%左右。结论 该提取、纯化条件简单可行，具有良好的应用前景。
关键词：土圞儿；总生物碱；提取；纯化
中图分类号：R284.2 文献标志码：B 文章编号：1007-7693(2017)01-0057-05
DOI: 10.13748/j.cnki.issn1007-7693.2017.01.014

Study on Extraction and Purification of the Total Alkaloids from Apios Fortunei Maxim.

HU Yijuan, LIANG Weiqing, ZHANG Hongjian, CHENG Lin, PU Jinbao(Zhejiang Traditional Chinese Medicine
Academy, Hangzhou 310007, China)

ABSTRACT: OBJECTIVE To provide a theoretical basis for development and ulitization of the total alkaloids of Apios
fortunei Maxim. by optimizing the best extraction and purification process. METHODS The effects of the ratio of
solid-to-liquid, extraction time and extraction times on total alkaloid yield of Apios fortunei Maxim. were investigated by L9 (34)
orthogonal test. By the static and dynamic adsorption experiments, six types of macroporous adsorption resins(D101, H-30,
LSD-001, HPD450, DM130, AB-8) were evaluated to find the optimum one in purificating efficiency with measuring the
adsorption and eluting ratio of the total alkaloids as indexes and used berberine hydrochloride as a comparison to determine the
content of the total alkaloids of Apios fortunei Maxim.. RESULTS Ratio of solid-to-liquid was 1∶15, extracting twice and 1 h
every time were optimal. The HPD450 macroporous adsorption resin provided the optimal adsorption and elution parameters
through the comparison of 6 different types of macroporous resin. The best adsorption capacity was achieved with the following
condition: the concentration of extract liquid was 1.6 mg·mL1, pH 8.0，then the resin was washed by 5 BV water and 4 BV 40%
ethanol to remove impurity and alkaloids were desorbed by 4 BV 90% ethanol. The total alkaloid was 80% of it before
purifiction. CONCLUSION The process is simple, feasible and has a good prospect.
KEY WORDS: Apios fortunei Maxim.; total alkaloids; extraction; purification


基金项目：浙江省科技计划项目(2016C37053)
作者简介：胡轶娟，女，硕士，副研究员 Tel: (0571)88849079 E-mail: huyijuan604@163.com
土圞儿作为浙江地区常用中药，始载于《救
荒本草》，为豆科土圞儿属植物土圞儿 Apios
fortunei Maxim.的干燥块根，别名地栗子、土子、
土蛋、丸牛子，九子羊、黄皮狗卵，主要分布于
浙江、江西、福建、台湾、广东、广西、四川、
