全 文 ：收稿日期:2007-06-02;　修订日期:2007-10-17
基金项目:江苏省中医药管理局课题(No.H05027)
作者简介:邱召娟 (1966-),女(汉族),山东青岛人 ,现任南京中医药大学
附属医院副主任药师 ,学士学位 ,主要从事临床药理 、临床药学研究工作.
银荆感冒颗粒抗乙型流感病毒的药效学研究
邱召娟 , 朱萱萱 , 倪文澎 , 严士海 , 朱　琼
(南京中医药大学附属医院 ,江苏 南京　210029)
摘要:目的 研究银荆感冒颗粒对乙型流感病毒(B/京防 98-96)的抑制作用。方法 体外接种乙型流感病毒鼠肺适应株
于狗肾细胞(MDCK), 观察银荆感冒颗粒体外抗病毒作用;体内实验①以乙型流感病毒鼠肺适应株滴鼻感染小鼠 ,观察
14 d,计算小鼠存活率及存活天数;体内实验②以乙型流感病毒鼠肺适应株滴鼻感染小鼠 , 观察肺指数 。结果 银荆感冒
颗粒体外抗乙型流感病毒 EC50为 3.68 mg/ml。银荆感冒颗粒 10 g/kg和 20g/kg剂量组可明显延长乙型流感病毒感染小
鼠存活天数 , 降低死亡率;银荆感冒颗粒 20 g/kg剂量组可明显抑制肺指数值 ,抑制率为 36.7%。结论 银荆感冒颗粒对
乙型流感病毒有一定的抑制作用。
关键词:银荆感冒颗粒;　乙型流感病毒;　体内外;　抑制
中图分类号:R285.5　　文献标识码:A　　文章编号:1008-0805(2008)04-0838-02
EffectofYinjingganmaoGranuleonInfluenzaBVirus
QIUZhao-juan, ZHUXuan-xuan, NIWen-peng, YANShi-hai, ZHUQiong
(AfiliatedHospitalofNanjingTCMUniversity, Nanjing, Jiangsu210029, China)
Abstract:ObjectiveToinvestigatetheinhibitoryefectofYinjingganmaogranuleonInfluenzaBVirus.MethodsTheinhibi-
torycytopathiceffects(CPE)ofYinjingganmaogranulewereobservedbyMDCKcellculture.Theexperimentinvivoweredoneby
thefollowingtwomethods:(1)ThemiceweregivenYinjingganmaogranulefor7 daysand30μlInfluenzaBVirusbynoseatse-
quentiluce.Wecalculatedthesurvivalrateanddaysofmice14dayslater.(2)ThemiceweregivenintragastricalyYinjinggan-
maogranulefor7daysand30μlInfluenzaBVirusbynoseatsequentiluce.Wecalculatedthelungindexandobservedthepath-
ologicalchange.ResultsTheEC50 ofYinjingganmaogranuleonInfluenzaBViruswas3.68mg/ml.The10g/kgand20 g/kggroupsofYinjingganmaogranulecouldprolongthesurvivaldaysandreducethedeathratesignificantly.The10g/kgand20 g/kg
groupsofYinjingganmaogranulecouldinhibitthelungindexoftheinfectedmiceandtheinhibitionratiowas31.4and29.1% re-
spectively.Inaddition, itcouldalsolessenthepathologicalchange.Conclusion:Yinjingganmaogranulehasinhibitoryefecton
InfluenzaBVirus.