贵州等地[1]。土圞儿味甘，微苦，性平，具有清热
解毒，化痰止咳之功效，可用于感冒咳嗽，百日咳，
咽喉肿痛，疝气，痈肿，瘰疬[2]。
由于土圞儿为地方药材，到目前为止，对其
进行的研究并不多。在已见的报道中，主要对土
圞儿的原植物形态、药材性状、显微特征[3]进行研
究，而针对其化学成分的研究较少，《全国中草药
汇编》[2]中记载土圞儿块根的主要成分是“淀粉”。
笔者对其化学成分进行了初步研究，结果表明土
圞儿中含有生物碱类成分。前期药效学实验表明，
土圞儿总生物碱对人肺腺癌 A549 细胞、人肝癌
HepG2 细胞、人胰腺癌 BxPC-3 细胞、人恶性淋巴
瘤 Raji 细胞有较好的抑制作用，因此，有必要对
土圞儿总生物碱的提取纯化工艺进行研究。
目前，大孔树脂因为具有选择性好、吸附迅
速、绿色环保等优势，在天然产物的提取纯化方
面得到了广泛的应用[4-6]。


·58· Chin J Mod Appl Pharm, 2017 January, Vol.34 No.1 中国现代应用药学 2017 年 1 月第 34 卷第 1 期
本研究确定了土圞儿总生物碱的最佳提取、
纯化条件，为土圞儿中生物碱类成分的开发和利
用提供了科学的理论依据，同时为土圞儿的进一
步开发和利用提供了参考。
1 仪器与试剂
Cary 100 紫外可见分光光度计(美国 Varian)；
万分之一电子分析天平(德国 Sartorius)；TC-15 套
式恒温加热套(浙江新华医疗器械厂)；旋转蒸发仪
(瑞士 BUCHI)。
土圞儿购于浙江磐安新屋药材市场，经浙江
省中医药研究院浦锦宝研究员鉴定为豆科土圞儿
属植物土圞儿 Apios fortunei Maxim.的干燥块根；
盐酸小檗碱对照品(中国药品生物制品检定所，
110713-200609，供含量测定用)；AB-8 型大孔吸
附树脂 (天津市巴斯化工有限公司，批号：
20090119)；D101 型大孔吸附树脂(山东鲁抗医药
股份有限公司树脂分厂，批号：20110813)；HPD450
型大孔吸附树脂(河北沧州宝恩化工有限公司，批
号：20130722)；DM130 型大孔吸附树脂(河北沧
州宝恩化工有限公司，批号：20111008)；H-30 型
大孔吸附树脂(郑州艾诺化工科技有限公司，批号：
20101130)；LSD-001 型大孔吸附树脂(西安蓝晓科
技有限公司，批号：20091212)；磷酸(分析纯，杭
州高晶精细化工有限公司)；盐酸、硫酸、邻苯二
甲酸氢钾、溴甲酚绿均为分析纯，来自杭州高晶精
细化工有限公司；三氯甲烷(分析纯)、氢氧化钠均购
自南京化学试剂有限公司；水为蒸馏水。
2 土圞儿中总生物碱的提取工艺研究
2.1 不同酸水溶液对总生物提取的影响
取土圞儿饮片 40 g，3 份，分别加 pH 2.0 的
盐酸、硫酸、磷酸水溶液各 400 mL，加热回流提
取 2 次，每次 2 h，离心、除去沉淀，合并 2 次滤
液，用旋转蒸发仪真空浓缩并定容至 100 mL，测
定 3 份浓缩液中总生物碱的含量，结果见表 1。结
果表明，3 种酸水溶液的提取效果差别不大。因此
酸水溶液可以为硫酸、盐酸、磷酸的水溶液。
表 1 不同酸水溶液对土圞儿总生物碱提取的影响
Tab. 1 Effect of different extraction acid aqueous solution
of total alkaloid in Apios fortunei Maxim.
酸 总生物碱含量/mg·mL1
盐酸 4.45
硫酸 4.25
磷酸 4.59
2.2 不同 pH 值酸水溶液对土圞儿总生物碱提取
的影响
取土圞儿饮片 40 g，3 份，分别加 pH 值为 2.0，
3.0，4.0 的盐酸水溶液 400 mL，加热回流提取 2
次，每次 2 h，离心、除去沉淀，合并 2 次滤液，
用旋转蒸发仪真空浓缩并定容至 100 mL，测定浓
缩液中总生物碱的含量。结果表明，酸水溶液 pH
值为 2.0~4.0 的提取效果差别不大。因此，酸水溶
液的 pH 值可以为 2.0~4.0。
2.3 总生物碱的提取
选用 L9(34)斗正交试验设计表，以溶剂用量
(A)、提取时间(B)、提取次数(C)为影响因素，以
总生物碱含量为指标，优化提取工艺参数，从中
筛选最优的工艺条件和技术参数。提取方法是称
取 50 g 土圞儿饮片，按试验设计条件，加入 pH
值为 3.0 的盐酸水溶液，加热回流提取后趁热过
滤，提取液减压浓缩并定容至 100 mL，备用。各
因素水平见表 2。
表 2 正交因素表
Tab. 2 Orthogonal factor levels
水平
因素
A(溶剂用量)/倍 B(提取时间)/h C(提取次数)/次
1 10 1 1
2 15 2 2
3 20 3 3
2.4 对照品溶液的制备
精密称取盐酸小檗碱对照品适量，加三氯甲
烷制成每毫升含盐酸小檗碱 10 μg 的溶液。
2.5 标准曲线的制作
取对照品溶液 1.0，2.0，3.0，4.0，5.0 mL，
置分液漏斗中，加三氯甲烷至 10 mL，加入 pH 4.5
的邻苯二甲酸氢钾缓冲液 5.0 mL 和 0.04%溴甲酚
绿溶液 2.0 mL，剧烈振摇 5 min，然后静置 30 min，
取下层滤液 5 mL，加入 0.01%氢氧化钠乙醇溶液
1.0 mL，摇匀，立即按紫外-可见分光光度法(中国
药典 2015 年版四部通则 0401)，于 620 nm 处测定
吸光度，以浓度 C(μg·mL1)为横坐标，吸收度 A 为
纵坐标，绘制标准曲线。得回归方程：A=0.122 7C+
0.016 8，r=0.999 2，表明盐酸小檗碱浓度在 1.12~
5.60 μg·mL1内线性关系良好。
2.6 供试品溶液的测定
取提取液 20 mL，加 2%NaOH调节 pH至 11.0，
再用三氯甲烷 90 mL 分 3 次萃取，合并三氯甲烷


中国现代应用药学 2017 年 1 月第 34 卷第 1 期 Chin J Mod Appl Pharm, 2017 January, Vol.34 No.1 ·59·
液，回收溶剂，残渣加适量三氯甲烷溶解，并转
移至 100 mL 量瓶中，加三氯甲烷至刻度，摇匀，
精密吸取 1 mL，置 50 mL 量瓶中，加三氯甲烷稀
释至刻度，摇匀，精密吸取各供试品溶液 1 mL，
置分液漏斗中，按“2.5”项下方法操作，从标准
曲线上读出供试品溶液中盐酸小檗碱的量，计算
提取液中总生物碱的含量。结果见表 3~4。
表 3 正交试验结果
Tab. 3 Results of orthogonal test
编号
因素 评价指标
总生物碱含量/
mg·mL1 A B C
1 10 1 1 1 5.32
2 10 2 2 2 5.39
3 10 3 3 3 4.38
4 15 1 2 3 5.31
5 15 2 3 1 6.48
6 15 3 1 2 5.61
7 20 1 3 2 5.91
8 20 2 1 3 4.15
9 20 3 2 1 6.21
均值 1 5.030 5.513 5.027 6.003
均值 2 5.800 5.340 5.637 5.637
均值 3 5.423 5.400 5.590 4.613
极差 0.770 0.173 0.610 1.390
表 4 正交试验方差分析
Tab. 4 Analysis of variance of orthogonal test
因素 偏差平方和 自由度 F 值 显著性
A 0.889 2 19.326 P<0.05
B 0.046 2 1.000
C 0.692 2 15.043
误差 0.05 2
结果表明，溶剂用量对土圞儿中总生物碱得
率影响有显著性差异，影响提取效果的因素顺序
为 A>C>B，即溶剂用量>提取次数>提取时间，最
佳工艺为 A2B1C2。即加 15 倍量酸水溶液，加热回
流提取 2 次，每次 1 h。
3 土圞儿中总生物碱的纯化条件研究
3.1 静态吸附试验
3.1.1 静态吸附试验 称取各大孔吸附树脂
5 g(干重)，加入 20 mL 土圞儿提取液(含生物碱
32.05 mg)，常温下，摇床或者振摇器上振摇
12~24 h，使树脂充分吸附后过滤，吸取滤液 10 mL
测定生物碱含量，计算浸泡液中生物碱总浓度，
计算树脂的吸附能力。结果见表 5。
3.1.2 解吸率的测定 将上述静态吸附后的大孔
树脂滤出并吸干表面水分，分别置于具塞三角瓶
内，精密加入 50 mL70%乙醇，振荡器振荡
12~24 h。使土圞儿生物碱充分解吸附，过滤，分
别量取 10 mL 滤液，测定生物碱含量，计算滤液
中总生物碱浓度，计算解吸率。结果见表 5。
表 5 静态吸附试验结果
Tab. 5 Results of static adsorption experiments
编号 树脂类型 吸附量/mg 解吸附量/mg 解吸率/%
1 D101 20.37 12.48 61.27
2 DM130 16.67 13.10 78.58
3 AB-8 24.36 18.33 75.25
4 HPD450 25.95 22.52 86.78
5 LSD-001 21.40 16.96 79.25
6 H-30 26.48 21.17 79.95
结果表明，6 种大孔吸附树脂对土圞儿总生物
碱的吸附率依次为 H-30>HPD450>AB-8>LSD-001
>D101＞DM130，综合考虑解吸率，选择 HPD450
大孔吸附树脂纯化土圞儿总生物碱。
3.1.3 洗脱剂浓度对洗脱率的影响 确定大孔树
脂 HPD450，精密称取静态吸附后的再经过滤出并
吸干表面水分的大孔树脂 9 份，每份 5 g，分别置
于具塞三角瓶内，加入浓度为 10%，20%，30%，