KeywordsYinjingganmaogranule;　InfluenzaBVirus;　Invivoandvitro;　Inhibition
　　流行性感冒是上呼吸道传染性极强的病毒感染性疾病 ,在呼
吸系统中发病率占首位 , 可引起许多并发症 , 重者可引起死亡。
我们运用现代工艺 , 选用古方银翘散结合临床化裁而制成银荆感
冒颗粒 ,作为本院院内制剂 , 在临床上取得了良好疗效。为了探
索该颗粒剂治疗流行性感冒的机制 ,我们选择与呼吸道有关的乙
型流感病毒 , 以该病毒感染小鼠为药物评价模型 , 通过感染小鼠
存活率 、存活天数 、肺指数值与肺病理变化为指标来评价药效 ,同
时结合体外实验 , 来观察银荆感冒颗粒对乙型流感病毒引起的细
胞病变的作用。
1　材料与仪器
1.1　药物及试剂 银荆感冒颗粒 ,江苏省中医院药剂科提供 ,批
号 050424;利巴韦林注射液 , 四川美大康药业股份有限公司 , 批
号 050316;RPMIMedium1640, GIBCO公司;胰蛋白酶 ,上海伯奥
生物技术有限公司 , 批号 020602;HEPES, 江苏科威技术服务有
限公司 , 批号 H3375;磷酸氢二钠 ,南京化学试剂厂 , 批号 051207;
磷酸二氢钾 , 广西西陇化工厂 , 批号 041119;碳酸氢钠 , 上海虹光
化工厂 , 批号 050622;新生牛血清 , 杭州四季青生物工程材料有
限公司 , 批号 050827;青霉素 ,山东鲁抗医药股份有限公司 , 批号
8040613;链霉素 , 大连美罗大药厂 , 批号 040707;乙醚 , 南京试剂
厂 , 批号 050628。
1.2　仪器 CO2培养箱(BB16), Beracus公司;倒置显微镜(XSZ-D2), 重庆光学仪器厂;微孔滤器 , 上海医药工业研究院;细胞
培养板 , 丹麦 NUNC公司;净化工作台(SW-CJ-IF)苏州安泰空
气技术有限公司;FA1004型电子分析天平 ,上海精科天平厂。
1.3　病毒株及细胞株 乙型流感病毒 B/京防 98-96, 购自中国
预防医学科学院病毒所 ,由江苏省中医院临床研究所药理实验室
传代后 -70℃低温冰箱保存备用;狗肾细胞(MDCK), 购自上海
细胞所 。
1.4　动物 ICR小鼠 , ♀♂兼用 ,体重 16 ～ 24 g, 由南京青龙山动
物饲养厂提供 ,合格证号:SCZK(苏)2001-0018。
2　方法
2.1　银荆感冒颗粒体外对乙型流感病毒的作用
2.1.1　 MDCK细胞培养 新购置的 MDCK细胞 ,用 0.25%的胰
酶消化 ,然后加入含血清培养液适量 , 轻轻吹打均匀 , 按 1∶3比
例进行分瓶传代。实验前则接细胞于 96孔培养板中 , 培养 24 h
后 , 用于实验。
2.1.2　病毒毒力测定 将冻存的病毒液快速冻融后 ,按 10倍稀释
法稀释成 10-1 ～ 10-9的不同稀释液 , 接种到 MDCK细胞培养板
中 , 每个浓度 4个孔 ,每孔接种 150 μl病毒液, 于 5%CO2 , 37℃静
置培养 ,同时设正常细胞对照 , 4个复孔 ,观察细胞病变情况 , 以
CPE不再进展时 , 按 Reed-Muench氏法 [ 1]计算病毒滴度 ,即该病
毒的 TCID50。 CPE程度:-, 无细胞病变;+, 25%细胞病变;++,
50%细胞病变;+++, 75%细胞病变;++++, 100%细胞病变。
2.1.3　银荆感冒颗粒最大无毒浓度实验 银荆感冒颗粒(浸
膏),每毫升相当于 4.9 g药材 , 首先将原浸膏稀释成 1 g/ml, 再
用完全培养液稀释成 100 mg/ml,最后用完全培养液将其分别稀
释成 80, 40, 20, 10, 5, 2.5 mg/ml的不同浓度加入长成单层 MDCK
细胞的 96孔培养板中 ,每个浓度 4个复孔 ,每孔 150μl同时设立
正常细胞对照组 ,置培养箱中培养 , 观察细胞的生长情况 ,观察病
变情况 ,以不出现细胞变暗 、变圆 、融合 、脱落等病变的最大药物
浓度为该药物的无毒性浓度。
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时珍国医国药 2008年第 19卷第 4期 LISHIZHENMEDICINEANDMATERIAMEDICARESEARCH2008VOL.19NO.4　
2.1.4　银荆感冒颗粒 TC50测定 根据最大无毒浓度实验结果 ,将
银荆感冒颗粒稀释成不同浓度 , 加入长成单层 MDCK细胞的 96
孔板 , 每个浓度 4个复孔 , 150 μl/孔 , 同时设立正常的细胞对照
组 , 置培养箱中培养 , 观察细胞的生长情况 ,观察病变情况 , 采用
孙氏综合法 [ 2]计算该药物对细胞的 TC50[ 2] 。 CPE程度:-, 无细
胞病变;+, 25%细胞病变;++, 50%细胞病变;+++, 75%细
胞病变;++++, 100%细胞病变。
2.1.5　银荆感冒颗粒对乙型流感病毒的作用 已长成单层的细
胞接种剂量为 10 TCID50的病毒 ,置 37℃, 5%CO2温箱孵育 2 h,
弃去含病毒维持液 , 更换含不同浓度药物的维持液 , 置培养箱内
培养。每天观察细胞形态 , 连续观察 3 d, 记录 CPE程度 , 同时设
立正常细胞对照组 、病毒对照组各四孔 , 采用孙氏综合法计算药
物半数有效浓度(EC50)和治疗指数(TI)。 治疗指数(TI)=TC50 /EC50。 CPE程度:-, 无细胞病变;+, 25%细胞病变;++,
50%细胞病变;+++, 75%细胞病变;++++, 100%细胞
病变。
2.2　银荆感冒颗粒体内对乙型流感病毒的作用
2.2.1　病毒感染小鼠半数致死量(LD
50
)测定 方法见参考
文献 [ 1] 。
2.2.2　银荆感冒颗粒对乙型流感病毒感染小鼠死亡的保护作用
取 ICR小鼠 120只 ,体重 13 ～ 16 g, ♀♂各半 , 随机分 6组 ,每组 20
只:①空白对照组, 等量生理盐水;②模型组 , 等量生理盐水;③利
巴韦林组 , 75mg/kg;④银荆感冒颗粒Ⅰ组, 5 g/kg;⑤银荆感冒颗粒
Ⅱ组 , 10g/kg;⑥银荆感冒颗粒Ⅲ组 , 20 g/kg。以上各组均灌胃给
药 ,给药容量 10ml/kg, 1次 /d×5d。于给药第 2天各小鼠(除空
白对照组外)在乙醚麻醉下 ,以血凝试验 640以上的尿囊液给小鼠
滴鼻感染 ,每鼠 30μl(20个 LD50致死量)观察感染后发病及死亡
情况 ,每日记录动物的死亡情况, 连续 2周。
2.2.3　银荆感冒颗粒对乙型流感病毒感染小鼠肺指数 取 ICR
小鼠 60只 ,体重 13 ～ 16 g, ♀♂各半 , 随机分 6组 , 每组 10只:①
正常组 , 等量生理盐水;②病毒对照组 ,等量生理盐水;③利巴韦
林组 , 75mg/kg;④银荆感冒颗粒Ⅰ组 , 5 g/kg;⑤银荆感冒颗粒Ⅱ
组 , 10 g/kg;⑥银荆感冒颗粒Ⅲ组 , 20g/kg;以上各组动物均灌胃
给药 , 灌胃容量 10 ml/kg, 1次 /d×5 d。于给药第 2天各组动物
(除空白对照组外)在乙醚麻醉下 , 用增毒 3次尿囊液滴鼻感染
小鼠 , 每鼠 30 μl(20个 LD50致死量), 实验前禁食不禁水 ,末次给
药后 , 实验当日各组小鼠称重 ,脱颈椎处死取全肺称重 ,计算各鼠
肺指数及肺指数抑制率 , 比较各组间差异。肺指数(%)=小鼠
肺重(g)/小鼠体重(g)×100%;肺指数抑制率(%)=对照组平
均肺指数 -实验组平均肺指数 /对照组平均肺指数 ×100%。
2.3　统计方法 数据处理运用 SPSS13.0软件完成 , 组间比较采
用单因素方差分析。
3　结果
3.1　银荆感冒颗粒体外对乙型流感病毒的作用
3.1.1　病毒毒力测定结果 为了解乙型流感病毒在 MDCK细胞
中的毒力情况 , 确定体外抗病毒药效学实验中病毒的攻击量。
根据所得数据 , 采用 Reed-Muench法计算 TCID50为 10 -3.67。
3.1.2　银荆感冒颗粒毒性实验测定结果 为了解银荆感冒颗粒
在 MDCK细胞中的毒性作用 , 确定实验中药物剂量 , 。根据所得
数据 , 银荆感冒颗粒最大无毒浓度为 20 mg/ml;采用孙氏综合法
计算 TC50为 26.94mg/ml。
3.1.3　银荆感冒颗粒体外对乙型流感病毒作用 有良好的抑制
作用 , 其 EC
50
为 3.68 mg/ml。 TI为 8.31。
3.2　银荆感冒颗粒体内对乙型流感病毒的作用