40%，50%，60%，70%，80%和 90%乙醇溶液 50 mL
后，振荡器振荡 12~24 h，使土圞儿生物碱充分解
吸附，过滤，滤液量取 10 mL 浸饱液测定生物碱
含量，计算解吸率。结果显示，大孔吸附树脂静
态吸附试验结果表明：6 种树脂中最适合对土圞儿
总生物碱纯化的为 HPD450 树脂，以 pH 8.0 提取
液上样，其吸附率较快，且总生物碱的饱和吸附
量达 4.52 mg·g1，最佳洗脱溶剂为 90%乙醇，结
果见表 6。
表 6 不同浓度洗脱剂对生物碱纯化的影响
Tab. 6 Effects of different concentration of elution on the
purification of alkaloids
乙醇浓度/% 洗脱率/%
10 0
20 0
30 0
40 3.30
50 18.50
60 45.70
70 65.42
80 79.85
90 88.37


·60· Chin J Mod Appl Pharm, 2017 January, Vol.34 No.1 中国现代应用药学 2017 年 1 月第 34 卷第 1 期
3.1.4 pH 对大孔树脂吸附量的影响 精密称取已
经处理好的干大孔吸附树脂若干份，每份 5 g，分
别置于具塞磨口三角瓶内，精密加入 pH 为 4.0，
5.0，6.0，7.0，8.0，9.0，10.0 和 11.0 的样品液各
20 mL 后，常温下，摇床上振摇 12~24 h，过滤，
分别测定总生物碱浓度，计算饱和吸附量。结果
见表 7。
表 7 不同 pH 值对生物碱纯化的影响
Tab. 7 Effects of different pH values on the purification of
alkaloids
pH 值 吸附量/mg
4.0 20.56
5.0 21.07
6.0 21.49
7.0 22.15
8.0 22.62
9.0 22.37
10.0 22.15
11.0 21.83
3.2 动态吸附-洗脱试验
3.2.1 上柱液浓度对大孔树脂动态吸附土圞儿总
生物碱的影响 分别称取已经处理好的大孔树脂
20 g，湿法装柱，柱体积为 30 mL，柱留体积为
9.5 mL，加入不同浓度的生物碱样品液(总生物碱
为 104.20 mg)，流速 2 mL·min1，过柱完成后，分
别收集各自的过柱液，测其中总生物碱的残留量。
结果表明，浓度在 1.60 mg·mL1 时吸附量最大，
故确定上柱液浓度为 1.60 mg·mL1，见表 8。
表 8 上柱液浓度对大孔树脂动态吸附土圞儿总生物碱的
影响
Tab. 8 Effect of sample concentration on the total alkaloids
dynamic adsorption
上柱液中生物碱浓度/mg·mL1 吸附量/mg
0.80 80.44
1.60 86.60
3.21 84.95
6.42 82.43
3.2.2 冲洗杂质溶剂用量对大孔树脂动态吸附土
圞儿总生物碱的影响 称取已经处理好的大孔树
脂 20 g，湿法装柱，加入取土圞儿提取液
(1.60 mg·mL1)45 mL(最大吸附量的 80%)，以流速
2 mL·min1 过柱，分别用水和 40%乙醇进行洗脱，
至洗脱液呈浅黄透明基本无变化，每份 1 BV 收集
洗脱液，测定洗脱液中生物碱的含量。结果显示，
水洗后生物碱损失率为 0.82%，用 40%乙醇洗脱
后，生物碱损失率为 3%，用 5 BV 水和 4 BV 40%
乙醇可有效的去除极性较大的杂质，而生物碱的
损失率较低，可提高总生物碱纯度。因此确定样
品溶液上柱后采用 5 BV 水和 4 BV 40%乙醇进行
除杂。结果见表 9。
表 9 冲洗杂质溶剂用量对大孔树脂动态吸附土圞儿总生
物碱的影响
Tab. 9 Effects of the amount of solvent consumption to
remove impurity on the total alkaloids dynamic adsorption
编号 洗脱剂类型 洗脱液中生物碱含量/mg
1 水 0.59
2 水 0
3 水 0
4 水 0
5 水 0
6 40%乙醇 1.47
7 40%乙醇 0.61
8 40%乙醇 0.08
9 40%乙醇 0
3.2.3 洗脱剂用量对大孔树脂动态吸附土圞儿总
生物碱收率的影响 称取已经处理好的大孔树脂
20 g，湿法装柱，加入生物碱样品液，以流速
2 mL·min1 过柱，收过柱液，测其中总生物碱的含
量，得柱中生物碱含量为 88.20 mg，过柱完后分
别用 5 BV 水和 4 BV 40%乙醇进行洗脱，再用 90%
乙醇溶液洗脱，共 5 BV，按 1 BV 收集洗脱液，
洗测定洗脱液中生物碱含量。结果显示，总生物
碱洗脱量主要集中在 4 BV 内，占总生物碱量的