3.2.1　病毒感染小鼠半数致死量(LD
50
)测定 为了了解乙型流
感病毒感染小鼠的死亡情况 ,确定体内实验乙型流感病毒感染小
鼠的量 。按孙氏综合法计算 LD50是 10-2.23。
3.2.2　银荆感冒颗粒对乙型流感病毒感染小鼠死亡的保护作用
结果见表 1。
表 1　银荆感冒颗粒对乙型流感病毒感染小鼠死亡的保护作用( x±s)
组别 剂量C/g· kg-1
死亡数
/只
死亡率
(%)
保护率
(%)
存活时间
t/d
空白对照 等量 NS 0 0 100 1
模型对照 等量 NS 18 85.7■■ 　14.3■■ 6.4±3.4
利巴韦林 0.075 7 33.3＊＊ 　66.7＊＊ 11.3±3.8＊＊
银荆感冒颗粒Ⅰ 5 15 71.4 　28.6 8.4±3.9
银荆感冒颗粒Ⅱ 10 10 47.6＊ 　52.4 9.95±4.3＊
银荆感冒颗粒Ⅲ 20 10 47.6＊ 　52.4 10.2±4.1＊
　　与模型组比较 , ＊P<0.05, ＊＊P<0.01;与空白对照组比较 , n=20
实验结果提示:银荆感冒颗粒 10 g/kg和 20 g/kg剂量组可
明显减少乙型流感病毒感染小鼠的死亡率 , 并可延长存活天数 ,
与模型组比较具有显著性差异 ,提示银荆感冒颗粒具有抗乙型流
感病毒的作用。
3.2.3　银荆感冒颗粒对乙型流感病毒感染小鼠肺指数的影响
结果见表 2。
表 2　银荆感冒颗粒对乙型流感病毒感染小鼠肺指数的影响
组别 剂量 C/g· kg-1 肺指数 抑制率(%)
模型对照 等量 NS 0.193 9±0.071 4■■
利巴韦林 0.075 0.118±0.049＊＊ 39.4
银荆感冒颗粒Ⅰ 5 0.164±0.086 15.7
银荆感冒颗粒Ⅱ 10 0.155 9±0.069 1 19.6
银荆感冒颗粒Ⅲ 20 0.123±0.071＊ 36.7
正常 等量 NS 0.094 8±0.008 8
　　与模型组比较 , ＊P<0.05, ＊＊P<0.01;与正常组比较 , n=10
实验结果提示:银荆感冒颗粒 20 g/kg剂量组对乙型流感感
染小鼠肺指数抑制率为 36.7%, 与模型比较具有显著性差异。
提示:银荆感冒颗粒可减轻乙型流感病毒对肺部的感染 , 具有抗
乙型流感病毒的作用。
4　讨论
流行性感冒由流感病毒引起 , 目前 , 国际上防治流感的方法
是接种减毒活疫苗和使用化学药物治疗 ,但由于流感病毒容易发
生抗原变异 , 使疫苗保护作用效果受到一定限制 , 而使用的化学
药物又有较大的不良反应 ,因此到目前为止还没有有效防治流感
的方法 [ 3] 。中医认为流行性感冒是外感六淫 , 时行病毒所致。
以风为主因 ,风为六淫之首 , 但在不同季节 ,往往与其它当令之时
气相合而伤人。一般以风热为多见 , 银荆感冒颗粒由金银花 、连
翘 、荆芥 、板蓝根 , 防风和薄荷组成 , 是银翘散结合临床经验化裁
而成 , 方中金银花味甘 , 性寒 , 连翘味苦 , 性微寒 , 甘苦相合为君
药 , 既有辛凉透邪清热之效 , 又有芳香辟秽解毒之功;荆芥味辛 ,
性温 , 助君药辛开皮毛而散邪 , 板蓝根苦寒助君药清热解毒 ,共为
臣药;防风 、薄荷加强辛散泄热。对风热感冒发热 、咽痛 、周身酸
痛 、咳嗽等症有良好的治疗作用。我们通过体内外实验初步证实
了银荆感冒颗粒确有抗乙型流感病毒的作用。
参考文献:
[ 1 ] 　杜　平.医用实验病毒学 [ M] .北京:人民军医出版社 , 1985:
80, 107.
[ 2 ] 　陈　奇.中药药理研究方法学 [ M] .北京:人民卫生出版社 ,
2006:113.
[ 3 ] 　Luscher-MattliM.Influenzachemotherapy:areviewofthepresent
stateofartandofnewdrugsindevelopment[ J].ArchVirol, 2000,
145:2233.
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LISHIZHENMEDICINEANDMATERIAMEDICARESEARCH 2008VOL.19NO.4 时珍国医国药 2008年第 19卷第 4期