83.70%。因此确定 90%乙醇用量为 4 BV。结果见
表 10。
表 10 洗脱剂用量对大孔树脂动态吸附土圞儿总生物碱
收率的影响
Tab. 10 Effects of the elution volume on the total alkaloids
dynamic adsorption
编号 总生物碱含量/mg 占总量百分比/%
1 38.53 44.02
2 21.07 23.89
3 12.12 13.74
4 1.81 2.05
5 0.49 0.67


中国现代应用药学 2017 年 1 月第 34 卷第 1 期 Chin J Mod Appl Pharm, 2017 January, Vol.34 No.1 ·61·
4 讨论
本研究对酸水的 pH 进行了初步考察，比较了
pH 为 1.0，3.0，5.0 和不加酸的水对提取效果的影
响，结果表明，pH 值为 1.0 和 3.0 时提取效果较
好，且相差不大，考虑到 pH 值为 1.0 酸度较大，
会增加后期 pH 调节剂的用量，故将酸水的 pH 值
暂定为 3.0，并对 pH 值为 2.0，3.0，4.0 时的提取
效果的影响进行了考察。
本研究曾对酸水加热回流提取和超声提取进
行比较，结果表明，加热回流提取的提取效率高
于超声提取。且实验过程中发现土圞儿含较多的
淀粉，如粉碎后提取加热后淀粉糊化会影响提取
效果，故采用饮片投料。土圞儿中总生物碱的最
佳提取工艺条件为用 15 倍量 pH 值为 3.0 的盐酸
水溶液加热回流提取 2 次，每次 1 h。通过对正交
试验结果进行极差、方差分析，溶剂用量对土圞
儿中总生物碱的得率有显著的影响，其次为提取
次数和提取时间。
本研究曾采用酸水提取后碱化再用有机溶剂
萃取的方法进行纯化，结果发现生物碱纯化的效
果较差，得率也低。故采用大孔吸附树脂进行纯化。
通过对 6 种大孔吸附树脂的静态吸附研究，
发现 HPD450 型大孔吸附树脂是一种比较理想的
树脂，吸附量大，解吸率高，较适合土圞儿中总
生物碱的分离纯化，具有操作简便、重复性好、
消耗少等优点，具有较好的推广应用前景。
土圞儿中总生物碱的纯化工艺选用 HPD450
大孔吸附树脂，上柱药液浓度为 1.6 mg·mL1，调
药液 pH 值为 8.0，洗脱流量为 2 mL·min1，以蒸
馏水洗脱 5 BV 后，用 4 BV 40%乙醇洗脱，再用 4
BV 90%乙醇洗脱，收集洗脱液，减压回收乙醇即
得，得总生物碱量是纯化前总生物碱量 80%左右。
本研究尚未对土圞儿总生物碱的具体成分进
行分析，因此暂以盐酸小檗碱为对照品进行含量
测定，在今后的工作中将进一步开展土圞儿生物
碱的成分及抗肿瘤机制研究。
REFERENCES
[1] 中国科学院中国植物志编辑委员会. 中国植物志第 41 卷
[M]. 1995: 200-201.
[2] 全国中草药汇编编写组. 全国中草药汇编[M]. 第 2 版. 北
京：人民卫生出版社, 1994: 47.
[3] LI S F, ZHU X F. Identifying Tetrastigma hemsleyani and
Apios fortunei Maxim [J]. Chin J Ethnomed Ethnopharm(中国
民族民间医药杂志), 1998, 7(40): 47.
[4] WANG Y, XU J, XIU L L, et al. Determination of three kinds
of flavonoids in Scutellaria baicalensis purified by
macroporous absorption resin [J]. Chin J Mod Appl Pharm(中
国现代应用药学), 2013, 30(10): 1107-1110.
[5] FAN R Q, JIN X Y, HU R, et al. Study on separation and
purification of syringin, aleutheroside E and isofraxidin from
Acanthopanax Senticosus by macroporous resin [J]. Chin J
Mod Appl Pharm(中国现代应用药学), 2014, 31(3): 302-307.
[6] REN H M, SHENG P. Enrichment and purification of total
alkaloids in Fritillariae Pallidiflorae Bulbus with macroporous
adsorption resins [J]. Chin J Mod Appl Pharm(中国现代应用
药学), 2016, 33(6): 695-699
收稿日期：2016-06-09